叶国柳 杜丹丽 靳丽杰 王玲玲
（蚌埠医学院第一附属医院 妇产科 安徽 蚌埠 233004）
【摘要】 目的：本研究组通过监测Wnt-1、β-catenin在子宫内膜损伤修复中表达变化情况，探讨Wnt信号途径在子宫内膜干细胞增殖分化中的重要作用。方法：通过建立了体外观察子宫内膜干细胞的模型，采用蛋白印迹及免疫组化方法检测大鼠子宫内膜损伤修复中Wnt-1、β-catenin基因的表达变化情况 结果：蛋白定量及免疫组织化学结果均显示：正常及损伤后12 h子宫干极少量表达Wnt-1及β-catenin，损伤后18h Wnt-1及β-catenin表达最强，其后随时间延长，Wnt-1及β-catenin表达逐渐减少。结论： Wnt-1在子宫干细胞早期增殖分化中起重要调控作用，而β-catenin在子宫损伤后的组织修复过程中对子宫干细胞的增殖分化发挥了一定的作用。
【关键词】 Wnt/β-catenin；子宫内膜干细胞；损伤修复
【中图分类号】R711.74 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）03-0060-03
1.引言
信号转导是生物学研究的前沿领域，近年的研究表明，从水螅、昆虫到脊椎动物的不同种族个体，都存在一个极其保守的信号转导途径，它的信号分子是Wnt蛋白家族成员，故称为“Wnt信号转导途径”[1]。Wnt信号途径调节控制着许多生命过程，包括生物体的生长、发育、疾病、衰老与死亡等。同时Wnt信号途径也与肿瘤的发生密切相关，有十几种目前已知的高发性癌变源于Wnt信号转导途径的失调[2]。根据Wnt蛋白转导信号的方式，学者们将Wnt信号转导途径分为经典Wnt信号途径（canonical Wnt signal pathway）和非经典的Wnt信号途径（noncanonical Wnt signal pathway）[3]。
在子宫内膜损伤修复过程中，涉及不同的分子信号级联，控制干细胞的迁移、增生及分化。然而目前国内外尚无此方面的报导。 Wnt蛋白是控制细胞生长、增殖的关键分泌信号分子，可传递细胞间相互调控信息。近年来研究证实，干细胞和细胞外基质的互相作用需要Wnt信号途径的参与。Wnt通过阻止β-catenin的分解，激活转录因子Tcf/Lef的表达，促进干细胞的增殖与分化[4]。Wnt信号转导的关键是胞浆中是否存在结构稳定的可溶性β-Catenin。β-Catenin在细胞中具有双重作用，即参与细胞间黏附与Wnt信号传导，其C末端参与信号传导，而N末端参与细胞黏附[5-6]。β-Catenin是Wnt信号通路中最为重要的信号分子。当无Wnt信号时，在支架蛋白Axin的协助下，β-Catenin与GSK-3β、APC形成复合物，GSK-3β对APC的磷酸化有助于APC与β-Catenin的结合，GSK-3β对β-Catenin氨基端丝/苏氨酸的磷酸化则是启动泛素系统降解β-Catenin的起使信号。当Wnt蛋白表达较高时，GSK-3β不能使APC磷酸化，β-Catenin就不能降解，在细胞内大量累积并进入核内，从而启动靶基因的表达[7]。
2.材料与方法
2.1 材料
10-14周龄Wistar雌鼠(220-250g，中国医科大学实验动物中心提供，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准)20只；40 mg/kg 戊巴比妥(Sigma)；SP 免疫组织化学超敏试剂盒、DAB显色剂、多聚赖氨酸（上海生工）；辣根过氧化物酶标记二抗（1:2000稀释），羊抗鼠单克隆抗体 Wnt-1（1:100稀释），兔抗鼠单克隆抗体β- Catenin（1:200稀释，碧云天）； PVDF 膜（Takara）
2.2 方法
2.2.1子宫损伤模型及分组 子宫内膜损伤模型建立[8]：将20只雌鼠随机分两组，每组各10只。实验组：取实验鼠按100 mg/kg 戊巴比妥钠麻醉,置于37℃ 恒温台上。在无菌手术条件下切开腹壁、进入腹腔,缓慢挑出Y型子宫一侧( 取右侧) 近两子宫汇合处，穿刺法置入直径1mm 宫腔导管(用12号静脉留置针替代宫腔导管)，在宫腔内行走2cm 穿出宫壁。切口创面覆盖湿纱。用微注泵分别给予预温80℃的生理盐水40ml热损失80s。热水入宫腔前经微型温度计点测温, 完全经过宫腔导管后拔出导管。子宫周围滴注温生理盐水保持湿润;复位子宫, 关腹。做好记号, 待其麻醉醒后, 按周期一致性原则，5只一笼，室温21～22℃，湿度67%～75%，光照明暗时间比为14h/10h，自由获取食物及水。对照组：采用正常大鼠体温的水进行过泵处理，其余培养条件及取材时间同实验组。
2.2.2 HE染色 正常生长的大鼠在24h与‘热球’处理大鼠后12h，18h，24h及48h处死大鼠，剖腹切取子宫内膜组织，投入预先配好的固定液中(10％福尔马林)使组织、细胞的蛋白质变性凝固，从而保持细胞本来的形态结构；再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明；将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋；将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片。
2.2.3蛋白印迹法检测子宫内膜Wnt-1及β-Catenin的表达12h，18h，24h及48h处死的‘热球’处理的大鼠子宫黏膜干组织各0.1g，加大约5倍湿重的裂解缓冲液（50mmol/L Tris.HCl pH7.4，150mmol/L NaCl，0.1%SDS，1%Triton-100，1mmol/L EDTA，aprotinin 2 mg/L，PMSF 100 mg/L），粉碎匀浆后，4℃静置24h，低温高速离心（4℃，10000 r/min，30 min），保留上清。采用Folin-酚试剂法进行蛋白定量。
2.2.3免疫组织化学染色检测子宫内膜Wnt-1及β-Catenin的表达 在24h的时候取正常鼠子宫内膜，以及在12h，18h，24h及48h处死的‘热球’处理的大鼠子宫内膜石蜡切片；结果判定标准：Wnt-1阳性细胞膜、浆呈棕黄色颗粒，不着色为阴性；β-Catenin阳性细胞膜、浆、核呈棕黄色颗粒，不着色为阴性。
2.2.4统计学分析 使用SPSS19.0软件进行统计分析，Western blotting 灰度值利用ANOVA法中的多重比较判断组间差异（设定P< 0.05）
3.结果
3.1 HE染色结果
‘热球’处理的大鼠子宫内膜干细胞12h后绝大部分脱落，暴露出基底膜，仅剩余少数较分散的间隔分布的近于裸核的子宫内膜干细胞，呈钉状位于基底膜上。‘热球’处理的子宫内膜基底膜上18h后可见少量扁平样细胞。24h后基底膜上细胞数目增加，并逐渐分化呈立方状，连接成片。48h后子宫内膜干中出现假复层柱状干，并可见纤毛细胞(图1)。
3.2Wnt-1免疫组织化学检测结果
未经“热球”处理正常胞浆中仅见极少量Wnt-1蛋白在细胞膜呈阳性表达； “热球”处理12小时后，子宫内膜干Wnt-1开始出现表达。“热球”处理后18小时，细胞数目逐渐增多，大部分为扁平状，Wnt-1阳性细胞数也随之增多，子宫内膜干基底层细胞膜和细胞浆有很强的棕黄色染色，在管腔表面形成不连续的线状；24h后干细胞由扁平渐变为立方，Wnt-1阳性细胞数有所减少； 48h后，子宫干层内仅见极少量Wnt-1阳性细胞(图2)。
图2 Wnt-l免疫组织化学检测结果
3.3 β-catenin免疫组织化学检测结果
未经‘热球’处理正常胞浆中仅见极少量β-catenin蛋白在细胞膜呈阳性表达：‘热球’处理后12h，仅见极少量β-catenin蛋白在细胞膜呈阳性表达；18h后，β-catenin开始在胞浆中表达，阳性细胞呈棕黄色，多数阳性颗粒出现在细胞核的周围，少数在胞核内也有染色；24h后β-catenin的表达增强，胞浆阳性颗粒多呈棕褐色；48h后子宫干层内少数β-catenin蛋白在细胞膜呈阳性表达(图3)。。
图3 β-catenin免疫组织化学检测结果
3.4 β-catenin蛋白印迹分析结果
未经“热球”处理正常胞浆及“热球”处理的子宫内膜细胞12h后，子宫干Wnt-1及β-catenin几乎无表达; “热球”处理后，18h观察到了Wnt-1及β-catenin的表达，24h后其表达水平进一步增强并达高峰(P < 0.05)，之后随着时间的推移，Wnt-1及β-catenin的表达逐渐减弱(P < 0.05)，至48h表达微弱(图4)。
图 4 Wnt-1与β-catenin蛋白印迹免疫分析
4.讨论
本研究对大鼠子宫创伤愈合后的表达变化进行了蛋白水平的检测，对照子宫损伤后的形态学研究表明，β-catenin在正常子宫干细胞的细胞膜少量表达，细胞膜上β-catenin染色强度均匀一致；’热球’处理损伤后12小时，子宫干β-catenin在细胞膜表达微弱；去除’热球’处理后随着修复的进行，损伤后18小时在子宫干细胞的胞浆中观察到了β-catenin的表达；24小时后其表达水平进一步增强并达高峰，细胞内胞质β-catenin积蓄，部分细胞核染色阳性；之后随着时间的推移，至48小时后β-catenin的表达逐渐减弱。在子宫损伤修复早期，可见β-catenin蛋白水平上升，且β-catenin定位发生了从质膜到胞质的变化，这是由于丝氨酸磷酸化减少致其降解减少所致。本研究提示β-catenin在子宫损伤后的组织修复过程中对子宫干细胞的增殖分化发挥了一定的作用。
近来有报道，β-catenin基因的敲除对干细胞扩增及分化并不是必要的[10]。这些数据与前面文献报道Wnt信号通路在维持淋巴细胞的发育、造血干细胞的扩增和自我更新过程中起重要作用相矛盾。这有可能是β-catenin在功能上与其家族中其他catenin成员(β-catenin)相重叠，而使β-catenin有效地被弥补。或是其他原因，还有待我们进一步研究。
必须指出，干细胞的增殖分化是一个相当复杂的过程，还有很多其他信号分子及因子共同参与调控，如Notch、TGF和BMP等[11-13]。在这一过程中，Wnt信号分子与其他信号分子之间的顺序关系以及如何相互作用还不十分清楚，因此有必要去阐明Wnt 信号在胚胎干细胞和其它干细胞中的精确功能，这对干细胞治疗和再生医学研究等方面都具有非常重要的意义。
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论文作者:叶国柳,杜丹丽,靳丽杰,王玲玲
论文发表刊物:《医药前沿》2016年2月第3期
论文发表时间:2016/4/6
标签：干细胞论文; 信号论文; 子宫论文; 子宫内膜论文; 蛋白论文; 损伤论文; 细胞膜论文; 《医药前沿》2016年2月第3期论文;