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陈秀丽 唐亚芳 李昱晓 杜婧 石家庄市第五医院肝病研究所 河北 石家庄 ０５００２１ 基金资助项目:河北省卫生厅科学基金资助项目,No．２０１２０１７４
【摘要】 乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus,HBV)感染可引起严重的慢性肝脏疾病.HBV 具有高度的种属特异性和组织特异性,易感宿主范围狭窄,仅限于人、黑猩猩等灵长类动物,HBV 的研究很大程度上依赖于动物模型和组织培养,很难在普通实验动物中建立疾病模型.本文就HBV 感染的细胞模型和动物模型作一综述.【关键词】 乙型肝炎病毒; 感染; 动物模型; 细胞模型【中图分类号】R３７【文献标识码】B 【文章编号】１００８－６３１５(２０１５)１０－０６０３－０１
０ 引言人体感染HBV以后产生免疫耐受,是HBV感染后形成慢性化的主要机制之一.由于缺乏有效的体外病毒感染和复制模型系统,HBV 感染肝脏的早期机制研究进展较为缓慢,从而在一定程度上影响了乙型肝炎及其相关肝脏疾病的基础和临床研究.目前已有的HBV 感染模型有两种,即细胞模型和动物模型[１－２],本文做一综述.
１ 动物模型目前,HBV感染动物模型分为６种,分别是灵长类动物模型、树鼩模型、土拨鼠(旱獭)嗜肝病毒模型、鸭嗜肝病毒模型、HBV 转基因小鼠模型、人－ 鼠嵌合模型等.但灵长类动物受到保护;鸭的药代动力学和免疫学遗传背景与人类有很大的不同;土拨鼠仅产于北美,运输困难且价格昂贵;从而这些动物模型的应用受到限制.１．１ 黑猩猩感染HBV可以出现典型的急性乙型肝炎症状,其细胞免疫反应与人类相似,可用于急性乙肝免疫学研究[３].但是黑猩猩属于濒危动物,应用受到限制.猩猩易于感染HBV,但是不能表现疾病的所有症状,不利于作为动物模型使用.１．２ 目前应用较多的是鸭乙型肝炎病毒(DHBV)感染模型,Zhao和Liu等研究团队采用DHBV感染鸭原代肝细胞建立模型,应用２－DE和蛋白质组学技术,深入探讨了HBV和肝细胞之间的相互作用以及HBV 致病的分子生物学机制.
１．３ 土拨鼠肝炎病毒(woodchuckhepatitisvirus,WHV)与人HBV DNA 序列同源性约为７０％,而且基因组结构相似,因此,土拨鼠(旱獭)嗜肝病毒感染模型得到广泛应用,Roggendorf等采用WHV 动物模型,进行了乙型肝炎的DNA疫苗和新药的开发研究.东方旱獭(Marmotamonax)模型多应用于HBV感染相关的HCC的研究[４].
１．４ HBV 转基因小鼠(transgenicmice,Tg鼠)模型HBV全基因Tg鼠或超长序列Tg鼠具有HBVDNA复制及蛋白质合成的能力,能产生较高水平的血清HBsAg及HBeAg,血清中可检出HBVDNA,可用于评价抗病毒药物的疗效.Jin和Fox等应用Tg鼠模型研究了NK细胞与肝纤维化的关系,发现NK细胞可以引起肝脏星状细胞的活化,从而导致细胞外基质的增加,加重肝纤维化,另有报道应用Tg鼠模型研究了乙型肝炎的发病机制和疾病演变规[５].
１．５ 近年来,人－鼠嵌合模型的研究成为热点,将人肝细胞移植到小鼠体内,作为研究HBV感染的良好体内模型[６].目前主要有三种模型,第一种是三合体小鼠(trimeramouse)模型:正常小鼠给予SCID种小鼠骨髓细胞,进行辐射保护处理并经致死剂量辐射照射后,可以移植HBV 感染的人肝组织,用于研究HBV的复制和治疗,Eren和Dagan等采用这种小鼠模型研究开发抗HBV的新型药物;第二种是移植人肝细胞的免疫缺陷鼠模型;第三种是uPA转基因小鼠模型:uPA 即尿激酶纤维蛋白溶酶原激活物,Meuleman和Lutgehetmann等建立了uPA＋/＋－SCID 转基因小鼠模型.２ 细胞模型目前,用于体外研究HBV的细胞模型分为两类:分别是人原代肝细胞和肝癌细胞来源的细胞系.人原代肝细胞保留了分化肝细胞的重要细胞学特性,允许HBV的自然穿入和完整复制.然而在体外培养几天后,原代肝细胞开始出现肝细胞特殊形态的消失,并且失去了对HBV 的感染和复制能力.人原代肝细胞培养因为存在上述困难而限制了其应用,对HBV 的研究更多的依赖于转染了HBVDNA克隆的分化良好的肝癌细胞系.第一类包括人(或者树鼩)原代肝细胞和永生化人肝细胞(如HepRG)２ 种.第二类是通过将HBV 基因组转染到人肝细胞系中,建立相应的HBV 瞬时或稳定复制细胞模型,这种细胞模型可以用来研究病毒突变表型耐药和新型抗HBV药物的研发.２．１ HepG２细胞系,是由肝胚瘤细胞的活体组织建株,可分泌多种血浆蛋白和表达HBsAg和HBeAg.其中最常用的是HepG２．２．１５细胞系,HepG２．２．１５细胞稳定转染了完整的HBV基因组,表达HBVRNA、病毒蛋白并能产生病毒样颗粒.由HepG２．２．１５细胞分泌的病毒颗粒已经被证实可以感染黑猩猩.由于HBV基因组是通过转染而非自然感染的方式进入到细胞中的,这些转染了HBVDNA的肝癌细胞系不能用于对HBV感染宿主细胞的早期感染过程的研究,包括病毒吸附,穿入和脱壳等过程.２．２ Sun团队将HBV前基因组RNA 的cDNA 序列,构建到对四环素敏感的巨细胞病毒早期启动子下游,转染HepG２细胞,得到在诱导型四环素启动子控制下表达HBV的HepG２．１１７细胞系.２．３ L０２细胞株是由人胎肝细胞株经由SV４０病毒大T抗原永生化改建而成,保留了原代肝细胞的绝大多数生物学特性,同时具有类似肿瘤细胞的永生性.国内报道将含有１．３倍HBV 全基因组的重组质粒转染人类肝细胞L０２细胞,这一细胞模型与HepG２．２．１５细胞类似,具有复制和分泌HBV 能力.将HBV全基因C区变异株V６０,L９７和G８７转染HepG２细胞,转染后外源基因能够持续复制和稳定表达,不受宿主细胞染色体的影响,并可随细胞的分裂稳定传给子代细胞,为体外研究HBV核心区变异建立了细胞模型.２．４ Walters等建立了稳定整合含有变异位点HBV DNA 的rtM２０４I和rtL１８０M/M２０４V细胞系,有利于筛选新的抗HBV变异株的药物.
２．５ HBV感染原代培养的肝细胞模型主要包括人原代肝细胞(primaryhumanhepatocytes,PHH)和树鼩原代肝细胞(primarytupaiahepatocytes,PTH),是在原代正常肝细胞培养时加入含HBV颗粒的血清而建立.利用腺病毒介导HBV 基因转移,感染人原代肝细胞、树鼩肝细胞,主要用于研究HBV 附着、早期感染过程、HBV 外膜蛋白抗体的抗感染作用以及新型抗病毒药物的筛选等.２．６ HepaRG细胞HepaRG细胞是终末分化肝细胞,来源于人肝祖细胞系,保留了许多原代肝细胞的特征,包括关键代谢酶、药物转运蛋白、核受体的表达.HepaRG细胞对HBV易感,而且可以支持HBV 的完整生活周期的研究,Narayan等应用蛋白质组学技术,发现HepaRG细胞和HBV 之间的相互作用差异蛋白共有１９个.适合于HBV 自然感染,并能有效进行病毒复制的细胞模型,为研究HBV感染宿主细胞的早期机制,以及完整的病毒复制过程提供了一个有用的研究工具.３ 展望本文综述了HBV 感染模型的新进展,迄今为止,尚缺乏与人类感染HBV相同肝脏病理改变的细胞模型,也缺乏对HBV易感的理想的小动物模型,目前构建的多株细胞内基因整合的HBV复制模型均是V 基因D型.在中国,HBV感染率很高,但至今未见报道B、C基因型的HBV细胞模型,这一现状严重阻碍了HBV的相关研究.参考文献[１] 冯广义,张养生．乙型肝炎病毒感染模型研究进展[J]．中华实验和临床感染病杂志(电子版),２００９,３(３):３２９－３３３．[２] 冯昀熠,梁光义,张永萍等．鸭乙型肝炎病毒感染模型研究进展[J]．贵阳中医学院学报,２００８,３０(２):５８－６１．[３] 向维,张薛磊,丁馨等．乙型肝炎病毒感染基因转染模型研究进展[J]．国际病毒学杂志,２０１２,１９(２):８０－８３．[４] 王选举,黄正明,宋建国等．乙型肝炎病毒感染模型的研究进展[J]．传染病信息,２００９,２２(３):１８９－１９２．DOI:１０．３９６９/j．issn．１００７－８１３４．２００９．０３．０２４．[５] 卢渝,张君．乙型肝炎病毒感染模型的研究进展[J]．中外医疗,２００９,２８(２７):１７２－１７４．[６] 刘晔,陈炜,徐庆等．慢性肝病患者肝功能评估方法的研究进展[J]．诊断学理论与实践,２０１０,０９(６):６０６－６１０．
论文作者:陈秀丽 唐亚芳 李昱晓 杜婧
论文发表刊物:《中国综合临床》2015年9月供稿
论文发表时间:2016/2/26
标签：模型论文; 细胞论文; 肝细胞论文; 乙型肝炎论文; 转染论文; 细胞系论文; 小鼠论文; 《中国综合临床》2015年9月供稿论文;