李际强[1]2002年在《升降散抗甲型流感病毒的实验研究》文中研究说明流行性感冒(简称流感)是一种古老的传染性疾病，已为世界的广大人民所熟悉。其病原体流感病毒属于正粘病毒科，分为甲、乙、丙叁型。由流感病毒引起的流感的流行情况在2000多年就有记载，其典型特点就是一种突发的呼吸道疾病，流行大约几周，而后突然消失。流感的流行曾造成重大的损失，并给人民的健康带来极大威胁。例如1918-1919年的流感大流行就造成2-4千万人死亡。因此，世界各国均投入大量的人力物力进行流感病毒的研究，期望能够找到预防或治疗此传染病的有效方法。 本课题所用方剂是清代名医杨粟山所创的治温之总方，由僵蚕、蝉蜕、大黄、姜黄四味中药组成，具有升清散火，祛风除湿，清热解郁等功能。大量临床报道表明该方具有治疗各种外感热病，其中包括流行感冒的作用。但对其抗流感病毒机理研究至今尚少有报道，因此有必要对该方抗流感病毒机制进行深入研究。本文主要从对流感病毒的中西医文献研究及古方升降散抗流感病毒实验研究两方面论述。 文献研究 本文对国内外关于流感的病原学、流行病学、对人类的危害及中医对其病因病机的认识、中西医防治的进展进行了综述与分析。文献表明，自从Christpher Andrewes等人首次分离出A型流感病毒以来，通过大量的病毒分离与研究，已基本弄清了流感病毒感染、流行的机理。但是由于缺乏控制流感的发生与流行的手段，流感病毒的研究仍是当今病毒学研究的热点之一。目前临床上所用的一些抗病毒药物如病毒唑、金刚烷胺、金刚乙胺等药物对于防治流感有一定的效果，但因其副作用而限制了临床应用，新的抗流感药物神经氨酸酶抑制剂正在研制与试用中。对于流感的预防，流感疫苗的研究是倍受关注的，但是由于流感抗原的病毒变异性影响了流感疫苗的应用。近年来，国内学者在中医药治疗流感的临床及基础研究方面，进行了较深入的研究，并已取得令人鼓舞的进展。因而，从中药中寻找疗效确切且副作用低的抗流感病毒药物已受到国内外的广泛重视。 实验研究 目的：通过用现代医学方法对升降散体内外抗流感病毒的实验观察，探讨升降散抗流感病毒作用，从而进一步研究其作用机理，为临床治疗流感提供实验依据。方法：接种FM1流感病毒于MDCK细胞，观察升降散体外抗流感病毒作用；体内抗病毒实验以病毒滴鼻感染小鼠，观察升降散对肺指数、血凝滴度、病毒致小鼠死亡率等的影响。结果：体外实验中，升降散对流感病毒FM1株的最小有效浓度为1.56g／ml，表明其能有效地抑制流感病毒在细胞内复制。体内实验中，升降散对小鼠病毒性肺炎有抑制作用(大中剂量与病毒对照相比，P＜0.05)，并具有正的量效关系，即在一定情况下，剂量越大，越能有效地抑制流感病毒所致的小鼠肺炎；升降散能明显降低受感染小鼠肺组织病毒血凝滴度；升降散对甲3型与甲1型流感病毒感染小鼠的生命率有明＿一一一显延长作用。结论：升降散对流感病毒的增殖有抑制作用，并且能改善流感病毒引起的小鼠肺炎症状，延长生命率。因此，该药可能是一种有实用价值的治疗流行感冒的有效药物。 另外，本课题还对升降散体内抗菌实验及对流感病毒感染的树翩模型进行研究。体内抗菌实验表明：流感病毒能有效降低金黄色葡萄球菌感染小鼠的死亡率，但对大肠杆菌没有显着的抑制作用。树嗣模型实验表明：发现树取对流感病毒是较为敏感的，由于其属灵长类，作为动物模型可能更接近人类惰况，值得我们进一步深入研究并不断完善此模型。 升降散的体内外抗病毒作用及抗菌作用为其临床用于上呼吸道感染（包括流行性感冒）疾病提供了现代药理学依据。
刘文军, 薛燕星, 胡东鹏[2]2012年在《升降散的现代药理机制研究进展》文中研究表明古方升降散具有解郁宣透,降火泄热之功,在现代临床中的运用相当普遍,多用于"表里叁焦大热"的温热火郁证,以叁焦火郁、气机失畅为病机特点众多病症,均可以古方升降散为基础而经辨证施治得效,内、外、儿、皮肤、五官等临床各科使用该方辨证加减而获效。薛伯寿教授临床擅用古方升降散,笔者
吴国志[3]2001年在《加味升降散抗流感病毒的实验与临床研究》文中研究指明本研究在中医理论指导下，据导师多年的临证经验，结合现代基础医学研究手段，从理论、实验及临床研究等方面对流行性感冒（时行感冒）的病因病机、治法用药及疗效机理等进行了较为系统的深入探讨。认为本病的致病病因是感受时行疫毒，正气不足是内在关键，阳热火毒怫郁内炽为基本病机，宗“邪去正自安”思想，确立了解毒清热，宣畅气机之治法，并撷清·杨栗山运用升降散之经验，拟加味升降散方用治本病。 本文实验研究在师兄刘培民成功验证升降散抗流感病毒和提高机体免疫功能有效的基础上，进一步对加味升降散的作用机理进行了深入探讨。结果表明，加味升降散体外具有不亚于西药组的直接抗病毒作用，体内可有力降低流感病毒感染小鼠的死亡率（P＜0.01），明显减轻鼠肺组织的病变程度，在提高机体免疫力方面具有优于西药组的趋势，可显着提高血清干扰素和特异性中和抗体水平而增强抗病毒感染的能力，从而显示了中药整体调节抗御疾病的优势。临床研究对35例流感患者施治，与西药组30例对照。结果表明，加味升降散具有良好的平稳持续降温作用，48小时内降温总疗效优于西药组（P＜0.05），对症状的改善，尤其对便秘、口干、身痛、倦怠等的治疗作用明显优于西药组（P＜0.01）。为加味升降散的临床疗效提供了科学的统计学依据。 本课题是对中药复方治疗流感研究工作的有益尝试，不仅丰富了中医药治疗流感的理论内容，也对流感的临床治疗有一定启示作用。
丁慧芬[4]2004年在《升降散临床观察及实验研究近况》文中研究表明升降散载于清代杨栗山《伤寒温疫条辨》,主要由僵蚕、蝉蜕、姜黄和生大黄4味药组成,具有升清降浊、宣郁清热等功效。原治温病表里叁焦大热,近代广泛运用于各科杂病及疑难重症,皆获效甚捷[1]。1临床观察1.1升降散在内科的疗效观察林则杰[2]用升降散合小柴胡汤加
曾郁敏[5]2009年在《毒热平注射液抗流感病毒作用及免疫调控机制的实验研究》文中研究指明实验目的:流感是流感病毒引起的急性呼吸道传染病,好发于冬、春季节。尤其是甲型流感病毒,由于其极易产生变异,制备有效的疫苗困难重重,而针对流感病毒感染的西药既有较强的毒副作用,又容易诱导病毒产生耐药性。这种现状下,在我国的中医药宝库中寻找有效药物、创造新型药剂来防治流感就成为一项很有意义的研究工作。毒热平注射液是由黄芩、栀子、灯盏花、猪胆粉等四味药物组成的中药复方制剂,根据中医理论“毒损肺络”病机理论配伍研制而成,具有清热燥湿、凉血解毒、活血通络的功效。本实验采用流感病毒亚甲型鼠肺适应株(FM_1)感染小鼠作为模型,观察毒热平注射液对FM1不同时相感染小鼠的抗病毒作用及其对免疫功能的影响,以天然免疫中重要的模式识别受体Toll样受体为切入点,探讨其抗病毒作用及免疫调节作用的分子机制,为毒热平注射液的临床应用提供理论依据。实验方法:1.毒热平注射液对FM_1感染小鼠死亡保护率的影响将ICR小鼠随机分为七组:正常组、模型组、利巴韦林组、双黄连组、毒热平注射液大、中、小剂量组,以4LD50的流感病毒液滴鼻感染小鼠造模,0.05mL/只,正常组以生理盐水滴鼻对照。造模后当日腹腔注射给药,每天1次,连续7天;正常组和模型组小鼠注射生理盐水对照。自造模当日起连续观察14天,计算各组死亡率及平均生活日。2.毒热平注射液对FM1不同时相感染小鼠肺损伤及病毒增殖的影响将ICR小鼠随机分为七组:正常组、模型组、利巴韦林组、痰热清组、毒热平注射液大、中、小剂量组,以4LD50的流感病毒液滴鼻感染小鼠造模,0.05mL/只,正常组以生理盐水滴鼻对照。造模后当日腹腔注射给药,每天1次;正常组和模型组小鼠注射生理盐水对照。按照要求在不同时间点处死小鼠,摘取肺脏,计算肺指数,同时各组取肺组织分别进行固定和匀浆,作病理形态学检测和肺组织中病毒滴度的检测。3.毒热平注射液对FM1不同时相感染小鼠免疫功能的影响动物分组、造模、给药方法同上。按照要求在不同时间点处死小鼠,无菌取脾脏做脾脏T、B淋巴细胞增殖活性的检测,采用MTT法;摘取小鼠肺脏进行匀浆,和小鼠血清一起用ELISA试剂盒检测炎症因子TNF-α、IFN-β、IFN-γ、IL-4、IL-12以及趋化因子IL-8、MIP-2、RANTES、IP-10等的含量。4.毒热平注射液对FM1病毒感染小鼠免疫调控分子机制的研究动物分组、造模、给药方法同上。按照要求在不同时间点处死小鼠,冰浴条件下无菌迅速摘取小鼠肺脏,置于无RNase EP管中,立即投入液氮中冷冻。每组取5个肺组织。用PCR法检测肺组织中TLR3及PKR mRNA的表达,用Western-blot法检测TLR3及PKR蛋白的表达。实验结果:1.毒热平注射液对FM_1感染小鼠死亡保护率的影响模型组的死亡率为75%,平均生存时间为8.69d。毒热平注射液中剂量组死亡率为36.3%,与模型组比较,经x~2检验差异显着,P＜0.05;毒热平注射液大剂量组平均生存时间为10.8d,与模型组比较P＜0.05;毒热平中剂量组平均生存时间为11.81d,与模型组比较P＜0.01。2.毒热平注射液对FM1不同时相感染小鼠肺损伤及病毒增殖的影响2.1在不同时间点观察受试动物,可见正常组小鼠体重稳步上升,模型组小鼠的体重在叁个时间点表现出先增加再下降的趋势,且均显着低于正常组。用药组中,利巴韦林组体重逐渐增加,痰热清组及毒热平各剂量组趋势同模型组。在每个时间点上,造模72h后,与模型组比较,发现毒热平中剂量组有明显差异,P＜0.05;造模120h后,毒热平小、中剂量组与模型组比较有明显差异,P＜0.05或P＜0.01。2.2在不同时间点观察受试动物,可见模型组及各用药组的肺指数均呈现逐步升高的趋势。在每个时间点上,造模72h后,与模型组比较,利巴韦林组肺指数有显着性差异,P＜0.01;毒热平中、大剂量组有明显差异,P＜0.05;造模120h后,与模型组比较,发现利巴韦林组肺指数有极为显着性差异,P＜0.001;毒热平中剂量组有明显差异,P＜0.05。2.3在不同时间点观察受试动物,可见模型组及各用药组肺组织中病毒滴度呈现逐步上升的趋势。感染120h后,与模型组相比,利巴韦林对肺脏中的病毒杀伤效果最明显,P＜0.001;毒热平注射液中剂量组对肺脏中的病毒亦有明显杀伤作用,P＜0.01,其余用药组与模型组比较无差异。2.4 HE染色光镜观察正常组小鼠肺泡结构完整清晰,腔内未见渗出。模型组造模24h可见弥漫性肺泡壁增厚,肺泡壁血管扩张充血,有少量单个核细胞浸润,部分肺泡有少量出血。造模72h后可见弥漫性肺泡壁增厚,部分区域较前次显着增厚,有明显单个核细胞浸润。造模120h后可见支气管管腔内有出血及炎性渗出,支气管周围有多量淋巴细胞浸润;弥漫性肺泡壁增厚,局灶性肺泡实变。各用药组病变明显减轻,但随时间变化而病变均逐渐加重。利巴韦林120h组仍只见轻度病变;痰热清组、毒热平大、中、小剂量组病变均呈进行性加重,但均轻于同时期模型组。3.毒热平注射液对FM1不同时相感染小鼠免疫功能的影响3.1不同时间点观察受试动物,可见模型组脾脏T、B淋巴细胞增殖活性随时间变化呈现逐渐下降的趋势,造模后小鼠的T细胞增殖活性比B细胞增殖活性抑制更为明显。在叁个时间点,模型组T细胞的增殖活性均明显受抑,P＜0.001,各用药组对其均有不同程度的恢复;造模24h后可见除利巴韦林组外的各中药组还表现出免疫促进的作用,与正常组相比显着增高,P＜0.001。造模72h后和120h,各用药组对小鼠的免疫抑制也有了不同程度的恢复,与模型组相比P＜0.001～P＜0.05,但均未恢复到正常组水平。各组B细胞增殖活性变化与T细胞近似,但变化程度较为缓和。3.2不同时间点检测各组动物血清及肺匀浆中的细胞因子,可见模型组除IL-4水平随时间变化逐渐降低外,TNF-α、IFN-β、IFN-γ、IL-12以及趋化因子IL-8、MIP-2、RANTES、IP-10均呈现逐渐升高的趋势。各用药组对其有不同程度的干预作用。总体来说,相比而言,对各细胞因子的干预效果,痰热清组＞利巴韦林组＞毒热平大剂量组＞毒热平中剂量组,毒热平小剂量组一般来说效果较差。4.毒热平注射液对FM1病毒感染小鼠免疫调控分子机制的研究与正常组相比,模型组小鼠不同时相感染FM1后对肺组织中TLR3及PKR mRNA及蛋白的表达水平造成了不同程度的增高,药物亦发挥了不同程度的干预作用。总体而言,TLR3及PKR mRNA及蛋白的表达水平随时间变化呈现先升高(72h)、后下降(120h)的趋势,除毒热平小剂量组外,其他各用药组均可抑制其升高的水平,与模型组相比,P＜0.01或P＜0.05,但均不能恢复到正常组水平。结论1.毒热平注射液具有抗病毒作用通过观察药物对肺脏中病毒滴度的影响发现,毒热平注射液中剂量组可明显抑制肺脏中病毒的增殖,具有一定的抗病毒作用。2.毒热平注射液对FM_1感染小鼠的死亡和肺组织损伤具有保护和改善作用:毒热平注射液中剂量组可明显降低FM1感染小鼠的死亡率,降低肺指数,改善肺脏病理变化,对FM_1感染小鼠的死亡和病毒引起的肺组织损伤具有保护作用。3.毒热平注射液对FM_1感染小鼠免疫功能具有调节作用:3.1流感病毒FM_1感染小鼠后,对脾脏T、B淋巴细胞的增殖活性具有明显的抑制作用,而毒热平注射液可对其有明显的恢复作用。3.2毒热平注射液对FM_1感染小鼠血清及肺组织匀浆中细胞因子水平具有调节作用,可显着升高因病毒感染引起的IL-4下调以及抑制其他细胞因子和趋化因子的上调,减轻炎性病理损伤,进而恢复机体免疫功能的稳定和平衡,并帮助机体抵御病毒的侵害作用。4.毒热平注射液可通过调节肺组织中TLR3和PKR的表达水平来发挥免疫调节作用。
董丹[6]2010年在《以“肺常不足”立论双表法抗流感病毒感染TLR信号通路时效关系研究》文中研究表明目的:通过幼龄鼠与成龄鼠建立流感病毒(IV)感染动物模型对照实验研究以及流感病毒感染小鼠肺组织TLR4-NF-κB P65信号通路改变情况,探讨幼龄鼠与成龄鼠对流感病毒的易感性,在动物实验角度阐述“肺常不足”立论机制;将辛凉解表经典方剂银翘散与益气固表方剂玉屏风散进行比较研究,通过双表法对流感病毒感染鸡胚的保护作用以及小鼠肺组织TLR4-NF-κB P65信号通路活化程度的影响,探讨解表法与固表法在流感病毒感染防治中的作用;对辛凉解表法代表方剂银翘散采用高效液相色谱法建立指纹图谱,以期进一步明确其抗流感病毒物质基础。材料与方法:1.采用鼻腔接种甲型流感病毒鼠肺适应株A/FM1/47诱导昆明种小鼠,将实验小鼠分为幼龄鼠和成龄鼠两组,观察幼龄鼠和成龄鼠在一般状态、存活只数、肺组织病变程度等方面的差异,计算肺指数,应用RT-PCR技术检测两组小鼠肺组织中不同时点IV-RNA的病毒载量的差异。为“肺常不足”理论实质提供实验验证。2.采用免疫组织化学和RT-PCR技术检测幼龄鼠和成龄鼠肺组织中TLR4和NF-κB P65的蛋白及mRNA在不同时点的表达,比较幼龄鼠和成龄鼠感染流感病毒后TLR4-NF-κB P65信号通路的改变情况,为“肺常不足”立论提供实验佐证。3.采用血凝实验方法观察不同浓度银翘散提取物、玉屏风颗粒不同时间点体外直接抑制IV作用;研究不同浓度银翘散提取物、玉屏风颗粒对IV感染鸡胚的预防和保护作用。4.采用免疫组织化学方法,检测银翘散提取物、玉屏风颗粒及银翘散合玉屏风颗粒给药各组小鼠肺组织不同时点TLR4、NF-κB P65蛋白表达情况。5.采用RT-PCR方法,检测银翘散提取物、玉屏风颗粒及银翘散合玉屏风颗粒给药各组小鼠肺组织不同时点TLR4、NF-κB P65mRNA表达情况。6.应用高效液相色谱法建立银翘散全方指纹图谱,同时测定银翘散及单味药五种有效成分;分析银翘散指纹峰分布特征及归属情况。结果:1.接种流感病毒后,成龄模型组基本保持较好状态,幼龄模型组一般状态最差,正常组小鼠一般状态最好。接毒后14天,正常组全部存活。幼龄模型组死亡最多,在第5天达到死亡高峰,与正常组及成龄模型组比较均有显着性差异(P<0.05)。成龄模型组与正常组比较无显着性差异(P>0.05)。2.肺组织外观病变程度显示:各正常组小鼠在不同时点肺组织外观全肺野无病变;幼龄模型组肺组织病变最重,各时间点与正常组及成龄模型组比较均有显着性差异(P<0.05),第5天为幼龄模型组肺组织病变最明显时期;成龄模型组各时间点与正常组比较无显着性差异(P>0.05),与幼龄模型组有显着性差异(P<0.05)。3.肺指数测定结果:幼龄和成龄正常组小鼠在不同时点肺指数最低。幼龄模型组肺指数最高,与正常组及成龄模型组比较均有显着差异(P﹤0.05),感染第5天肺指数达到最高。成龄模型组肺指数与正常组比较无显着性差异(P﹥0.05),与幼龄模型组比较有显着差异(P﹤0.05)。4.肺组织不同时点IV-RNA的半定量测定结果:正常组小鼠各时点肺组织中未检测到IV病毒核酸,幼龄模型组在各时点均检测到大量的病毒核酸,在第5天病毒核酸量最大,为2.1238±0.2774,幼龄模型组各时间点与成龄模型组比较有显着性差异(P﹤0.05)。成龄模型组各时点IV病毒核酸只有微量表达,与幼龄模型组比较有显着性差异(P﹤0.05),与正常组比较,无显着性差异(P﹥0.05)。5.肺组织TLR4蛋白表达情况:幼龄正常组和成龄正常组均可以检测到少量的TLR4蛋白表达,且各个时点比较,蛋白表达无显着性差异(P﹥0.05)。幼龄模型组TLR4蛋白表达最强,且随着时间推移表达逐渐增强,在第5天达到峰值;幼龄模型组与正常组和成龄模型组比较,均具有显着性差异(P﹤0.05)。成龄模型组TLR4蛋白表达高于各正常组,但低于幼龄模型组。6.肺组织NF-κB P65蛋白表达情况:幼龄正常组和成龄正常组均可以检测到少量的NF-κB P65蛋白表达,且各个时点比较,蛋白表达无显着性差异(P﹥0.05)。幼龄模型组NF-κB P65蛋白表达最强,且随着时间变化表达逐渐增强,每一时间点与前一时间点比较具有显着性差异(P﹤0.05);成龄模型组NF-κB P65蛋白表达高于各正常组,但低于幼龄模型组(与正常组和幼龄模型组比较,P﹤0.05),成龄模型组蛋白表达各个时间点无显着性差异(P﹥0.05)。7.肺组织TLR4 mRNA表达情况:幼龄正常组和成龄正常组肺组织均可以检测到少量的TLR4 mRNA表达,且各个时点比较,mRNA表达无显着性差异(P﹥0.05)。幼龄模型组TLR4 mRNA表达最强,且随着病程进展表达逐渐增强,在第5天达到峰值,TLR4mRNA含量检测强度与内参比值达到1.8351±0.0110;幼龄模型组TLR4 mRNA明显高于正常组和成龄模型组,具有显着性差异(P﹤0.05)。成龄模型组TLR4mRNA表达高于各正常组,但低于幼龄模型组。8.肺组织NF-κB P65 mRNA表达情况:幼龄正常组和成龄正常组肺组织均可以检测到少量的NF-κB P65 mRNA表达,在观察第1、3、5、7天各个时点比较,mRNA表达无显着性差异(P﹥0.05)。幼龄模型组NF-κB P65 mRNA表达最强,且随着病程进展表达逐渐增强;与正常组和成龄模型组比较,具有显着性差异(P﹤0.05)。成龄模型组NF-κB P65 mRNA表达高于各正常组,但低于幼龄模型组。9.药物体外直接抑制病毒作用:银翘散提取物、玉屏风颗粒均可不同程度直接抑制甲型流感病毒FM1的活性,作用时间从1h可持续到24h,其中药物在8小时～18小时范围内抑制病毒效果显着,18小时后作用逐渐减弱;银翘散提物体外直接抑制病毒作用在8h时最强,其抑制病毒滴度可达16倍;玉屏风颗粒体外直接抑制IV作用在8-18h最强,抑制作用可持续达到8倍;银翘散提取物和玉屏风颗粒在不同时间点与西药利巴韦林对照组相比较未见优势。10.银翘散提取物、玉屏风颗粒对IV感染鸡胚的预防和治疗作用比较:银翘散提取物、玉屏风颗粒在400g/ml浓度时无论是预防给药还是治疗给药,血凝效价均比病毒对照组有明显降低,具有显着性差异(P﹤0.05);联合应用时,其血凝效价比病毒对照组均有明显降低,具有显着性差异(P﹤0.05);给药各组之间比较表明,两方合用组比单药组血凝效价低,但各组之间血凝效价因数并无显着性差异(P﹥0.05)。11.各组小鼠肺组织TLR4、NF-κB P65蛋白表达情况:各中药组TLR4蛋白表达均低于利巴韦林组,具有显着性差异(P﹤0.05)。在同一时间点,各中药组间比较,具有显着性差异(P﹤0.05),双表法组TLR4蛋白表达最低。在各个时点,中药组TLR4蛋白表达均高于正常组,但明显低于模型组,与模型组和正常组比较,均具有显着性差异(P﹤0.05)。各中药组间各时间点TLR4蛋白表达有显着性差异(P﹤0.05),双表法组在各时点蛋白表达最低。银翘散提取物组、双表法组在各个时点NF-κB P65蛋白表达均低于利巴韦林组,具有显着性差异(P﹤0.05)。玉屏风颗粒组在第1、3天蛋白表达低于利巴韦林组,具有显着性差异(P﹤0.05),第5、7天蛋白表达水平与利巴韦林组相当,无显着性差异(P﹥0.05)。各中药组间各时间点NF-κB P65蛋白表达有显着性差异(P﹤0.05),双表法组在各时点蛋白表达最低。12.各组小鼠肺组织TLR4、NF-κB P65mRNA表达情况:银翘散提取物组在第1、5天TLR4mRNA表达高于利巴韦林组,具有显着性差异(P﹤0.05),在第3、7天TLR4mRNA表达与利巴韦林组相当,无显着性差异(P﹥0.05)。玉屏风颗粒组在1、3天TLR4mRNA表达高于利巴韦林组,具有显着性差异(P﹤0.05),在第5、7天TLR4mRNA表达与利巴韦林组相当,无显着性差异(P﹥0.05)。双表法组在各时点TLR4mRNA表达均低于利巴韦林组,具有显着性差异(P﹤0.05)。各中药组间各时间点TLR4mRNA表达有显着性差异(P﹤0.05),双表法组在各时点mRNA表达最低。利巴韦林组及各中药组在各时间点NF-κB P65 mRNA表达低于模型组,高于正常组,具有显着性差异(P﹤0.05)。银翘散提取物组等各中药组在各时点NF-κB P65mRNA表达均低于利巴韦林组,具有显着性差异(P﹤0.05)。在各中药组中双表法组的NF-κB P65mRNA表达最低,与其他各组比较有显着性差异(P﹤0.05)。13.银翘散全方不同提取方法提取物色谱图共有26个共有指纹峰; 26个共有指纹峰都分别归属于9个单味药材。从色谱峰归属的数量上来看,牛蒡子、金银花、连翘所属峰占主要峰;从色谱峰的归属面积上来看,牛蒡子、甘草、金银花、荆芥占主要峰值。结论:1.通过小鼠一般状态观察、肺组织病理观察、肺组织IV-RNA的半定量测定验证,幼龄鼠可以成功塑造小鼠IV感染模型,成龄鼠不能成功造模,可以佐证“肺常不足”理论。2.幼龄鼠与成龄鼠IV感染后肺组织TLR4-NF-κB P65信号通路活化程度不同,幼龄鼠TLR4、NF-κB P65表达显着升高,成龄鼠轻度升高,二者差异显着;TLR4-NF-κB P65信号通路的过度活化,可能是幼龄鼠肺脏免疫病理损伤严重的机制之一,可以为“肺常不足“理论立论提供佐证。3.不同浓度银翘散提取物、玉屏风颗粒对IV感染鸡胚具有较好的预防和治疗保护作用,其预防和治疗作用随药物浓度降低而有所减弱;银翘散提取物、玉屏风颗粒联合应用比单药对IV感染鸡胚保护作用略强,但无显着性差异,且给药先后顺序对血凝效价因数结果无显着影响。4.银翘散提取物、玉屏风颗粒对IV感染鸡胚的预防和治疗保护作用与西药利巴韦林相当,未体现明显优势。5.银翘散提取物、玉屏风颗粒及双表法组在不同时点均能不同程度阻断流感小鼠肺组织中TLR4和NF-κB P65蛋白的高表达、抑制TLR4和NF-κB P65 mRNA的高表达。6.银翘散提取物、玉屏风颗粒及双表法组在病变过程中大部分时点对TLR4和NF-κB P65高表达的抑制作用强于西药利巴韦林,双表法抑制作用最强。7.辛凉解表法、益气固表法及双表法对流感病毒感染小鼠的防治作用与抑制流感病毒感染小鼠肺组织TLR4-NF-κB P65信号通路的过度活化有关。8.高效液相色谱法同时测定银翘散全方不同提取方法提取物中五种活性成分,方法简便,重现性好。银翘散全方指纹图谱共有26个共有指纹峰,分别归属银翘散全方中九味药材;共有峰的相对保留时间及峰面积比值,可以为明确银翘散复方抗IV作用物质基础提供重要依据。
李云静[7]2010年在《小柴胡汤及其拆方抗流感病毒作用的体外实验研究》文中进行了进一步梳理目的小柴胡汤出自《伤寒论》,由柴胡、黄芩、半夏、生姜、人参、炙甘草、大枣七味药组成,全方药虽七味,但配伍得当,组方严谨,具有寒热并用,攻补兼施,升降协调,和解少阳,疏利叁焦,调达气机,宣通内外,运转枢机的作用。现代临床常用于呼吸系统疾病和传染病,如：上呼吸道感染、流行性感冒、不明原因发热、流行性腮腺炎、流行性结膜炎等。流行性感冒是由流感病毒所引起的急性呼吸道传染病,可造成世界性大流行。近年来由于流感病毒的肆虐,迫切需要新型的抗流感新药,而流感病毒的抗原又不断变异,使得西药难以发挥理想的作用。本课题的创新之处在于,将传统中医药理论与现代科学技术方法相结合,在前期体内实验的基础上,借助血清药理学和细胞培养技术,进一步通过体外实验,研究小柴胡汤及其配伍组对流感病毒的抑制作用,研究小柴胡汤及其拆方抗流感病毒的作用机制,以及各配伍组之间的药理协同作用机理。本实验研究对于揭示经方配伍治疗的科学性和严谨性,弘扬祖国传统中医药学,发掘祖国传统中医药学宝库,为临床用方提供有力的理论依据,都具有重要的意义。方法本实验应用血清药理学和细胞培养技术,研究小柴胡汤及各配伍组的细胞毒性和抑制流感病毒的作用。观察小柴胡汤全方组及其各配伍组对流感病毒肺适应株的抑制作用。具体方法如下：1、将Wistar大鼠16只,随机分为8组,分别灌服相应组别药物,制备含药血清以备后期实验用。2、猪肾细胞常规保存、传代,测定流感病毒滴度,得到病毒的TCID50,以备后期实验时使用。3、含药血清对细胞的毒性测试：将8组含药血清分别加入单层细胞悬液中3天后MTT法,570nm波长比色测OD值,比较不同浓度含药血清对细胞生长的影响,以确定下一步实验中含药血清的加入量。4、体外抗病毒作用观察：将100TCID50的甲型流感病毒液接种于长成单层的猪肾细胞上,置37℃、5%CO2培养箱内吸附2小时后,小心吸去病毒液,用PBS洗涤3次,分别加入最终浓度为10%的8组含药血清,每组设四个平行孔。药物与细胞作用3天后,MTT法570nm波长比色测OD值,计算抑制百分率。结果1、比较各组不同浓度的含药血清对猪肾细胞的毒性测定可以看出,各组药物随着含药血清浓度的增加细胞呈增殖生长。但各组除了在10%的浓度与正常对照血清组无差异外,在5%、20%、40%的浓度时均与正常对照血清组存在差异。可能是由于血清比例低时,各组含药血清中血药浓度偏低；血清比例高时,血药浓度已经饱和,而血清中的球蛋白在补体中或其它物质成分作用下,可产生细胞毒而对细胞有损害。为便于以下实验比较,确定下一步实验含药血清的浓度为10%。2、小柴胡汤全方组对流感病毒有明显抑制作用,其他各拆方组中含有柴胡、黄芩的各组对流感病毒的抑制作用明显高于不含柴胡、黄芩的各组,表明小柴胡汤可以有效抑制流感病毒,柴胡、黄芩在抗流感病毒中发挥了重要的作用。结论应用血清药理学研究中药复方体外抗病毒实验,体外实验条件可控性强.药物效应易于检测、可深入揭示药物作用的机理；综合本实验结果,小柴胡汤具有明显的抗流感病毒作用,毒副作用小,其作用优于各拆方组；在小柴胡汤方剂中,以柴芩配伍的各组抗流感病毒的作用最强。表明在该方剂中,主要成分柴胡,黄芩在抗流感病毒感染环节中可能起着主要的作用,生姜、半夏、人参、大枣、炙甘草对流感病毒没有明显的抑制作用,但在整体抗流感病毒作用中不是完全没有作用,其机理有待在下一步实验中探讨。
曾丽娟[8]2016年在《连花清瘟胶囊拆方抗流感病毒药理机制研究》文中研究表明目的：通过研究连花清瘟胶囊拆方(麻杏石甘汤和银翘散加减方)抗流感病毒的药理作用特点,探讨连花清瘟胶囊的组方特点及药理作用。方法：1)以奥司他韦为阳性对照药,细胞病变法(CPE)和MTT法体外检测连花清瘟胶囊拆方(麻杏石甘汤和银翘散加减方)对流感病毒的调节作用及对细胞的保护作用；2)以GAPDH为内参基因,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)和ELISA法检测流感病毒感染后24小时,药物对炎性细胞因子及趋化因子mRNA水平和蛋白水平的调节作用；3)免疫印迹法(Western blotting)检测流感病毒感染后,药物对相关信号通路NF-KB-p65的调节作用；4)用流感病毒A/PR/8/34(H1N1)标准株滴鼻感染小鼠建立小鼠感染模型,随机分为正常对照组、模型对照组、奥司他韦组(60mg/kg/d),麻杏石甘汤高剂量组(1000mg/kg/d)、中剂量组(500mg/kg/d)、银翘散加减方高剂量组(800mg/kg/d)、中剂量组(400mg/kg/d),观察小鼠的一般情况,如体重变化、活动状态、毛发、食欲等,测定肺指数、肺病毒滴度及肺组织病理。结果：1)CPE和MTT实验结果显示,麻杏石甘汤对不同亚型的人流感及禽流感病毒株(H1N1、 H3N2、H6N2、H9N2、FluB)都有明显的抑制效果,而银翘散加减方体外并未显示直接的抗流感病毒作用；2)qPCR及ELISA实验结果显示,麻杏石甘汤和银翘散加减方都能抑制流感病毒感染后诱导产生的过高的细胞因子及趋化因子(IP-10、IL-6、IL-8、MIG、CCL5、TNF-α等)的表达,对EP-10、IL-6的下调作用更明显,与病毒组比较p<0.001；3)Western blotting实验结果显示,麻杏石甘汤在3～0.38mg/ml时能下调流感病毒感染后诱导的NF-KB-p65的磷酸化表达,并且这种下调作用与药物浓度呈梯度关系,随着药物浓度的降低下调作用逐渐减弱；银翘散加减方在2-0.25mg/ml对NF-KB-p65的磷酸化表达也显示出下调作用；4)麻杏石甘汤高剂量和中剂量组对流感病毒感染后小鼠的肺指数增高均有显着的降低作用(p<0.001)；银翘散加减方中剂量组对流感病毒感染后小鼠的肺指数增高有显着的降低作用(p<0.01),高剂量组对肺指数增高未显示降低作用。结论：连花清瘟胶囊拆方中麻杏石甘汤体外具有直接抗流感病毒及下调流感病毒感染后上升的细胞因子及趋化因子的双重作用,体内对流感病毒感染后小鼠肺损害具有抑制作用,可能的作用机制是麻杏石甘汤抑制了NF-KB-p65信号通路的磷酸化表达,继而抑制了流感病毒的复制及调节宿主免疫应答反应；银翘散加减方体外并未显示直接抗流感病毒作用,但是能够下调流感病毒感染后上升的细胞因子及趋化因子的表达,下调了NF-KB-p65信号通路的磷酸化表达,体内对流感病毒感染后小鼠肺损害具有抑制作用,其作用机制可能是通过抑制NF-KB-p65信号通路的磷酸化表达而抑制炎性因子的过度表达。
孙丽平[9]2007年在《银翘散主要药物活性成分调节流感病毒感染小鼠免疫失衡的实验研究》文中进行了进一步梳理目的：进行银翘散主要药物金银花、连翘、牛蒡子及其配伍提取物中抗病毒活性成分的定性与定量研究，并研究药物对流感病毒诱导小鼠肺炎的治疗作用，包括抗流感病毒的配伍关系、时效关系及量效关系，初步探讨药物调节流感病毒感染小鼠免疫失衡、抗流感病毒感染的作用机制，为运用中医药防治小儿流感提供理论和实验依据。方法：采用薄层色谱法进行银翘散主要药物金银花、连翘、牛蒡子及其配伍醇提物中抗病毒活性成分的定性研究，并采用HPLC进行上述成分的定量研究。应用鼻腔感染流感病毒诱导小鼠流感病毒肺炎模型，分别进行药物配伍关系、时效关系及量效关系实验，并与正常对照组、病毒对照组、病毒唑组对比观察，研究药物对小鼠一般状态、肺指数、肺组织病理改变的影响；采用RT-PCR技术检测各组小鼠给药后肺组织中流感病毒RNA复制及IFN-γmRNA的表达情况，探讨药物抑制病毒复制和诱生干扰素的作用；ELISA法检测肺组织IL-2，IL-12含量；免疫组化法检测肺组织中IFN-γ和IL-4蛋白表达，探讨药物抗流感病毒感染的细胞免疫机制以及对T细胞亚群平衡的影响。结果：1．银翘散主要药物活性成分的定性实验研究表明，银翘散主要药物醇提物中均含有抗病毒成分绿原酸、连翘苷及牛蒡苷，并应用HPLC进行了定量研究，证明了单味药含有上述成分最高。2．病毒唑与银翘散主要药物均有一定的抗流感病毒作用，与病毒感染对照组相比，可降低肺指数；改善小鼠肺病理变化；流感病毒RNA复制减少及IFN-γmRNA的表达适度增加。ELISA法及免疫组化检测各组小鼠T细胞亚群中Th1因子IL-2、IL-12、IFN-γ分泌增加，Th2因子IL-4分泌减少。①药物配伍关系研究表明：一般状态：正常对照组动物状态最好，以后依次是病毒唑组、1号药组、2号药组、3号药组、4号药组、5号药组、6号药组、7号药组，病毒对照组状态最差。肺指数：与正常对照组比较，病毒对照组有显着差异(P＜0.05)。与病毒对照组比较，中药各组与病毒唑组均有显着差异(P＜0.5)。与病毒唑组相比，中药1号药组、2号药组、3号药组、4号药组、5号药组、6号药无显着差异(P＞0.05)，7号药组有显着差异(P＜0.05)，说明中药与病毒唑均可减轻肺指数。肺组织外观：正常对照组肺组织外观良好，其次是病毒唑组、1号药组、2号药组、3号药组、4号药组、5号药组、6号药组肺组织外观相似，7号药组较其它中药组略重，以病毒对照组肺组织外观改变最大。肺病理：正常对照组无异常，表现为肺泡腔大小较一致，管腔无分泌物，肺泡壁不增厚；病毒唑组改变最轻，肺泡壁上有少量毛细血管扩张充血，少量炎细胞浸润，肺泡壁略增厚。1号药组肺泡壁上有毛细血管扩张充血，较西药组略重。其余各组2号药组、3号药组、4号药组、5号药组、6号药组、7号药组改变较1号药重，表现为单核细胞浸润，肺泡壁增厚，有多个单核细胞浸润，较模型组明显减少。其中7号药组改变相对严重。病毒对照组肺病理改变最重，表现为支气管上皮脱落，管壁血管扩张充血，有炎细胞浸润；肺泡壁毛细血管扩张充血，有大量单核细胞浸润。RT-PCR检测病毒核酸，除正常对照组外，各组药物肺组织中均有Ⅳ—RNA表达，与正常对照组比较，病毒对照组有显着差异，P＜0.05。与病毒对照组比较，中药各组与病毒唑均有显着差异，说明干预药物均可抑制病毒复制。与病毒唑比较，1号药无显着差异(P＞0.05)，余中药组有显着差异(P＜0.05)。RT-PCR检测IFN-γmRNA表达，正常组有少量产生，其余各组小鼠IFN-γ均有所升高，与病毒对照组比较，各中药组和病毒唑有显著差异(P＜0.05)，与病毒唑组比较，中药各组水平不同，1号药组、2号药组、3号药组、5号药组、6号药组无显着差异(P＞0.05)，4号药组、7号药组有显着差异(P＜0.05)。②1号药时效关系研究表明：1号药与西药病毒唑均有抗流感病毒作用，在小鼠流感病毒感染后不同时间，对其一般状态、肺指数、肺部外观、病理改变以及肺组织IL-2，IL-12含量的影响不同。1d：与正常对照组比较，各组小鼠肺指数无明显增加(P＞0.05)，说明流感病毒感染后一天，尚未引起小鼠肺肿大。各组小鼠肺组织外观无差异。病毒对照组肺病理开始有变化，肺泡壁略增厚，有单核细胞浸润。其余各组肺组织病理改变不明显。正常对照组有少量IL-2分泌，与之比较，病毒对照组无显着差异(P＞0.05)，1号药组、病毒唑组开始增高，与正常组比较有显着差异(P＜0.05)，但两者之间无显着差异(P＞0.05)。正常对照组有少量IL012分泌，与之比较，各组之间IL-12分泌有显着差异(P＜0.05)；与病毒对照组比较，各组均有显着差异(P＜0.05)。3d：与正常对照组比较，各组小鼠肺指数均有所增加，有显着差异(P＜0.05)，说明小鼠感染流感病毒3d后，病毒在肺组织中已增殖引起炎症反应导致肺肿大。与病毒对照组比较，病毒唑组和1号药组肺指数均降低。说明病毒唑和1号药均能减轻小鼠肺部炎性病变。肺组织外观正常对照组无变化，其余叁组开始出现变化，依病毒唑组、1号药组、病毒对照组逐渐加重。正常对照组肺病理无异常；病毒对照组肺泡壁增厚，有单核细胞浸润；1号药组与病毒唑改变相似，表现为肺泡壁略增厚，有单核细胞浸润。与正常对照组比较，流感病毒感染后，各组小鼠分泌IL-2上升(P＜0.05)；与病毒对照组比较，1号药组、病毒唑组分泌IL-2显着提高(P＜0.05)，此两组之间亦有显着差异(P＜0.05)。与正常对照组比较，流感病毒感染后，各组小鼠分泌IL-12与1d不同，数值均有所升高，但1号药较病毒唑组和病毒对照组升高明显。与病毒对照组比较，1号药组、病毒唑组有显着差异(P＜0.05)，此两组之间亦有显着差异(P＜0.05)，1号药组分泌量增多。5d：与正常对照组比较，病毒对照组肺指数明显增加(P＜0.05)，说明小鼠感染流感病毒后肺部炎症明显。与病毒感染模型组比较，病毒唑组和1号药组肺指数均降低(P＜0.05)。说明病毒唑和1号药均能显着减轻小鼠肺部炎性病变。肺组织外观：正常对照组仍无变化，其余叁组变化较大，依病毒唑组、1号药组、病毒对照组逐渐加重。肺病理：正常对照组无异常；病毒对照组表现为肺泡壁增厚，有大量单核细胞浸润，形成实变区。1号药组支气管周围有部分肺泡壁增厚，有单个核细胞浸润，病变与病毒对照组相比有明显减轻；病毒唑组改变最轻，支气管周围有单个核细胞浸润，与病毒对照组相比有明显减轻。与正常对照组比较，病毒对照组有显着差异(P＜0.05)；与病毒对照组比较，1号药组、病毒唑组分泌IL-2显着提高(P＜0.05)，此两组之间亦有显着差异(P＜0.05)。各组小鼠分泌IL-12值均有下降趋势，与病毒对照组比较，1号药组、病毒唑组有显着差异(P＜0.05)，此两组之间无显着差异(P＞0.05)。③1号药量效关系研究表明：一般状态：正常对照组动物状态最好，以后依次是病毒唑组，1号药不同剂量组基本相同，病毒对照组状态最差。肺指数：与正常对照组相比，病毒对照组小鼠肺指数明显增加(P＜0.05)，说明小鼠感染流感病毒后肺肿大明显。1号药不同剂量与病毒唑组对小鼠感染流感病毒后肺肿大均有抑制作用，组间无明显差异，P＞0.05。肺组织外观：同配伍实验研究结果相同，中药不同剂量各组间无明显异常。肺病理：正常组与病毒对照组肺组织病理改变与配伍实验研究结果相同。各组小鼠肺病变程度，正常对照组肺病理无改变。与病毒感染模型组相比，1号药不同剂量对肺脏大体病变、组织病理学方面无显着差异。病毒对照组病理变化最重，病毒唑组改变最轻。RT-PCR检测病毒核酸，正常组未检测出流感病毒核酸，中药各组与病毒唑组表达水平下降，说明药物具有抑制病毒复制作用，1号药不同剂量组间比较无显着差异(P＞0.05)，中药各组与病毒唑组比较亦无显着差异(P＞0.05)，说明中药具有与病毒唑相近的抗流感病毒作用。同法检测各组小鼠肺组织均有IFN-γmRNA表达，正常对照组有少量表达，其余各组均有所增高。与病毒对照组比较，中药各组与病毒唑组有显着差异(P＜0.05)；与病毒唑组比较，1号药各剂量组无显着差异(P＞0.05)。ELISA法检测肺组织细胞因子含量：1号药不同剂量与病毒唑均可促进IL-2分泌，与病毒唑组比较，1号药不同剂量组有显着差异(P＜0.05)，病毒对照组IL-2含量明显下降，与之相比，各药物治疗组有显着差异(P＜0.05)。1号药不同剂量与病毒唑均可促进IL-12分泌，与病毒唑组比较，1号药低剂量组、中剂量组无显着差异(P＞0.05)，病毒对照组含量明显下降，与各药物治疗组比较有显着差异(P＜0.05)。免疫组化：检测各组小鼠的IFN-γ表达，正常对照组平均灰度值低，说明有少量IFN-γ蛋白表达，其余各组阳性目标平均灰度值均增加，与病毒对照组相比，1号药不同剂量和病毒唑组阳性目标平均灰度值增加，中药各组与病毒唑组比较无显着差异(P＜0.05)。正常对照组有少量IL-4分泌，病毒对照组表达明显增加(P＞0.05)。与病毒对照组比较，1号药不同剂量和病毒唑组可抑制IL-4表达，中药各组与病毒唑组比较有显着差异(P＜0.05)，中药各组间无显着差异(P＞0.05)。结论：银翘散中主要药物金银花、连翘、牛蒡子及其配伍具有较好的抗流感病毒作用，其机制可能是：1．抑制病毒复制，减轻免疫损伤：降低肺指数，抑制流感病毒在小鼠肺部的复制，减轻了病毒对肺组织的直接损伤；2．增强抗感染细胞免疫：通过调控和T淋巴细胞亚群Th1细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-12，Th2亚群细胞因子IL-4的分泌，发挥免疫调节作用，提高细胞免疫应答水平，增强抗病毒能力。本实验证明中药应用剂量与疗效无相关性。因此我们得出结论，银翘散具有抗流感病毒、调节免疫失衡作用，对增强抗病毒细胞免疫发挥一定作用。
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