（海口市制药厂有限公司 海南 海口 570311）
【摘要】目的：建立托匹司他片的微生物限度检查的方法。方法：按中国药典2010 年版二部附录提供的微生物限度检查法的要求进行验证，以回收率对方法有效性进行评价。结果：该种方法对5种阳性代表菌株的回收率均达70%以上。结论：本品细菌、霉菌及酵母菌检查可用平皿法，大肠埃希菌检查可用常规法。
【关键词】托匹司他片；微生物限度检查；验证
Validation of Microbial Limit Test of Topiroxostat Tablet
WEN Ping
（Haikou city pharmaceutical Co., LTD.，Hainan haikou 570311）
【Abstract】Objective：To establish the microbial limit test for Topiroxostat Tablet, Methods:The method for microbiallimit examination in Chinese Pharmacoporia, centrifugal-medium dilution was followed. And its validity was evaluated by recovery． Results The recovery of all 5 group of positive representative microbial strains were over 70%. Conclusion The aerobic plate-count can be used to test the count ofBacterial 、 Molds and yeasts．Escherichia coli of levodopa can be examined by routine test method．
Key words: topiroxostat tablet; antibacterial activity; microbial limit
托匹司他片是新药3类新产品，为非嘌呤类黄嘌呤氧化酶抑制剂，对氧化型和还原型的黄嘌呤氧化酶均有抑制作用，抑制尿酸的生成，与传统药物别嘌呤醇(嘌呤类似物)相比，不会影响嘌呤及吡啶代谢及其酶的活性，不需要重复大剂量给药来维持较高的药物水平，不良反应相对较少。建立该产品的微生物限度检查方法，并对其有效性进行评价。为了确认检查方法的可靠性，有效地控制产品的质量，本文按照《中国药典》(2010 年版) 进行验证，建立了该产品的微生物限度检查方法。本研究结果准确，为有效地控制产品质量提供参考。
1 实验材料
1.1仪器及样品
岛津UX6200H 型电子天平、LDZX-40SB1 立式自动压力蒸汽灭菌器、上海一恒LRH-250L生化培养箱、上海一恒BHP-9162恒温培养箱、BHC-1300ⅡA2生物安全柜、上海博讯VS-480-1洁净工作台、托匹司他片。
1.2培养基、稀释剂及试剂
营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、MUG培养基、胆盐乳糖培养基、改良马丁琼脂培养基、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、红四氮唑、靛基质试液。
1.3试验用菌种
大肠埃希菌(CMCC（B）44102) 、金黄色葡萄球菌(CMCC（B）26003) 、枯草芽孢杆菌(CMCC（B）63501)、白色念珠菌(CMCC（F）98001) 、黑曲霉(CMCC（F）98003，以上菌种均来源于中国生物制品检定所。所有菌种均为不超过5 代的菌株。
2.方法
2.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证
2.1.1菌液制备
(1) 接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养琼脂培养基上，33℃培养24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基上，25℃培养24小时。上述培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50cfu～100cfu的菌悬液。
(2) 接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，25℃培养7天，加入3ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。过滤菌丝吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50cfu ～100cfu的孢子悬液。
2.1.2供试液制备
取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇至供试品分散均匀，制成1：10的供试液。取1:10的供试液1ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9ml，即为1:100的供试液，取1:100的供试液1ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9ml，即为1:1000的供试液。
2.1.3菌落计数方法验证试验
(1) 菌液组：分别取菌液1ml，采用平皿计数法，测定上述制备好的菌液中每毫升的活菌数，测定结果见表1。
(2) 供试品对照组：取1：100的供试液1ml，注入平皿中，测定供试品本底的细菌数，测定结果见表4。取1：10的供试液1ml，注入平皿中，测定供试品本底的霉菌和酵母菌数，测定结果见表2。
(3) 试验组：取1：100的供试液1ml和上述细菌菌液1ml（50cfu ~100cfu 试验菌），分别注入同一平皿中，测定结果见表3，回收率见表4。另取1：10的供试液1ml和上述真菌菌液1ml（50cfu ~100cfu 试验菌），分别注入同一平皿中，测定结果见表3，回收率见表4。
(4) 稀释剂对照组：因本品未采用特殊的方法处理，故稀释剂对照组可不进行验证。
上述已注入供试液的平皿（其中试验组在注入供试液和菌液后应立即倾注培养基），细菌计数，倾注营养琼脂培养基，待凝固后，置33℃培养3天，逐日观察结果，霉菌和酵母菌计数，倾注玫瑰红钠琼脂培养基，待凝固后，置25℃培养5天，逐日观察结果。
2.1.4计算
试验组的菌落回收率（%）=
稀释剂对照组的菌数回收率（%）=
2.1.5结果
表1 菌液组菌落计数（cfu/ml）
经上述实验验证，采用上述方法草案进行本品的细菌计数、霉菌和酵母菌计数可使回收率达到要求。
2.2控制菌检查方法的验证
2.2.1菌液制备
接种大肠埃希菌的新鲜培养物至营养琼脂培养基上，33℃培养24小时。用0.9％无菌氯化钠溶液9ml制成每1ml含菌数为10cfu～100cfu菌悬液。
2.2.2大肠埃希菌检查方法的验证
（1）供试品组：取1：10的供试液10ml，加至胆盐乳糖培养基100ml中，置33℃培养24小时。
（2）阴性对照组：取稀释液10ml，加至胆盐乳糖培养基100ml中，置33℃培养24小时。
（3）阳性对照组：取1：10的供试液10ml，加至胆盐乳糖培养基100ml中，加入上述大肠埃希菌菌液1ml（10cfu ~100cfu），置33℃培养24小时。
取上述培养物各0.2ml，分别加入含5ml的4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）试管中，置33℃培养5小时～24小时，观察结果。
2.2.3结果
表5 大肠埃希菌检查结果
表5结果显示，阳性对照菌生长良好，表明本品在该条件下对大肠埃希菌无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计。说明采用该法进行本品的大肠埃希菌检查可行。
2.3方法验证结论
本品的细菌、霉菌及酵母菌检查可用平皿法，大肠埃希菌检查可用常规法。
3讨论
根据中国药典2010年版二部附录Ⅺ J微生物限度检查法规定，在3次独立的平行试验中，若试验组的菌落回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数，因此，该法适用于托匹司他片的微生物检验。
参考文献
[1]梁宝英、朱映萍、李咏华 .左旋多巴微生物限度的检查方法的验证 [j]，今日药学， 2011；21（1）
[2]国家药典委员会，中国药典（二部），[M]，北京；中国医药科技出版社，2010；107-116
论文作者:温平
论文发表刊物:《健康世界》2015年6期
论文发表时间:2015/9/28
标签：培养基论文; 琼脂论文; 氯化钠论文; 方法论文; 大肠论文; 酵母菌论文; 回收率论文; 《健康世界》2015年6期论文;