宋淑珍[1]2007年在《绵羊性别鉴定PCR方法的研究》文中研究指明本文通过对绵羊性别决定基因检测多重和巢式PCR体系的建立及优化、性染色体引物的特异性检测，建立了绵羊性别决定基因检测的PCR方法，并讨论了影响PCR扩增的几个因素以及它们之间的相互关系。主要内容包括：(1)从GenBank中检索到长度为723bp的绵羊SRY基因序列作为Y染色体特异序列，长度为3249bp的β-B-珠蛋白基因作为常染色体内标基因序列，利用Primer 3软件，设计了长度均为20bp性染色体巢式引物SRY337、SRY193和常染色体的巢式引物G559、G278。(2)对所设计的引物进行筛选组合，建立了绵羊早期胚胎性别鉴定的多重和多重巢式PCR反应体系。(3)对多重PCR体系用4×3×4因子组合析因设计实验(dNTP的终浓度分别为100μM、200μM、300μM、400μM；Mg2+浓度分别为1.5mM、2mM、2.5mM、3mM：温度分别为58℃、60℃、62℃)确定了dNTP浓度、Mg~(2+)浓度和温度的最优组合，优化了扩增程序。对巢式PCR体系第二轮扩增进行了不同dNTP浓度、Mg~(2+)浓度和温度、以及不同扩增程序的筛选和优化。(4)用本试验中所采用的SRY巢式引物分别对人、牛、兔基因组DNA及淋巴细胞缓冲液进行扩增，检测引物的特异性和分析性别鉴定过程中可能存在的污染因素。绵羊肝组织基因组扩增结果表明：公羊可同时扩增出性染色体和常染色体片段，而母羊只能扩增出常染色体片段，引物特异性高，外引物间、内引物间扩增温度相差不大，可进行多重扩增。通过析因试验筛选的最优多重PCR性别鉴定体系为：SRY337、G559的浓度分别为0.4州，Mg~(2+)为2.0 mM，dNTP为300μM，Taq酶1U，10×PCR Buffer为2.5μl，扩增体系25μl；扩增程序：94℃预变性3min—{94℃变性20s—58℃退火30s—72℃延伸20s}30个循环—72℃延伸3min—4℃保存。优化后的多重PCR体系扩增公羊肝组织基因组，灵敏度为100pg。在巢式PCR中，以建立的最优多重PCR体系进行第一轮扩增20个循环后，析出5μl进行第二轮扩增，其最优反应体系为：SRY193、G278浓度均为0.4μM，Mg~(2+)为2.0 mM，dNTP为200μM，Taq酶1U，10×PCR Buffer为2.5μl，扩增体系25μl；扩增程序：94℃预变性3min—{94℃变性20s—64℃退火延伸20s—}30个循环—72℃延伸3min—4℃保存。本多重巢式PCR性别鉴定体系的灵敏度为100fg(1个细胞约5pg)，4细胞的DNA就可扩增鉴定结果，总鉴定时间约为110min。特异性检测结果表明：SRY基因引物只对羊、牛雄性特异，其他动物雄性DNA及淋巴细胞缓冲液均不影响检测结果。本实验所建立的巢式PCR体系相对简单、快速、准确率高，完全可以在生产实践中用来鉴定绵羊性别。
肖海霞[2]2006年在《应用PCR法和LAMP法鉴定牛早期胚胎性别的研究》文中研究表明在畜牧业生产实践中，往往需要人为控制家畜的性别及比例，加速优良品种繁育，扩大优良母畜的利用率，因而，性别控制技术在畜牧生产上具有重要的意义。随着农业产业化的进程，特别是牛羊胚胎工程产业化的迅速发展，运用性别控制技术来加快这种产业化的进程显得越来越重要。本研究旨在通过用PCR法、LAMP法进行牛早期胚胎性别鉴定的研究和应用，从而确立可以在实际应用中被推广的性别控制方法，提高养殖场和农户的经济效益，进而推动新疆乃至全国养牛业的发展。本研究主要做了以下方面的研究： 1．通过设计特异性引物，改变Mg~(2+)浓度、退火温度、调整循环条件等影响PCR的因素，并且经过不同样品的验证，最终确定适合生产实践的PCR反应体系为： 双重PCR反应体系总体积为25μl：2.5μl 10×Buffer，1.5mM Mg~(2+)，0.2mM dNTP，2U TaqDNA聚合酶，性控引物浓度为0.4μM(P0)，内标引物浓度为0.15μM(P4)(性控和内标引物可单独加入同一反应液里)。94℃预变性5min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30s；72℃延伸5min，33个循环。 巢式PCR第一次反应体系总体积为10μl：1μl 10×Buffer，2.5mM Mg~(2+)，0.2mM dNTP，1U TaqDNA聚合酶，各引物浓度(P1，P5)为0.1μM。94℃预变性4min，94℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 30 s；72℃延伸2min，20个循环；第二次反应体系总体积为20μl，2μl10×Buffer，2.5mM Mg~(2+)，0.2 mM dNTP，2U TaqDNA聚合酶，各引物浓度均为0.25μM。94℃预变性5min，94℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃30 s；72℃延伸5min，30个循环。 通过不同样品的试验和46枚胚胎现场的应用，证明建立的PCR胚胎性别鉴定方法可用于生产实践。 2．LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)法是一种新的基因扩增技术，具有简便、准确、灵敏、快速的特点；通过不同样品、现场126枚常规胚胎和42枚性控胚胎的鉴定，结果证明该方法可应用于牛早期胚胎性别鉴定。 3．PCR法和LAMP法所鉴定同一样品的结果是吻合的，说明在控制好实验条件的情况下，根据实际情况可选用这两种方法的任何一种进行牛早期胚胎的性别鉴定应用。
张伟[3]2007年在《PCR法鉴定牛早期胚胎性别的研究》文中研究表明PCR技术为胚胎的性别鉴定提供了新的手段。利用PCR进行胚胎的性别鉴定具有快速、灵敏、准确和易操作等诸多优点,是各种胚胎性别鉴定技术中最有前景的一项技术。本实验以提高鉴定的灵敏度、减少鉴定时间及建立胚胎性别鉴定的可操作程序为指导进行实验的设计,分别做了以下探讨,并取得了预期的结果:1.利用牛性别决定基因(SRY)作为雄性特异性基因和酪蛋白αs1基因(CSN1S1)作为内标基因分别设计雄性特异性引物和内标引物,两对引物均各设计一对嵌套式引物进行多重PCR,并同时对外引物组合和内引物组合进行体系的优化,以便用于牛早期胚胎性别鉴定。SRY基因和CSN1S1基因外、内引物扩增片断长度分别为357bp、232bp、528bp和367bp。实验结果表明,这两个引物组合建立的扩增体系均有较高的扩增稳定性和准确率,但它们的灵敏度均不高(约50pg,相当于16个细胞的DNA量),这在一定程度上限制了其在胚胎性别鉴定中的应用。2.由于SRY基因和CSN1S1基因建立的多重巢式PCR体系的灵敏度无法满足胚胎性别鉴定的要求,故在以上优化体系为基础的基础上,建立巢式PCR体系,以提高扩增的灵敏度。经反复实验,该体系的灵敏度可达到一个细胞的DNA量,完全可以用于牛早期胚胎的性别鉴定。3.由于SRY基因为单拷贝基因,当胚胎性别鉴定时,所采得细胞数很少时,体系中SRY基因的相对量就较少,这大大的限制了其灵敏度。故在选择Y染色体上的一段重复序列作为雄性特异性引物,以肿瘤坏死因子(TNFα)为内标引物建立多重PCR,进行牛早期胚胎性别鉴定。共设计四对引物—Y染色体重复序列外引物和内引物其大小分别为534bp和480bp,肿瘤坏死因子外引物和内引物大小分别为357bp和272bp。试验结果表明,优化后的多重PCR体系的灵敏度可达到叁个细胞,可以满足胚胎性别鉴定的需要。4.虽然Y染色体重复序列和肿瘤坏死因子(TNFα)基因建立的多重PCR体系的灵敏度较高,但在细胞数较少时,电泳条带很弱,且较不稳定。故建立多重巢式PCR。如上所述,其灵敏度也可达到一个细胞,且稳定性很好。
付强[4]2006年在《水牛SRY基因及胚胎性别鉴定技术的研究》文中进行了进一步梳理本论文研究内容是水牛SRY基因和胚胎性别鉴定PCR体系的建立和优化。论文共分为两部分：第一部分，包括第一章和第二章，为文献综述部分；第二部分，包括第叁章和第四章，为试验研究部分。 第叁章研究目的是通过对水牛SRY基因的克隆、序列分析及Southern杂交检测，为进一步研究SRY基因的作用机理和设计特异于水牛SRY基因的胚胎性别鉴定引物打下基础。根据荷斯坦牛SRY基因设计一对引物，PCR扩增后得到水牛SRY基因，测序后分析表明，该基因长度为2005bp，其中1～504bp为5’启动子区(Promoter)，1196～2005bp为3’侧翼序列(UTR)，505～1195bp为SRY的读码框(ORF)。将该基因序列提交到GenBank数据库(登录号为DQ 417872)。BLAST比对显示，与牛属动物的同源性为95％～96％，其中HMG-box区的同源性高达99％，具有高度的进化保守性。使用ClustalX对水牛SRY基因外显子区域做多重比对分析后，构建部分哺乳动物系统进化树，与实际进化关系保持很好的一致。在SRY基因保守区设计探针，分别对雄性水牛和雌性水牛基因组进行Southern杂交，只在雄性水牛出现杂交信号，说明SRY基因为雄性特异。 第四章研究目的是建立并优化水牛胚胎性别鉴定的PCR体系，以便该项技术能在生产中大规模应用。根据第叁章中水牛SRY基因核心序列设计两对特异于水牛的性别鉴定引物SA1／SA2、SB1／SB2，根据小鼠ZFX／ZFY基因和水牛G3PDH基因分别设计内参引物ZA1／ZA2、GA1／GA2。对不同
辛晓玲[5]2003年在《牛早期胚胎性别鉴定的研究》文中提出本试验应用聚合酶链式反应技术进行牛早期胚胎的性别鉴定，就PCR引物检测、胚胎DNA样品扩增、胚胎的切割取样量对胚胎生活力的影响及鲜胚移植情况等方面进行了研究，另外，探讨了4种体外培养系统对牛体外受精胚胎性比的影响。结果表明： 1、用y-染色体特异性引物扩增比利时兰白花公牛与中国荷斯坦奶牛的血液白细胞DNA样品，公牛的血液样品扩增产物出现一条明显的226bp的条带，检测并证明了本研究所采用雄性特异性引物的可靠性。 2、以牛血液DNA样品为阳性对照，蒸馏水为阴性对照，用一对y-染色体特异性引物成功地对胚胎DNA样品进行了扩增；同时，引入一对常染色体引物，有效地防止了由于胚胎样品丢失等原因形成的假阴性现象。 3、经4种不同体外培养系统比较发现，添加5％FCS的改良SOF液中受精卵的卵裂率达84.2％，并且添加血清的mSOF液和M199+GCM共培养系统的囊胚发育率显着高于不添加血清的2组培养系统的囊胚发育率，因此添加血清的mSOF液比较适合受精卵的体外发育培养。 4、添加血清的两组培养系统中所得雄性囊胚与雌性囊胚的性比虽偏离了1:1的性比，但差异并不显着(P＞0.05)，而总的体外胚胎的性比则显着偏离了1:1的性比(P＜0.05)。这说明在体外培养系统中雄性胚胎与雌性胚胎发育能力更强，并且血清的存在对于雄性胚胎的发育有明显的促进作用。 5、胚胎切割取样的细胞数量与取样后胚胎的继续发育能力有着密切联系。本研究结果表明，切取10％～20％细胞的胚胎比徒手二分割取样的胚胎继续发育能力显着提高(P＜0.05)。 6、性别鉴定后胚胎的移植结果显示，犊牛性别与胚胎性别鉴定结果完全符合，移植总妊娠率为28.8％。
肖海霞, 陈静波, 海丽且木, 祁志平[6]2006年在《应用PCR法和LAMP法鉴定牛早期胚胎性别的研究》文中研究表明通过设计特异性引物,优化Mg2+浓度、退火温度和循环时间等影响PCR的因素,确定了适合现场应用的PCR反应体系;46枚胚胎现场的鉴定率为87%,移植妊娠率为28%,准确率为85%,证明建立的PCR胚胎性别鉴定方法可用于生产。使用LAMP法对126枚常规胚胎和42枚性控胚胎现场鉴定,鉴定率95%,移植妊娠率33%,准确率88%,结果证明该方法可应用于牛早期胚胎性别鉴定。PCR法和LAMP法所鉴定同一样品的结果一致,说明在控制好实验条件的情况下,根据实际情况可选用这两种方法中的任何一种进行性别鉴定应用。
张志平[7]2006年在《建立牛胚胎体外生产体系和快速鉴定胚胎性别的方法》文中指出本论文主要研究了体外生产牛胚胎和一种新的牛胚胎性别鉴定方法-环介导恒温扩增法,为胚胎生产积累了宝贵的资料。具体内容包括以下几部分:1.本研究比较了牛卵母细胞成熟时间、卵丘-卵母细胞复合体(COCs)的分级、雌激素(E_2)浓度以及来源于不同大小卵泡对卵母细胞成熟效率的影响。结果表明:(1)24 h成熟的卵母细胞卵裂率显着高于21 h和27 h,同时囊胚率也显着提高(P<0.05)。(2)A级和B级卵母细胞的卵裂率和囊胚率显着高于C级和D级卵母细胞(P<0.01))。(3)在成熟液中添加1μL/mL E_2(雌激素)后,卵裂率和囊胚率显着高于10μL/mL组(P<0.01),但与对照组差异不显着。(4)采自2～8 mm卵泡的卵母细胞卵裂率显着高于采自小于2 mm组和大于8 mm组(P<0.01),囊胚率也显着高于小于2 mm组(P<0.05),但与大于8 mm组差异不显着。因此,研究认为卵母细胞成熟24 h,细胞胞质和细胞核都已经充分成熟;A级和B级卵母细胞可用做生产体外胚胎;在成熟液中添加1μL/ mL E_2能增加卵母细胞的核成熟率,但是高浓度则抑制胚胎发育;源于2～8 mm卵泡的卵母细胞成熟24 h后受精,适宜胚胎发育,且发育良好。2.研究了在卵母细胞成熟液中,添加来源于不同直径卵泡液[小(<3 mm)、中(3～6 mm)和大(6～12 mm)]的成熟卵母细胞,观察排出极体和胚胎发育情况。发现在成熟液中添加中、大卵泡液能显着提高卵母细胞的第一极体率(P<0.05),而且添加50%大卵泡,还促进了孤雌激活胚胎的发育,但是降低体外受精胚的卵裂率(P<0.05)。说明添加50%大卵泡液(6～12 mm)对卵母细胞胞质成熟有促进作用,但是不利于受精。为了有效提高卵母细胞的成熟率,本试验分两步进行:第一步,于成熟液中添加50%的大卵泡液,让卵母细胞成熟数小时。第二步,于成熟液中添加10%的FBS,再成熟24 h。结果表明,两步成熟法,有效的提高了胚胎的卵裂率和囊胚率,特别是第一步成熟6 h,获得84.7%卵裂率和44.7%的囊胚率(P<0.05)。3.本试验研究了颗粒细胞在体外受精中的作用。结果表明COCs受精率、卵裂率和囊胚率极显着高于裸卵(P<0.01);颗粒细胞和裸卵混合,受精率和囊胚率显着高于(P<0.05)裸卵组;输卵管上皮或颗粒细胞与裸卵混合后受精,二者卵裂率和囊胚率差异不显着;在受精液中添加100 ng/mL孕酮,COCs组卵裂率和囊胚率没有变化,但是裸卵组,受精率和囊胚率有一定程度的提高;COCs在20% O2的卵裂率和囊胚率比在5% O_2有显着的增加(P<0.05),但是裸卵在这两种气相条件下,没有变化。结果表明,颗粒细胞在体外受精中具有独特作用,尤其是与卵母细胞形成复合体的作用更大。分析是因为受精时,颗粒细胞分泌孕酮和增加氧自由基,从而提高受精效率和后期胚胎发育潜力。
张伟, 王世银, 许芸, 张兆旺[8]2010年在《利用性别决定基因(SRY)进行牛早期胚胎性别鉴定的研究》文中研究指明利用牛性别决定基因(SRY)和酪蛋白αs1基因(CSN1S1)分别设计雄性特异性引物和内标引物,两对引物均各设计一对嵌套式引物进行多重PCR和多重巢式PCR,用于牛早期胚胎性别鉴定。SRY基因和CSN1S1基因外、内引物扩增片断长度分别为357bp、232bp、528bp和367bp。实验结果表明,这两个引物组合建立的多重PCR扩增体系均有较高的扩增稳定性和准确率,但在常规PCR体系中,它们的灵敏度均不高(约50pg,相当于16个细胞的DNA量),这在一定程度上限制了其在胚胎性别鉴定中的应用。而由二者建立的巢式PCR灵敏度可达到5pg,故可以很好地满足胚胎性别鉴定的需要。
唐纪伟[9]2011年在《牙釉质基因鉴定山羊早期胚胎性别的研究》文中提出山羊的牙釉质(AMEL)基因定位于X和Y染色体上的同源区,根据AMEL基因在X和Y染色体同源区上存在不同程度碱基缺失的特点,设计巢式引物,就PCR引物准确性检测、超微量DNA鉴定方法的建立、胚胎DNA扩增及鲜胚移植等方面进行了研究,旨在利用巢式PCR扩增AMEL基因建立一种早期胚胎性别鉴定的方法。研究结果如下:1.对AMEL基因巢式引物的内引物和外引物分别扩增山羊血液基因组DNA,经1.5%的琼脂糖凝胶电泳、EB染色,外引物经扩增后雌性山羊只得到一条349 bp的来自X染色体的扩增条带,而雄性山羊能得到一条源自X染色体的349 bp的扩增条带和一条源自Y染色体的289 bp的扩增条带。内引物经扩增后雌性山羊只得到一条311 bp的来自X染色体的扩增条带,而雄性山羊能得到一条源自X染色体的311 bp的扩增条带和一条源自Y染色体的251 bp的扩增条带。46个山羊血液DNA样本(22F,24M)经性别鉴定后与实际性别比较,准确率为100%(22F/22F,24M/24M)。2.对6只山羊(3F,3M)10 pg量血液基因组DNA(约3个细胞)进行巢式PCR扩增,雌性山羊只得到一条来自X染色体的扩增条带,而雄性山羊能得到一条源自X染色体的扩增条带和一条源自Y染色体的扩增条带。3.利用超数排卵技术获得86枚可用胚胎,36枚胚胎用于性别鉴定,33枚有扩增结果,雌雄性别比为16F/17M;50枚胚胎移植给50只受体山羊,产羔27只,胚胎移植妊娠率为54%(27/50),雌雄比为12F/15M。胚胎性别鉴定的雌雄性别比率与胚胎移植后产羔性别比率无明显差异(P>0.05)。
曾玉峰, 阎萍, 郎侠[10]2008年在《家畜早期胚胎性别鉴定技术的研究进展》文中提出从家畜性别控制的主要途径、早期胚胎性别鉴定主要方法以及在畜牧生产中的应用等方面,详细论述了各技术的基本原理、研究概况及存在问题,并对发展前景提出设想。
参考文献：
[1]. 绵羊性别鉴定PCR方法的研究[D]. 宋淑珍. 甘肃农业大学. 2007
[2]. 应用PCR法和LAMP法鉴定牛早期胚胎性别的研究[D]. 肖海霞. 新疆农业大学. 2006
[3]. PCR法鉴定牛早期胚胎性别的研究[D]. 张伟. 甘肃农业大学. 2007
[4]. 水牛SRY基因及胚胎性别鉴定技术的研究[D]. 付强. 广西大学. 2006
[5]. 牛早期胚胎性别鉴定的研究[D]. 辛晓玲. 西北农林科技大学. 2003
[6]. 应用PCR法和LAMP法鉴定牛早期胚胎性别的研究[J]. 肖海霞, 陈静波, 海丽且木, 祁志平. 新疆农业大学学报. 2006
[7]. 建立牛胚胎体外生产体系和快速鉴定胚胎性别的方法[D]. 张志平. 西北农林科技大学. 2006
[8]. 利用性别决定基因(SRY)进行牛早期胚胎性别鉴定的研究[J]. 张伟, 王世银, 许芸, 张兆旺. 黑龙江动物繁殖. 2010
[9]. 牙釉质基因鉴定山羊早期胚胎性别的研究[D]. 唐纪伟. 塔里木大学. 2011
[10]. 家畜早期胚胎性别鉴定技术的研究进展[J]. 曾玉峰, 阎萍, 郎侠. 安徽农业科学. 2008
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