长沙医学院中医学院 410219
课题编号：湖南省教育厅科学研究项目（15C0162）
目的：研究益气解毒方抑制鼻咽癌5-8F细胞迁移的效应。方法 采用实时无标记细胞功能分析技术（Real-time unlabeled cell function analysis technique，RTCA）动态监测不同浓度（0.125mg/mL,0.25mg/mL,0.5mg/mL,1.0mg/mL）的益气解毒方水提物对人鼻咽癌5-8F细胞迁移的影响，并同时采用划痕实验检测益气解毒方对鼻咽癌5-8F细胞迁移的影响。结果：RTCA 和划痕实验结果表示，与正常组（Control）比较，益气解毒方可以明显抑制鼻咽癌5-8F细胞的迁移，而且随着益气解毒方浓度的增加、作用时间越长，其抑制效应越显著（p<0.05）。结论：益气解毒方能明显抑制鼻咽癌细胞迁移。
鼻咽癌是头颈部高发的恶性肿瘤之一，主要起源于鼻咽上皮细胞，在我国南方及东南亚地区较为常见。益气解毒方是田道法教授依据临床经验创立的经验方，是临床治疗鼻咽癌的常用方，具有生津润燥、 益气解毒的功效。前期临床观察显示，益气解毒方治疗鼻咽癌疗效确切。本实验主要观察益气解毒方对鼻咽癌5-8F细胞迁移效应的影响，通过RTCA和划痕实验检测益气解毒方在不同时间点对5-8F细胞的效应，初步探讨其作用机制，为鼻咽癌临床治疗提供科学依据。
1 材料
1.1 细胞 人鼻咽癌 5-8F 细胞株，中南大学湘雅医学院细胞培养中心。 1.2 药物及制备 益气解毒方（黄芪20g、天花粉10g、白花蛇舌草10 g、射干10 g、党参5g、黄连5g、甘草3g等），长沙医学院附属第一医院制备，处方饮片用三蒸水浸泡过夜，煮沸 25 min 过滤，离心后浓缩，加定量生理盐水配成 1g/mL 溶液，抽滤除菌，4 ℃冰箱冷藏备用。
1.2 主要试剂与仪器 RPMI-1640培养基（Hyclone公司）、胎牛血清（Gibco公司）、PBS缓冲液（Hyclone公司）、DMSO（Amresco公司）、CO2培养箱贺利氏HERAcell 150i（赛默飞世尔公司）、实时无标记细胞功能分析仪RTCA（艾森生物科技公司）、倒置显微镜（Olympus 公司）。
2 实验方法
2.1 细胞培养
将鼻咽癌5-8F 细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中，置于37℃、5% CO2、湿度饱和的恒温细胞培养箱内培养，细胞生长至70-80%传代，取对数生长期细胞用于实验。
2.2实时无标记细胞功能分析仪（RTCA）监测细胞迁移情况
取对数生长期5-8F 细胞，消化重悬成单个细胞，调整浓度5×103个细胞每个孔，种到RTCA[1]专用细胞迁移检测培养板，每个孔加入100μL 5-8F细胞悬液，同时加入不同浓度的益气解毒方溶液（0.125、0.25、0.5、1.0mg/mL）组、正常培养组（Control）、每个组设3个复孔，每孔加入药液100μL，采用RTCA动态监测，并用CI值表示5-8F细胞的迁移状况。
2.3细胞划痕实验
实验操作前对所用物品进行灭菌，直尺和记号笔等物品操作前应在超净台内紫外线照30 min。常规消化呈指数生长的5-8F，以5×105 /孔接种至6孔板中。待细胞贴壁密度达到 80％时将 6孔板放置在预先设计好的划痕模版上，借助直尺，采用10μl移液枪头在板底依照模版在对应孔中划直线，用 PBS漂洗2次以除去划下的悬浮细胞，继续培养，相应时间( 24h、48h、72h) 后在倒置光学显微镜下拍照观察细胞迁移情况。细胞相对迁移率=药物组距离/对照组距离。
2.4 统计学处理
采用SPSS 22.0统计软件处理，计量资料实验数据服从正态分布，用x±s表示，单因素设计，多组间计量资料比较采用单因素方差分析，满足方差齐性，多重比较用LSD检验，方差不齐用Dunnet T3检验。计量资料不服从正态分布的，则采用秩和检验。P<0.05则差异具有统计学意义。所有的结果分析图由GraphPad Prism7.0软件制作完成。
3结果
RTCA及细胞划痕检测结果均显示，与正常培养组（Control）比较，不同浓度益气解毒方水提物分别处理5-8F细胞24 h、48 h、72 h后，都可以抑制5-8F细胞迁移（p<0.05），并且随着浓度的增加、作用时间的延长，其抑制效果更加显著。（见图1、图2）
4讨论
鼻咽癌在中医中的病机主要为正气亏虚、 脏腑功能失调，外加毒邪入体、气血凝结，进一步演变为热毒壅盛、脏腑亏虚，最终导致正气衰竭而亡。 中医治疗肿瘤主要侧重扶正祛邪，治以补气养血、滋阴温阳、清热解毒、软坚散结为主。。益气解毒方是田道法教授在多年的临床经验和研究基础上研发的抗鼻咽癌制剂［2］，以黄芪、党参等补气药为重，辅以白花蛇舌草和黄连以清热、解毒、化瘀、祛邪，以茯苓、天花粉养阴健脾。本方起到其作用主要是益气解毒，生津润燥，扶正祛邪，提升患者的免疫力，调节患者的气虚体质，对鼻咽癌疗效显著。
本研究观察益气解毒方对鼻咽癌5-8F细胞迁移的影响，通过实验数据分析得出，益气解毒方能显著抑制鼻咽癌5-8F细胞迁移，且随着浓度的增加、作用时间的延长，其抑制效果更加显著。
综上，益气解毒方可抑制鼻咽癌5-8F细胞的迁移，而发挥抗癌及抑制转移作用，为继续更深入探讨益气解毒方抑制5-8F细胞迁移的作用机理提供可靠依据。
参考文献
[1]严国俊,裴燕芳,朱贞宏,等.实时细胞电子分析技术的应用研究进展[J].中国药学杂志, 2014, 49(3): 169-173.
[2] 胡梅，田道法，刘群良，等. 益气解毒方提取物对 CNE2 细胞的体内外抑瘤作用［J］ .中国中医药信息杂志，2012( 11) : 41.
论文作者:陈艳
论文发表刊物:《健康世界》2019年第05期
论文发表时间:2019/6/21
标签：细胞论文; 鼻咽癌论文; 益气论文; 抑制论文; 划痕论文; 浓度论文; 作用论文; 《健康世界》2019年第05期论文;