（2成都七中嘉祥外国语学校 四川 成都 610066)
【摘要】 目的：研究PM2.5对红细胞性质的影响。方法：采集成都市区大气中的PM2.5，将PM2.5以低剂量（20μg/mL）、高剂量（100μg/mL）与红细胞作用24h，检测红细胞常规指标、溶血情况、红细胞的渗透脆性、变形性、聚集性及丙二醛（MDA）含量，以生理盐水组作为对照，观察PM2.5对各指标的影响。结果：与生理盐水组相比，高剂量组红细胞的溶血率、MDA含量、渗透脆性升高，聚集幅度降低；常规指标、变形性和聚集指数基本无变化；低剂量组红细胞的溶血率、MDA含量及渗透脆性略微升高，聚集幅度略微降低，常规指标、变形性和聚集指数基本无变化。结论：较低浓度的PM2.5对红细胞性质几乎无影响，较高浓度的PM2.5对红细胞的部分性质有显著影响。
【关键词】 PM2.5；红细胞；溶血率；流变学特性
【中图分类号】R992 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2017）34-0203-04
【Abstract】Objective To examine the effect of particulate matter less than 2.5 in aerodynamic diameter (PM2.5) on erythrocyte properties. Methods PM2.5 was collected in Chengdu,City of Sichuan province.Erythrocyte was exposed to PM2.5 at the low dose of 20μg/ml and high dose of 100 μg/ml.After 24 hours,examine the routine indexes of erythrocyte, hemolysis, erythrocyte osmotic fragility, deformability, aggregation and malondialdehyde (MDA) content.Use saline as a control to observe the effect of PM2.5 on the indexes. Results compared with saline,the hemolysis rate, MDA content and osmotic fragility of erythrocytes in high dose group significantly increased, the aggregation rate decreases significantly, and the conventional index, deformability and aggregation index does not change.The hemolysis rate, MDA content and osmotic fragility of erythrocytes in low dose group slightly increases, and the aggregation rate decreased slightly. The conventional indexes, deformability and aggregation index does not change. Conclusions The lower concentration of PM2.5 has little effect on the erythrocyte properties, and the higher concentration of PM2.5 has a significant effect on the partial properties of erythrocytes.
【Key words】PM2.5;Erythrocyte;Hemolysisratio;Rheological property
流行医学研究表明，PM2.5作为一种重要的空气污染物，对呼吸系统有明显影响，并会对人体造成慢性疾病[1,2]。近来北京成都等地雾霾持续不散，已经到了非常严重的地步[3,4]。就物理特性而言，除PM10 外，大气PM2.5 组分由于颗粒极小，其毒性令人担忧。目前，学术报告中赵学彬等人比较不同地区大气PM2.5 对血管内皮细胞的毒性，并探讨其作用机制，得出了不同城市PM2.5 对血管内皮细胞的毒性表现不同，NO、SOD、LDH 与细胞存活率有关联，氧化应激损伤可能是其作用机制之一的结论[1]。冯欲静等四人的课题探讨了PM2.5对人体血淋巴细胞的DNA损伤情况，得出PM2.5可诱导外周血淋巴细胞凋亡，其机制可能与自由基产生增多的结论并造成DNA氧化损伤有关的结论[2]。李娟等人研究了PM2.5对脂质过氧化损伤的作用[5]。刘芳盈等人采用MTS 法评价燃煤PM2.5不同组分对血管内皮细胞EA.hy926 的细胞毒性，结果表明燃煤PM2.5不同组分均可抑制血管内皮细胞增殖，血管内皮损伤是PM2. 5致心血管毒性的可能机制之一[6]。
PM2.5颗粒非常微小，能够进入人体的呼吸道，微粒直径更小的颗粒甚至可以穿过肺泡壁进入人体的体液循环中，进而与血液中的红细胞发生相互作用，可能会对红细胞的功能造成一定的影响。经过查新发现，国内分别见有PM2.5对心血管、血压、呼吸系统以及人脐静脉内皮细胞、人绒毛膜外滋养层细胞等的影响的研究报道，但未见研究PM2.5对红细胞性质（红细胞溶血情况、渗透脆性、变形性、聚集性及丙二醛（MDA）含量）的影响的公开文献报道，也未见研究PM2.5对于血常规指标（红细胞部分）的影响的公开文献报道。因此，本研究将通过红细胞与PM2.5相互作用，观察PM2.5对红细胞性质的影响，研究PM2.5对红细胞生理活性的作用，为进一步了解PM2.5对人类的危害以及更好地作出防护措施提供参考意见。
1.材料与方法
1.1 材料
1.1.1试验细胞 人体静脉血红细胞，取自四川省石油总医院；PM2.5，取自成都市新津县。
1.1.2仪器 BC-5800型五分类血细胞计数仪（深圳迈瑞医疗器械有限公司）、LBY-BX型红细胞变形仪（北京普利生）、TH-150C型中流量空气总悬浮微粒采样器（武汉市天虹仪表有限责任公司）、美国BioTek Epoch酶标仪、1-14型离心机（北京五洲东方科技发展有限公司）、E2800-DS型紫外可见分光光度计（上海昂拉仪器有限公司）、TS-A脱色摇床（金坛市迅生仪器厂）。
1.1.3试剂 分析纯氯化钠、MDA检测试剂盒（南京建成）、无水乙醇、三氯甲烷、肝素钠、磷酸缓冲液、蒸馏水、硫代巴比妥酸。
1.2 方法
1.2.1 PM2.5样品采集与处理 在空气流量为0.1m3/min的条件下，用中流量空气总悬浮微粒采样器采集大气中的PM2.5。采样后将滤膜取下，恒温条件下干燥6h，用铝箔包裹滤膜，在-18℃下保存。制备PM2.5悬液时，将滤膜浸入50ml蒸馏水，超声处理60min，并用洁净钝器小心轻刮滤膜，至滤膜由黑色转变为浅白色，制成PM2.5悬液。在-80℃低温冰箱中过夜储存。24h后取出样本，干燥处理12h，待其水分完全蒸发，瓶底可见干燥灰色絮状物。在室温下进行称重，得到容器内获取的灰霾PM2.5 的重量，并加入等渗的氯化钠配成200μg/ml的PM2.5与生理盐水的混合母液[7]。
1.2.2 PM2.5溶液的制备与分组 将200μg/ml的PM2.5母液加入不同体积生理盐水中，配置成不同浓度的PM2.5溶液。
1.2.3血液样品 取健康志愿者的静脉血液10mL,加入肝素钠抗凝，放入冰箱冷藏室中4℃低温静置储存。
1.2.4红细胞与不同浓度PM2.5混合液的制备 取1.2.3中已制备好的人全血1.5ml，摇匀后均分为3组，每组为0.5mL，编号分别为A组、B组、C组，其中A组加入一定量的生理盐水，向B组加入等量的PM2.5母液和生理盐水稀释配成20μg/ml的PM2.5与红细胞的混合液，向C组加入等量的PM2.5母液和生理盐水配成100μg/ml的PM2.5与红细胞的混合液，保证3组配置后的红细胞稀释倍数相同。
1.2.5红细胞在不同浓度PM2.5混合液中溶血率的测定 本实验利用三波长法[8]，测定红细胞的溶血率，依次向4支试管内各加5ml不同浓度的PM2.5红细胞处理液,轻摇至均匀，在干燥离心管（3500r/min）中离心10min，取上清液，用1管的pH=8磷酸缓冲液对分光光度计进行空白调零，在pH=8的碱性条件下测每管在380nm，415nm，450nm的吸光度，并由公式计算得出溶血率。
溶血率计算公式:FHb(mg/L)=［1.68*A415-0.84*(A380+ A450)］×1000
1.2.6红细胞变形性及聚集性的测定 将上述不同组别的红细胞悬液以1ml PVP加入20μl红细胞的比例混匀，取700μl加入红细胞流变仪中，测定红细胞变形数据的变化和红细胞聚集数据的变化并记录结果。
1.2.7血常规检测 实验选择5组最有代表性的基本参数检测红细胞的性质变化。取不同组别的混合液，分别在五分类血液分析仪中测定红细胞的基本参数的变化。并记录红细胞的平均体积（MCV）、红细胞的平均血红蛋白含量（MCH）、红细胞平均血红蛋白浓度（MCHC）、红细胞分布宽度变异系数（RDW-CV）、红细胞分布宽度（RDW-SD）的数据。
1.2.8红细胞渗透脆性的测定 配置浓度4.2～5.4g/L的 NaCl 溶液。用等渗盐水将离心洗涤后的压积红细胞制成 50% 的红细胞悬液，取30μL加入到3mL不同浓度的NaCl溶液中，放置30min后离心取上清于540nm测吸光度，以蒸馏水为100%溶血管，作出回归直线，并计算得到50%溶血率时的NaCl的浓度[12]。
1.2.9脂质过氧化物丙二醛（MDA）的测定 取各组血样0.15ml，加入3ml生理盐水，再以3500r/min离心5分钟。取离心下层红细胞，加入0.6ml的蒸馏水在脱色摇床上混匀1min使细胞充分溶解。在上述溶血液中再加入0.3ml无水乙醇，在脱色摇床上充分混匀30s。再加0.3ml的三氯甲烷置脱色摇床上混匀 1分钟，然后以3500r/min转速离心5分钟。取上清液并记录体积，再将10nmol/ml的TBA（硫代巴比妥酸）标准品稀释10倍，配置成溶液。用脱色摇床混匀，试管口用保鲜薄膜扎紧，用针头刺一小孔，95℃水浴40 分钟，取出后冷却，用蒸馏水调零，于532nm处测各管吸光度值。计算公式：
全血中MDA含量=（测定OD值-对照OD值）/（标准OD值-空白OD值）*标准品浓度（1nmol/ml）/取液样（0.15ml）
1.3 统计学分析
本实验用Excel2003建立原始数据库，GraphPad prisnm软件进行数据分析，结果以平均值±标准差（x-±s）表示，采用ANOVA方差进行统计学分析，并用q检验进行两两校正，P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为差异有高度统计学意义。
2.结果
2.1 血常规检测结果
用PM2.5与生理盐水的混合等渗液处理红细胞后，在PM2.5组的红细胞的五项血常规指数与生理盐水组相比，数据无较大改变，经过ANOVA方差分析，三组之间MCV（F=0.089，P=0.915），MCH（F=2.489,P=0.117），MCHC（F=1.154,P=0.342），RDW-CV（F=2.193,P=0.146），RDW-SD（F=3.593,P=0.053）的差异均不具有统计学意义。见表1。
表1 血常规测定结果
2.2 PM2.5对红细胞溶血率影响
随着PM2.5浓度的升高，红细胞溶血率增大，与生理盐水组相比，100μg/mlPM2.5组的PM2.5对红细胞的溶血率影响更显著，经过ANOVA方差分析，方差F=34.10，两两对比并进行q检验校正，得100μg/mlPM2.5组对生理盐水组差异具有高度统计学意义（P＜0.001），PM2.5(100μg/ml)组对20μg/mlPM2.5组溶血率差异也具有高度统计学意义（P＜0.01），PM2.5(20μg/ml)组对生理盐水组溶血率差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表2。
表2 溶血率测定结果
2.4 PM2.5对红细胞聚集性的影响
经过ANOVA方差分析，聚集幅度的方差F=23.79，聚集指数的方差F=5.349，用q检验两两校正后，20μg/ml PM2.5组中培养后的红细胞与生理盐水组相比，聚集幅度无较大变化，差异不具有统计学意义（P＞0.05），聚集指数也无较大变化，差异不具有统计学意义（P＞0.05），100μg/ml PM2.5组混合培养后的红细胞的聚集幅度降低，与生理盐水组和20μg/ml PM2.5组相比，差异均具有统计学意义（P＜0.05），同时其聚集指数升高，与生理盐水组和20μg/ml PM2.5组相比，差异均具有高度统计学意义（P＜0.001）。见图1，图2。
图1 PM2.5对红细胞聚集幅度的影响
注：a表示100μg/ml PM2.5组与生理盐水组相比，差异有高度统计学意义（P＜0.001），b表示100μg/ml PM2.5组与20μg/ml PM2.5组相比，差异有高度统计学意义（P＜0.001）。
图2 PM2.5对红细胞聚集指数的影响
注：a表示100μg/ml PM2.5组与生理盐水组相比，差异有统计学意义（P＜0.05），b表示100μg/ml PM2.5组与20μg/ml PM2.5组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。
2.5 PM2.5对红细胞渗透脆性的影响
从数据可以直观地看到PM2.5会使红细胞的渗透脆性指标升高，也就是红细胞抵抗低渗溶液能力减弱。经过ANOVA分析后，F=32.06，具有统计学意义，用q检验后得到：与生理盐水组相比，100μg/ml PM2.5组会使红细胞渗透脆性升高，差异具有高度的统计学意义（P＜0.001），20μg/ml PM2.5组的PM2.5也会使红细胞的渗透脆性升高，差异具有统计学意义（P＜0.05），100μg/ml PM2.5组与20μg/ml PM2.5组的差异有高度的统计学意义（P＜0.01）。见表3。
表3 渗透脆性测定结果
组别 渗透脆性
生理盐水 0.4267±0.0031
PM2.5(20μg/ml) 0.4283±0.0035a
PM2.5(100μg/ml) 0.4440±0.0020bc
注：a表示与生理盐水组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。b表示与生理盐水组相比，差异有高度统计学意义（P＜0.001）c表示与20μg/ml PM2.5组相比，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。
2.6 PM2.5对血浆中MDA数据的影响比较
与生理盐水组相比，经过PM2.5不同浓度的等渗液培养后，血浆中MDA随着PM2.5组的浓度的增大而增大，说明血浆中脂质的过氧化程度随着PM2.5增大而增大，ANOVA方差分析后，F=126.0，进一步的校正得到：20μg/ml PM2.5组与生理盐水组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）；100μg/ml PM2.5组与生理盐水组相比，差异具有高度的统计学意义（P＜0.001）；100μg/ml PM2.5组与20μg/ml PM2.5组相比，差异也具有高度的统计学意义（P＜0.001）。见图3。
图3 MDA含量测定
注：a表示与生理盐水组相比，差异有统计学意义（P＜0.05），b表示与生理盐水组相比，差异有高度统计学意义（P＜0.001），c表示与20μg/ml PM2.5组相比，差异高度有统计学意义（P＜0.001）。
3.讨论
本次实验研究表明：PM2.5对红细胞的常规指标、变形性、聚集指数基本无影响，但会使红细胞的渗透脆性、溶血率、MDA升高，并会使聚集幅度下降。低浓度（20μg/ml）的PM2.5会使红细胞的渗透脆性，溶血率，MDA略微升高，聚集指数、聚集幅度、变形性和常规指标基本无影响。高浓度（100μg/ml）的PM2.5会使红细胞的渗透脆性、溶血率、MDA升高，并会使聚集幅度下降，但其不会对红细胞的常规指标、变形性、聚集指数造成较大影响。
我国颗粒物污染相当严重，中国五大城市调查显示TSP几乎全年超过我国空气质量二级标准。随着交通的发展、机动车辆的增加， PM2.5污染会越来越严重，如果长期吸入PM2.5，必将严重危害人类健康，人们已经意识到PM2.5对人体的健康有非常大的危害，也有实验证明了PM2.5对人体肺部的支气管细胞有着巨大危害[13]，但目前并没有相关研究表明PM2.5对人体最重要的红细胞有何种程度的影响。
大气中颗粒物质对人体健康的危害程度取决于颗粒物的理化性质，颗粒物的化学成分是主要致病因子。通常认为，PM2.5主要对呼吸系统和心血管系统造成伤害。除此之外，国内也有不少关于雾霾影响生殖能力、致畸、致突变等方面的报道[13]。老人、小孩以及心肺疾病患者，是PM2.5污染的敏感人群。根据徐敬等人的研究，SO42-，NO3-和NH4+为北京PM2.5的主要离子[3]，这是一个典型的代表，说明中国大城市的雾霾主要呈中性，但本实验采用的雾霾为成都雾霾，其成分与北京雾霾是否相同，影响结果是否相同，不得而知。
本研究设计了2个实验组和1个对照组（生理盐水组）。根据《环境空气质量指数（AQI）技术规定》，重污染天气情况下（空气质量指数≥300，这里假设为500）PM2.5的含量是500μg/m?，人体每天吸入的空气量约为18立方米，则一天当中PM2.5总共吸入9000μg，人体的血液约有4.5L，假设一个人长时间生活在重污染环境中，并且PM2.5全部进入血液中与红细胞相互结合作用，那么其一年下来血液中积累的PM2.5浓度为730μg/m?。但实际上通过肺泡进入血浆中的PM2.5微乎其微，能与红细胞相互结合的就更少，虽然没有文献报道有多少比重的PM2.5能够进入血浆中与人的红细胞结合，但PM2.5颗粒十分微小，小到能够穿过肺泡（直径约0.2mm），穿过毛细血管壁，所以这种情况肯定存在。本研究设计20μg/ml作为低浓度组，100μg/ml作为高浓度组，实际上，人体内的存在的PM2.5浓度远远小于设定的组别。
本研究主要从红细胞的溶血率，渗透脆性，变形性和聚集性，脂质过氧化这些方面考察PM2.5对红细胞性质的影响。实验结果表明，PM2.5会改变红细胞的部分性质，具体表现为：对溶血率、渗透脆性，脂质过氧化，聚集性有一定影响，对红细胞的基本性质及变形性无影响。但是，对于PM2.5效应的集中在小鼠细胞的影响，目前仍缺乏对人体细胞的研究。另外，国内大气 PM2.5 的处理方法也不统一，本实验的重点是在研究PM2.5对人体红细胞各项性质的影响上，由 PM2.5处理所引起的实验误差可作为系统误差，对实验结果影响不显著。虽然笔者通过本课题证实了PM2.5对红细胞的某些性质有影响，但是PM2.5对红细胞的作用机制非常复杂，大气PM2.5是一种成分及其复杂的混合物，灰霾天气时PM2.5的多种成分含量均会升高，本次研究没有证实究竟是PM2.5中哪一种物质对应了哪一种影响，究竟哪种化学成分引起红细胞的某种性质的改变，PM2.5对新老红细胞的影响是否相同，有待进一步的研究。
【参考文献】
[1]赵学彬，郭翔，孙敬智，等.不同地区大气PM2.5对人血管内皮细胞毒性作用的实验研究[J].环境与健康杂志，2012，29(1):3-6.
[2]冯欲静，王雅婷，韩威，等.PM2.5对人外周血淋巴细胞凋亡与DNA损伤的影响[J].武警后勤学院学报(医学版)，2014(7):557-560.
[3]徐敬，丁国安，颜鹏，等.北京地区PM2.5的成分特征及来源分析[J].应用气象学报，2007，18(5):645-654.
[4]段振华，高绪芳，杜慧兰，等.成都市空气PM2.5浓度与呼吸系统疾病门诊人次的时间序列研究[J].现代预防医学，2015，42(4):611-614.
[5]李娟，杨维超，洪丽娟，等.PM2.5对BEAS-2B细胞脂质过氧化损伤作用[J].中国公共卫生，2014，30(11):1389-1391.
[6]刘芳盈，丁明玉，王菲菲，等.燃煤PM2.5不同组分对血管内皮细胞的毒性[J].环境科学研究，2011，24(6):684-690.
[7]于青，王红，刘嘉馨，等.游离血红蛋白测定:三波长法和邻联甲苯胺法的比较研究[J].中国输血杂志，2012，25(2):138-141.
[8]黄强，董发勤，王利民，等.PM2.5的细胞毒性及机制研究进展[J].毒理学杂志，2014(1):68-72.
[9]钟锐，刘华，王红，等.添加不同比例的MAP保存液对拉萨地区悬浮红细胞保存质量的影响[J].中国输血杂志，2015，28(7):780-783.
[10]王庚辰，王普才.中国PM2.5污染现状及其对人体健康的危害[J].科技导报，2014，32(26):72-78.
[11]王博，潘仁湖，夏博实，等.一种新式PM2.5收集方法——云式除尘方法[C].中国环境科学学会学术年会.2015.
[12]罗超，谭艳，唐微，等.分光光度法测定红细胞渗透脆性研究[J].山西医科大学学报，2009，40(5):391-393.
[13]朱成华，施丽君，张灵凤，等.PM2.5对支气管上皮细胞色素上皮衍生因子表达的影响[J].中国康复理论与实践，2016，22(10):1151-1153.
论文作者:陈世轩1,程实1,汤云姣2
论文发表刊物:《医药前沿》2017年12月第34期
论文发表时间:2018/1/8
标签：红细胞论文; 生理盐水论文; 统计学论文; 细胞论文; 脆性论文; 意义论文; 差异论文; 《医药前沿》2017年12月第34期论文;