一、三种非病毒载体转染方法的比较（论文文献综述）
杨韧[1]（2021）在《MERS-CoV与SARS-CoV-2亚单位疫苗与核酸疫苗研究》文中研究表明冠状病毒（Coronavirus）是一类含包膜结构的单股正链非节段的RNA病毒,广泛分布于多种哺乳动物宿主中,具有跨种传播能力。目前已知感染人类的冠状病毒有7种,其中严重急性呼吸综合征冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV）、中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV）与 201 9 新型冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2,SARS-CoV-2）是三种高致病人感染冠状病毒,在不同地区国家都曾造成严重的疫情危害。MERS-CoV自2012年首次于中东地区发现,2015年曾在韩国引发严重疫情,而至今依旧在部分地区发现偶发病例。2019年12月底由SARS-CoV-2引起的COVID-19（Corona Virus Disease 2019）疫情快速在全球蔓延,至今依旧没有得到有效的控制。然而,针对几种高危冠状病毒,目前尚无特效治疗性药物。因此,开发安全且有效的疫苗是控制病毒感染的最有效手段。亚单位疫苗及核酸疫苗,具有安全性高,易于生产制备研发等良好特点。本文基于前期的研究结果,使用哺乳动物细胞表达系统制备了基于MERS-CoV S蛋白RBD结构域的亚单位疫苗蛋白,使用肌肉或滴鼻免疫的方式在小鼠体内评价了抗原蛋白免疫原性。另外,研究基于重组RBD蛋白设计制备了信使RNA（Messenger RNA,mRNA）疫苗与自扩增RNA（Self-amplify mRNA,saRNA）疫苗,并在小鼠体内对两种RNA疫苗的免疫原性进行初步的评价。COVID-19疫情早期,我们设计了密码子优化序列的SARS-CoV-2 S蛋白的DNA疫苗与mRNA疫苗,其中mRNA疫苗与上海斯微公司合作研制。两种核酸疫苗在不同品系小鼠内进行免疫应答研究,并进行攻毒保护实验,探究疫苗的保护性。具体研究内容如下:1.MERS-CoV RBD重组亚单位疫苗和mRNA疫苗的设计与免疫原性研究MERS-CoVRBD偶联不同三聚体基序在CHO细胞表达制备的蛋白具有不同的聚集倾向,偶联T4f基序的RBD蛋白可以形成以三聚体为主二聚体为辅的高聚集态。重组蛋白RBD-T4f配合铝佐剂或铝佐剂联合CpG ODN均可以有效在BALB/c小鼠内诱导高滴度中和活性的抗体,不同佐剂的使用在细胞免疫水平表现有所差异。重组蛋白RBD-T4f配合CTA1-DD或CpG ODN佐剂滴鼻免疫可以有效诱导系统性及呼吸道局部免疫应答,在血液及呼吸道黏膜均可检测到高滴度的中和活性抗体,并可在肺组织局部检测到的高水平特异性细胞免疫应答。重组抗原RBD-T4f序列插入体外转录载体,通过酶促反应制备了重组抗原的mRNA与saRNA疫苗。研究同时对SFV4骨架saRNA的体外转录反应进行优化,成功制备了完整专一的长链saRNA分子,优化后的saRNA进入小鼠体内后可以持续表达目的蛋白至少11天。使用LPP技术包裹的重组抗原RBD-T4fmRNA疫苗初免后可以诱导抗原特异性IgM应答,两次免疫可以诱导特异性IFN-γ分泌细胞,高剂量三次免疫可以诱导一定水平的中和活性抗体产生。使用in vivo jet-PEI包裹的saRNA疫苗在免疫两次后可诱导高水平的细胞免疫应答,但难以诱导产生体液免疫应答。2.SARS-CoV-2 DNA与mRNA核酸疫苗免疫原性与保护效果研究研究对SARS-CoV-2 S蛋白序列进行人源细胞密码子优化,基于该序列设计制备了 DNA疫苗与化学修饰的mRNA疫苗。DNA疫苗使用肌肉免疫附电穿孔免疫部署后,可以有效诱导具有中和活性的特异性体液免疫应答,并诱导高水平Th1偏向的特异性细胞免疫。高剂量两次免疫后可产生攻毒保护效果。mRNA使用LPP技术包裹后物理稳定性良好,该方法生产的mRNA-LPP疫苗具有良好的免疫原性。免疫后可诱导产生高滴度的中和抗体,且具有一定的广谱中和性,可中和多种突变株病毒。高剂量两次免疫后,高水平的中和抗体与Th1偏向的细胞免疫记忆可保持13周。SARS-CoV-2攻击后,高剂量单次与两次免疫的C57BL/6小鼠肺组织病毒滴度显着降低,并有效缓解炎症病变;高或低剂量两次免疫的BALB/c小鼠也表现出相似良好的攻毒保护效果。另外,mRNA-LPP疫苗在恒河猴中也表现出良好的免疫原性,诱导高滴度广谱中和抗体,并产生攻毒保护效果。综上所述,本研究使用CHO制备的MERS-CoVRBD-T4f重组抗原蛋白具有良好的免疫原性,可以诱导高滴度的中和抗体,配合合适的佐剂可以用于传统疫苗及黏膜疫苗的制备。基于重组抗原RBD-T4f设计的mRNA与saRNA疫苗诱导体液免疫能力相对有限,但可以诱导高水平的特异性细胞免疫应答。基于SARS-CoV-2 S蛋白优化序列的DNA疫苗与含化学修饰的mRNA-LPP疫苗均具有良好的免疫原性,可诱导高滴度的中和抗体及高水平的Th1型细胞免疫应答。合适的免疫剂量与方案可以诱导足够强的免疫应答,产生攻毒保护效果。这些研究为冠状病毒的疫苗研发及应用奠定了理论基础。
李小英[2]（2021）在《基于睾丸支持细胞研究4.1R蛋白在少精症小鼠模型中的作用机制》文中指出不育症是严重影响哺乳动物繁殖能力的一类生殖系统疾病。营养缺乏、饲养管理不当、季节性原因、遗传原因（如杂交不育）和疾病等均可导致不育。在引起哺乳动物不育的因素中,雄性因素约占一半左右。无精子症、少精子症、弱精子症、精子无力症等是引起雄性不育的主要病因。少精症是以精子数量显着稀少为特征的雄性不育症类型,病因复杂发生机制仍不十分明确。遗传因素和环境因素均可导致精子数量减少,遗传因素对精子数量的影响主要通过精子形成过程中相应基因的表达和调控作用来实现。因此,寻找影响精子形成的特异性靶基因（蛋白）并阐释其作用机制,对于少精症的精准治疗和预后具有重要的理论价值和意义。4.1R蛋白是一种由epb41基因编码的细胞膜骨架蛋白组分,在红细胞和多种非红细胞组织中发挥作用。本文从以下三个方面阐述4.1R蛋白基于睾丸支持细胞在少精症发生中的作用机制:（1）以雷公藤多苷溶液诱导雄性C57BL/6J小鼠（7周龄）构建的少精症模型小鼠为研究对象,利用western blotting、q-PCR和免疫荧光技术检测4.1R蛋白在少精症小鼠睾丸内的表达特点。利用异硫氰酸荧光素（FITC）睾丸活体注射检测少精症模型小鼠血睾屏障完整性,并检测血睾屏障形成相关蛋白的表达,阐述4.1R蛋白表达与睾丸支持细胞（Sertoli）连接功能间的相关性。检测Wnt/β-catenin信号通路组分在少精症模型小鼠睾丸内的表达特点,阐述4.1R蛋白表达与Sertoli细胞增殖间的相关性。少精症小鼠模型研究结果:western blotting检测显示epb41基因在正常C57BL/6J小鼠睾丸内表达135k D和80k D两种亚型。即4.1R-135k D蛋白和4.1R-80k D蛋白。与对照相比较,少精症模型小鼠睾丸内4.1R-135k D蛋白表达显着下降（P<0.05）,4.1R-80k D蛋白表达无显着变化;epb41m RNA表达降低,差异不显着;4.1R蛋白在少精症模型小鼠睾丸Sertoli细胞膜上表达下降,而各级生精细胞细胞膜上的表达则无显着差异。少精症模型小鼠血睾屏障受损,FITC从基底室进入近腔室并分散其中。与对照组相比较,少精症模型小鼠睾丸内β-catenin蛋白表达显着下降,而E-cadherin表达增加。血睾屏障相关蛋白ZO-1表达显着下降（P<0.05）,occludin和claudin-11表达均下降;Wnt/β-catenin信号通路组分Wnt3a、β-catenin表达显着下降（P<0.05）,GSK3β、c-myc和CDK4表达也下降,但差异不显着。（2）以小鼠epb41基因第3外显子为模板,设计2对sg RNAs并构建p GL3-U6-epb41-sg RNAa-puromycin和p Sp Cas9（BB）-epb41-sg RNAb-2A-GFP重组质粒载体。转染N2a细胞,验证第3外显子基因序列与4.1R蛋白亚型表达之间的相关性。以小鼠epb41基因为模板构建LV-Epb41（43286-1）过表达慢病毒载体和LV-Epb41-sg RNA（05765-1）基因敲除慢病毒载体,分别转染TM4细胞（正常小鼠睾丸支持细胞系,即Sertoli细胞）和原代Sertoli细胞。检测细胞中4.1R蛋白、血睾屏障相关蛋白和Wnt/β-catenin信号通路组分表达水平,阐述4.1R蛋白在体外培养Sertoli细胞增殖和连接中的作用机制。研究结果显示:重组质粒载体转染的N2a细胞中4.1R-135k D蛋白不再表达,而4.1R-80k D蛋白正常表达。LV-Epb41-sg RNA（05765-1）慢病毒载体转染TM4细胞和原代Sertoli细胞,4.1R-135k D蛋白被抑制表达,而4.1R-80k D蛋白正常表达。LV-Epb41（43286-1）过表达慢病毒载体转染TM4细胞和原代Sertoli细胞,显着提高4.1R-135k D蛋白（P<0.05）和4.1R-80k D蛋白的表达,证实已成功实现Sertoli细胞内4.1R-135k D蛋白的抑制表达和过表达。4.1R-135k D蛋白基因敲除的TM4细胞中血睾屏障相关蛋白β-catenin、E-cadherin和ZO-1表达均显着下降;Wnt/β-catenin信号通路组分WB检测结果显示:蛋白Wnt3a、β-catenin、c-myc、GSK3β和Cyclin D1均显着下降（P<0.05）,CDK4表达也下降,CDK6表达则上升。4.1R-135k D蛋白过表达TM4细胞中β-catenin、ZO-1和occludin表达均上升,E-cadherin表达下降,差异均不显着;Wnt/β-catenin信号通路组分WB检测结果显示:蛋白Wnt3a,β-catenin,c-myc,GSK3β和Cyclin D1表达均上升,CDK4和CDK6表达则下降,差异均不显着。4.1R-135k D蛋白基因敲除原代Sertoli细胞中,血睾屏障相关蛋白β-catenin、ZO-1和occludin表达均显着下降;Wnt/β-catenin信号通路组分WB检测结果显示:蛋白Wnt3a、β-catenin和CDK4均显着下降（P<0.05）,c-myc和GSK3β表达也下降,Cyclin D1和CDK6表达则上升。4.1R-135k D蛋白过表达原代Sertoli细胞中β-catenin,ZO-1和occludin表达上升,E-cadherin表达下降,差异均不显着;Wnt/β-catenin信号通路组分蛋白Wnt3a,β-catenin,c-myc,GSK3β,CDK4和CDK6表达均上升,Cyclin D1表达则下降,差异均不显着。（3）以7周龄雄性C57BL/6J小鼠为实验对象,将p GL3-U6-epb41-sg RNAa-puromycin和p Sp Cas9（BB）-epb41-sg RNAb-2A-GFP质粒载体及LV-Epb41（43286-1）载体分别通过活体原位电穿孔转染法和慢病毒载体注射法作用于小鼠睾丸,比较两种载体转染方法的蛋白表达效率和靶向性,并利用免疫荧光法检测载体处理后睾丸组织中4.1R蛋白及血睾屏障相关蛋白的表达水平。阐述4.1R蛋白在活体水平对Sertoli细胞连接的调节作用与机制。质粒载体和慢病毒载体睾丸活体转染结果显示:质粒载体电转染法比慢病毒载体注射法更快在活体内表达,即质粒载体转染后3天,即在睾丸组织中高效表达,使Sertoli细胞中4.1R蛋白表达降低。慢病毒载体注射法表达相对较慢,注射后5天才可以在睾丸中表达。过表达慢病毒载体可显着提高4.1R蛋白在Sertoli细胞中的表达。4.1R-135k D蛋白基因敲除载体作用于活体睾丸,BTB相关蛋白表达变化规律与少精症模型小鼠中的变化规律相同。4.1R-135k D蛋白过表达载体作用于睾丸活体,显着提高BTB相关蛋白的表达,E-cadherin表达除外。综上得出结论:（1）小鼠睾丸和Sertoli细胞中均表达4.1R-135k D和4.1R-80k D两种4.1R蛋白亚型,4.1R-135k D蛋白表达下降与精子细胞数量显着减少相关。（2）小鼠Sertoli细胞系中4.1R-135k D蛋白表达下降,引起β-catenin表达下降,从而使Wnt/β-catenin信号通路组分表达异常,抑制睾丸支持细胞增殖。（3）成年小鼠睾丸组织Sertoli细胞中4.1R-135k D蛋白表达下降,引起血睾屏障相关蛋白表达异常,导致细胞连接异常,精子细胞形成的微环境受损。因此,由于Sertoli细胞中4.1R-135k D蛋白表达下降,可引起Sertoli细胞数量减少或血睾屏障受损,导致精子数量显着减少。
郝荣增[3]（2021）在《基于遗传密码扩展技术构建复制可控的重组口蹄疫病毒的研究》文中提出遗传密码子扩展技术是利用正交性氨酰t RNA合成酶/t RNA分子对（aa RS/t RNA）识别m RNA上的无义密码子（终止密码子或四联体密码子）,将非天然氨基酸通过核糖体插入目标肽或蛋白质中的策略统称。在蛋白翻译过程中由仅识别并通读无义密码子,将特定非天然氨基酸以编码形式插入蛋白质肽链特定位置的正交性aa RS/t RNA对,构成了非天然氨基酸的正交翻译系统。目前,利用遗传密码子扩展技术,已将超过200种不同的非天然氨基酸遗传编码插入细胞和动物体内合成的蛋白质,广泛应用于蛋白质标记和修饰等多种生物学研究领域;特别是将非天然氨基酸定点引入病毒蛋白的特定氨基酸位点,实现对病毒颗粒的表面修饰以及对病毒复制过程的控制,可直接将野生型病毒转化为安全高效的病毒疫苗,成为病毒疫苗研究中一项重要突破性进展。本研究以口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）为模型,结合遗传密码子扩展技术和病毒反向遗传学技术,在包含生物正交翻译系统的稳定细胞系中,扩展了FMDV的基因组,探索产生含有提前成熟终止密码子（PTC）的重组病毒（PTC-FMDV）的可行性,并进一步评估了重组PTC-FMDV的包装效率和遗传稳定性。主要研究内容及结果如下:1.重组PTC-FMDV的产生及遗传稳定性分析本研究首先利用Piggy Bac转座子系统介导的转座技术将Pyl RS/Pyl T正交翻译元件整合到细胞基因组中,成功构建了能有效解码琥珀终止密码子的正交翻译细胞系BHK-21-t RNA/pyl RS/m Cherry-TAG-e GFP。为了探究基于遗传密码子扩展技术构建复制可控制的重组FMDV的可行性,本研究根据对病毒蛋白的三级结构分析和氨基酸保守性分析,在FMDV的结构蛋白（VP1和VP4）和非结构蛋白（L和3D）中选择了129个氨基酸位点,将其密码子定点突变为琥珀终止密码子,分别构建了129种重组PTC-FMDV单点突变体和4种dual-PTC-FMDV双点突变体的拯救质粒,转染正交翻译细胞系进行重组病毒的包装和拯救,未添加非天然氨基酸的细胞转染组作为对照,根据细胞病变效应（CPE）和RT-PCR扩增分析病毒的包装和基因复制,并评估重组病毒的包装效率,结果表明这些PTC-FMDV的包装效率与野生型病毒相比均有降低;病毒拯救结果显示3D蛋白中27/48、L蛋白10/26、VP4蛋白11/16和VP1蛋白10/39的PTCFMDV突变体可以成功包装出病毒;然而基因测序结果显示,这些引入的琥珀终止密码子高度缺乏遗传稳定性,在PTC病毒的包装或传代复制过程中,存在几乎全部突变为有义密码子的可能;并且琥珀密码子的突变与特定氨基酸或蛋白的保守性没有明显的相关性。进一步构建包含两个琥珀密码子的双点PTC-FMDV突变体的研究发现,增加琥珀密码子的个数可降低重组PTC病毒的包装效率,但其在病毒传代过程中也存在发生突变的可能性。2.重组TAGA-FMDV的产生及遗传稳定性分析本研究为了解决PTC-FMDV的回复突变问题,并探究基于四联体密码子解码策略控制FMDV复制的可行性,首先构建了能有效解码TAGA四联体密码子的稳定转基因细胞系,进一步在前期试验的基础上,分别选择FMDV的VP1-N46、VP4-F76、L-Y42、3D-H14和3D-M16氨基酸位点,分别将这5个氨基酸密码子定点突变为TAGA密码子,构建了5种重组TAGA-FMDV突变体拯救质粒,在添加特定非天然氨基酸的条件下,进行重组TAGA-FMDV的包装和拯救,以探索重组病毒产生的可行性,并以未添加非天然氨基酸的细胞作为对照组。根据CPE和RT-PCR扩增分析病毒的包装和基因复制,实时荧光定量PCR（q PCR）分析病毒RNA的转录,细胞间接免疫荧光实验（IFA）分析病毒蛋白的表达。结果表明,重组病毒拯救质粒转染细胞后在第一代均可以观察到细胞局部的CPE,q PCR和IFA检测结果表明细胞内存在重组病毒的RNA转录和蛋白表达;但进一步通过基因测序对重组FMDV基因组中引入的TAGA四联体密码子的遗传稳定性分析发现,VP4-F76、3D-H14和3D-M16突变体在第一代和第二代样品测序结果表明,其基因组中保持了TAGA四联体密码子的存在;L-Y42突变体在两次转染细胞后均在第一代即发生了突变,VP1-N46突变体在转染后第一代也发生了突变;而在第三代样品的测序结果发现,这些TAGAFMDV基因组中的四联体密码子在病毒复制过程中均发生了突变或回复,该研究结果表明在FMDV基因组中引入的TAGA四联体密码子,病毒传代过程中也存在突变或回复的可能性。综上所述,本研究分别成功构建了能有效解码三联体琥珀终止密码子和TAGA四联体密码子的正交翻译稳定细胞系;利用遗传密码子扩展技术和病毒反向遗传技术扩展了FMDV基因组,系统的筛选并构建了133种携带PTC三联体终止密码子的重组病毒突变体,并在正交翻译细胞系中成功拯救了PTC-FMDV,证明了利用遗传密码子扩展技术产生PTC-FMDV这一概念的可行性,但将该技术应用于口蹄疫PTC疫苗仍具有一定挑战性;进一步利用四联体密码子解码策略构建重组TAGA-FMDV,初步探索了这种重组病毒包装的可行性与遗传稳定性,结果显示,重组TAGA病毒在传代过程也存在一定的遗传不稳定性。总之,本研究为成功制备重组复制可控的FMDV建立了一个新的、稳定的技术平台,同时也强调了将该项新技术应用于其他小RNA病毒科成员的研究中存在的风险和挑战。
路艳杰[4]（2021）在《锍修饰的PEI化合物的合成及其作为基因载体能力的研究》文中研究说明聚乙烯亚胺（PEI）是一类应用广泛的非病毒基因载体,其表面带有许多在生理条件pH环境下可发生质子化的氨基,使其具有较好的细胞摄取能力和内小体逃逸能力。但未经过改性的PEI正电荷密度会随着分子量增大而增多,从而导致细胞毒性增大、血液相容性差等缺点,严重限制其临床应用。本实验开发新型的PEI类聚合物（SIPEI）,将含羧酸的锍类化合物（SI）和低分子量PEI经过酰胺键连接,得到具有可降解、正电荷密度小等优点的PEI修饰产物,以期望改进PEI性质,获得低毒高转染活性的基因递送载体。本实验以3种不同链长SI和4个低分子量PEI为原料,通过3种用量配比缩合获得36个聚合物SIPEI,并经红外光谱、核磁共振氢谱进行鉴定。通过凝胶电泳阻滞实验对SIPEI与DNA的复合能力进行研究,通过纳米粒度、电动电势检测SIPEI/DNA复合物的粒径大小和Zeta电势,使用MTT法评价SIPEI的细胞毒性,采用荧光显微镜观察SIPEI/DNA复合物在细胞内分布情况及转染效果。通过红外谱图和核磁氢谱分析,SIPEI成功缩合,同时PEI的改性程度随反应物比例呈正向变化。通过溶解度检测,筛选出16个溶解性较好的SIPEI。经过凝胶电泳阻滞实验,得到10个与DNA质粒具有复合能力的SIPEI。对SIPEI/DNA复合物的粒径大小及Zeta电势检测发现,各复合物的粒径在150～300 nm之间,Zeta电势多数为正电势,在+5～+25 m V之间。对10个SIPEI进行细胞毒性检测,结果显示各聚合物的细胞毒性均与对照PEI 25k无显着差异,并且各聚合物随着给药浓度或时间增加,其细胞毒性也随之增加。细胞内分布实验结果表明,7个SIPEI的DNA复合物能有效被细胞摄取且大部分分布在细胞核的周围,之后对其转染性能进行研究,筛选出4个转染效果较PEI 1.8k强的SIPEI化合物,分别为5SIPEI 1.8k-0.25、5SIPEI 1.8k-0.5、8SIPEI 1.8k-0.25、10SIPEI 1.8k-0.25,这4个SIPEI的转染效果与PEI 25k相当。本实验发现,SI官能团上的正电荷可以与DNA中磷酸根有效键合,使修饰后的低分子量PEI能复合DNA形成纳米颗粒,可达到提高转染效率的目的。但是修饰后产物细胞毒性较低分子量PEI有所升高,表明SI官能团毒性较强,需要进一步优化结构,从而得到细胞毒性低,转染效率高的基因载体。
鲁愿[5]（2021）在《卡介苗与焦亡溶瘤策略的构建及其在宠物肿瘤治疗中的应用初探》文中认为肿瘤是威胁宠物生命健康的最主要病因之一,而宠物自发肿瘤与人类肿瘤发生、发展的机制相对保守,所以参照人类肿瘤的研究方法,开发宠物肿瘤治疗方法是非常必要的。以PD-1/PD-L1阻断为代表的免疫检查点阻断疗法已在临床肿瘤治疗中取得了喜人的进展,但也存在患者响应率低的应用局限。这可能与肿瘤所处的免疫抑制微环境有关。所以靶向肿瘤微环境（Tumor Microenvironment,简称TME）,可能是突破免疫检查点阻断疗法应用局限的一种有效手段。卡介苗（Bacille Calmette-Guerin,简称BCG）和细胞焦亡,均已被证明可在肿瘤部位激起强烈的抗肿瘤免疫反应,是很好的重塑TME免疫状态的工具。目前BCG仅在临床非肌层浸润性膀胱癌的治疗中得到应用,而在其他肿瘤类型,例如三阴性乳腺癌（Triple Negative Breast Cancer,简称TNBC）中的应用和研究相对较少。此外,诱发焦亡的gasdermin蛋白家族N端结构域(the N-terminal gasdermin domain,GSDMNT)具有很强的细胞毒性,常规的基因递送载体包装策略无法避免包装时GSDMNT的表达,因此很难获得携带GSDMNT的重组载体,所以目前缺乏将GSDMNT安全有效递送至肿瘤细胞的方法。本研究以BCG及焦亡为手段,构建了利用BCG或焦亡激活TME内抗肿瘤免疫的溶瘤策略,研究了BCG或焦亡对动物肿瘤模型的溶瘤机制,探索了PD-L1阻断剂与BCG或焦亡联合使用对TNBC小鼠模型的疗效,并进一步在宠物肿瘤临床治疗应用中进行了初步探索。本研究主要取得了以下结果:1利用卡介苗靶向肿瘤微环境增强抗肿瘤免疫1)在TNBC小鼠模型中证实,单倍剂量BCG治疗能够上调肿瘤中趋化因子相关基因和抗肿瘤效应基因的表达,下调免疫抑制相关基因的表达,增加肿瘤浸润淋巴细胞数量,重塑TME免疫抑制状态;三倍剂量BCG治疗可以显着抑制肿瘤生长,但也存在小鼠体重下降的不良反应。2)利用Bulk RNA-seq和q RT-PCR证实,单倍剂量BCG治疗可以上调TNBC小鼠模型肿瘤中免疫筛查位点PD-1和PD-L1的表达;在此基础上开发了单倍剂量BCG联合PD-L1抑制剂的溶瘤方案,并在TNBC小鼠模型中证实该联合治疗方案具有显着溶瘤效果且没有体重下降的不良反应。2构建表达焦亡蛋白的重组腺相关病毒载体以增强抗肿瘤免疫1)筛选出一个在昆虫Sf9细胞中不表达的哺乳动物启动子m CBA,证实了以m CBA启动子驱动GSDMNT可以避免昆虫Sf9细胞的焦亡;由此开发了利用哺乳动物启动子m CBA和杆状病毒/昆虫Sf9细胞包装表达焦亡蛋白重组腺相关病毒载体的策略,并获得了可以介导肿瘤细胞焦亡的溶瘤腺相关病毒载体P1（Oncolytic AAV P1,简称o AAV-P1）。2)证实将GSDMNT基因序列翻转并在两侧加上两对反向lox P序列可避免HEK293T细胞的焦亡,加入Cre重组酶则又可恢复GSDMNT的表达从而介导焦亡,由此开发了利用Cre重组酶和三质粒/HEK 293T细胞包装表达焦亡蛋白重组腺相关病毒载体的策略,并获得了可以介导肿瘤细胞焦亡的溶瘤腺相关病毒载体P2（Oncolytic AAV P2,简称o AAV-P2）。3)在肿瘤细胞及多形性胶质母细胞瘤（Glioblastoma Multiforme,简称GBM）大鼠模型中证实了o AAV-P2相对o AAV-P1有更好、更快的溶瘤效果,并证实此种差异与昆虫Sf9细胞包装的AAV感染性弱及m CBA启动子活性相对弱均有关。4)在GBM大鼠模型中证实,o AAV-P2介导的焦亡可以暂时性打开血脑屏障,破坏GBM的TME,招募淋巴细胞杀伤肿瘤,延长GBM大鼠模型的生存期;在TNBC小鼠模型中证实,o AAV-P2治疗可以上调肿瘤中趋化因子相关基因和抗肿瘤效应基因的表达,下调免疫抑制相关基因的表达,增加肿瘤内淋巴细胞浸润,改变TME免疫抑制状态。5)通过对TNBC小鼠模型肿瘤Bulk RNA-seq分析,发现o AAV-P2治疗可以增加肿瘤内免疫筛查位点PD-L1和PD-L2的表达,由此开发了o AAV-P2联合PD-L1阻断剂的溶瘤方案,并在TNBC小鼠模型进行了验证,证实了该联合方案具有很好的肿瘤治疗效果,可显着抑制TNBC小鼠模型肿瘤生长。本研究以TME为靶点,开发了BCG联合PD-L1阻断剂的溶瘤方案,该方案可有效治疗TNBC,为宠物临床发病率较高的乳腺癌提供了有效治疗方案;同时本研究构建了两种表达焦亡蛋白重组腺相关病毒的包装策略,获得了具有溶瘤效果的o AAV-P1和o AAV-P2;且这两种包装策略具有良好的扩展性和安全性,也可用于其他毒性蛋白的重组腺相关病毒载体的包装,为靶向TME的宠物肿瘤治疗提供了更多的备选工具。
穆睿[6]（2021）在《LIM矿化蛋白1调控人牙髓干细胞复合氧化石墨烯改性支架促进组织再生研究》文中研究说明干细胞修复受损组织在组织工程和再生医学领域受到广泛的关注与研究。人牙髓干细胞（hDPSCs）来源于神经嵴细胞迁移分化的外胚层,具备快速增殖、自我更新和特定条件下分化的能力。LIM矿化蛋白1（LMP-1）是与骨发育相关的因子,在牙本质和骨组织的构建和矿化中也起着至关重要的作用。本课题拟将LMP-1慢病毒载体转染hDPSCs,探索其对细胞定向分化的影响及潜在的调控机制。生物材料是组织工程必不或缺的要素之一。明胶海绵（GS）是一种可吸收天然高分子生物材料,因具备良好的生物相容性受到广泛应用,但由于其力学性能过低及降解过快,无法为新生组织提供足够的生长空间和时间。氧化石墨烯（GO）为石墨烯的氧化衍生物,表现出优异的亲水性和生物活性。本课题拟将GO与GS结合形成复合支架,有望改善GS的各项理化性能和生物学性能,更好的促进组织再生。目的:探索LMP-1低表达和过表达对hDPSCs的增殖及分化能力的影响,初步明确LMP-1调控hDPSCs定向分化的MAPKs通路机制。同时,将GO与GS相结合构建复合生物支架,复合LMP-1转染的hDPSCs,植入体内探索组织再生情况,评价该方案在组织工程和再生医学领域中的发展潜力。方法:利用LMP-1慢病毒载体转染hDPSCs,通过CCK-8法绘制转染后细胞的生长曲线;通过碱性磷酸酶（ALP）活性和茜素红染色检测转染后细胞的矿化能力;利用蛋白质印迹法（western blot）和实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测转染后细胞中矿化相关基因和蛋白表达水平情况,并通过western blot检测MAPK通路蛋白的磷酸化水平及矿化相关蛋白的变化。采用改良Hummers法合成GO,通过扫描电镜、透射电镜、傅里叶红外光谱仪等对GO进行理化性能检测;利用浸渍涂膜法,将少层GO均匀的涂覆在GS表面制备形成复合支架,检测复合支架的表面形貌、理化性能以及其对细胞生物学特性的影响。将LMP-1转染的hDPSCs接种至GO/GS复合支架上,移植入裸鼠背部皮下,评价在体内环境下新生组织的形成情况。结果:体外细胞实验表明,LMP-1可以调控hDPSCs的矿化,并且ERK1/2和p38 MAPK信号通路可能参与了此调控过程。GO的涂覆有效地改善了 GS支架的理化性能和生物学性能。同时,LMP-1可以诱导hDPSCs在体内环境中的生长和矿化,形成基质及成牙本质/骨样组织,伴有血管生成,并增强矿化相关生物标志DSPP、OCN和ALP的表达。结论:本研究将LMP-1转染hDPSCs后与GO/GS支架复合形成细胞与支架复合体,在组织工程和再生医学领域表现出较大的潜力。
张云峰[7]（2021）在《促绵羊iPSC生成效率的miRNAs筛选与评价及向雌性PGC样细胞定向分化研究》文中研究指明绵羊是一种非常重要的家养动物,利用基因修饰手段来改良或育种是一个方向。目前利用转基因技术进行分子育种,存在较难控制外源基因与效率较低等问题。基于小鼠胚胎干细胞（ESC）的基因打靶技术能进行精确有效的敲入或敲出。由于绵羊ESC很难分离获得,利用同样具有多能性的诱导多能干细胞（iPSC）代替ESC进行精确遗传工程操作成为目前急需解决的问题。目前绵羊的iPSC存在诱导效率低,难以获得完全重编程的iPSC的问题。microRNA是基因表达转录后的调节器,研究证明ESC特异性的miRNAs能促进体细胞重编程。因此,筛选能促绵羊体细胞重编程的miRNAs,并探讨其重编程机制,有望建立一种高效获得绵羊iPSC的体系,对优质绵羊培育具有应用价值,也为获得绵羊ESC奠定基础。生殖细胞是唯一将基因组和表观遗传信息传递给下一代的细胞谱系,但在体外重建生殖细胞发育一直是生物学研究的挑战。随着小鼠多能干细胞在体外可以分化为原始生殖细胞样细胞（PGCLC）,进而发育为卵母细胞并能进行生殖系传代,为绵羊多能干细胞在体外生产PGC提供了理论依据和方法。研究绵羊iPSC定向分化为雌性PGCLC,为绵羊PGC的发育研究可以提供一种细胞模型,为后期分化为功能卵子奠定了基础,对提高绵羊优质配子利用,加快畜群的改良速度具有重要的应用价值。目的:（1）筛选出能促进绵羊体细胞重编程的microRNA;（2）初步探索microRNA在绵羊体细胞重编程过程中的机制;（3）建立一种利用绵羊iPSC诱导分化为原始生殖样细胞的方法。方法:（1）组织块法分离培养妊娠45d左右的绵羊胎儿肾细胞（SKC）,作为重编程的起始细胞;胰酶消化法分离CF-1小鼠胎儿成纤维细胞（MEF）,丝裂霉素C处理后,作为诱导绵羊iPSC的饲养层细胞。（2）结合文献报道和数据库综合分析在小鼠和人干细胞中高表达或可促进重编程的miRNAs,筛选出可能促绵羊体细胞重编程的miR302/367簇、miR200b-200a-429簇、miR200c-141簇,并包装慢病毒;同时将Oct4、Klf4、Sox2、c-Myc、Nanog、Lin28、SV40T、h TERT等八种人源转录因子包装慢病毒;利用不同慢病毒感染SKC进行诱导重编程,通过碱性磷酸酶（AP）染色统计诱导效率,筛选出可促进绵羊体细胞重编程的最优miRNA;并对获得的绵羊iPSC从AP染色、实时定量PCR、细胞免疫荧光、核型分析、甲基化测序分析、拟胚体分化这几个方面进行鉴定。（3）利用miRbase和Target Scan等生物信息平台预测miR-200c靶基因,并送公司合成oar-miR-200c模拟物、抑制物和阴性对照;设计引物,克隆靶基因结合位点的3’UTR区及突变3’UTR,构建ZEB1和TWISTNB靶基因的双荧光素酶报告分析载体。（4）通过oar-miR-200c mimics转染细胞,利用荧光素酶报告载体分析与靶基因的作用;利用qRT-PCR检测靶基因的转录水平;利用Western blot检测靶基因的蛋白水平;探讨oar-miR-200c在绵羊体细胞重编程过程的作用机制。（5）设计引物,扩增克隆绵羊生殖相关基因DAZL和BOULE,并构建慢病毒载体PLVX-Dazl和PLVX-Boule,并进行包装慢病毒。（6）组织块法分离培养原代绵羊卵巢细胞;DAZL和BOULE慢病毒感染绵羊iPSC,建立转基因绵羊iPSC;通过摸索培养体系和条件,利用绵羊iPSC定向分化原始生殖细胞;利用qRT-PCR检测绵羊生殖细胞特异因子的转录水平,利用Western blotting检测生殖细胞特异因子的蛋白水平。结果:（1）成功分离绵羊体细胞SKC,其表达角蛋白CK18;成功分离小鼠CF-1MEF细胞,并制备饲养层细胞,能很好的支持siPSC生长。（2）筛选的三个miRNA簇,成功包装miRNA慢病毒;成功包装8种转录因子的慢病毒;慢病毒感染绵羊SKC后,通过诱导效率比较分析,筛选出miR-200c-141簇可将重编程效率提高到0.95%;获得的绵羊iPSC经鉴定呈阳性;（3）成功构建miR-200c靶基因ZEB1和TWISTNB的双荧光素酶报告载体;（4）双荧光素酶报告分析,oar-miR-200c靶向ZEB1和TWISTNB的3’UTR;qRT-PCR和Western blotting检测oar-miR-200c可显着降低ZEB1和TWISTNB基因的表达,但可增加E-cadherin的表达;oar-miR-200c通过对TGF-β信号通路的影响,提高MET转化,从而提高绵羊体细胞重编程效率;（5）成功构建绵羊生殖相关基因慢病毒载体LVX-Dazl-F2A-mcherry-IRES-NEO和PLVX-Boule-F2A-mcherry-IRES-NEO,并成功包装慢病毒;（6）成功建立稳转Dazl和Boule基因的绵羊iPSC,在培养液中添加Activin A、bFGF、BMP4、LIF、EGF等因子及卵巢细胞培养上清,可使绵羊iPSC分化为PGC样细胞,分化第八天可表达生殖相关标记蛋白PRDM1、PRDM14和VASA,其基因Dazl、Boule、Prdm14和Vasa的mRNA转录呈高水平状态。结论:（1）成功筛选出miR-200c-141可以促进绵羊体细胞重编程为iPSC;（2）oar-miR-200c靶向Zeb1和Twist NB基因的3’UTR,显着降低Zeb1和Twist NB表达水平,增加E-cadherin的表达;oar-miR-200c通过对TGF-β信号通路的影响,提高MET转化,从而提高绵羊体细胞重编程效率。（3）利用生殖系相关基因DAZL和BOULE的慢病毒感染绵羊iPSC,在添加activin A、b FGF、BMP4、LIF、EGF等因子的条件下,可以将绵羊iPSC诱导分化为原始生殖样细胞。
马剑鹤[8]（2021）在《内质网靶向基因递送系统的构建及转染性能研究》文中提出基因治疗是利用基因来预防或治疗疾病的独特技术。基因治疗技术通过将基因插入患者细胞而不是使用药物或手术来治疗疾病。基因递送系统对于疾病的基因治疗是必不可少的。病毒类载体和非病毒类载体是目前用于基因递送的主要载体。其中病毒类载体具有很高的基因转染效率,但因其具有较高毒性、基因负载能力低等缺点,限制了病毒类载体真正走向市场。聚乙烯亚胺（PEI）是目前广泛应用的非病毒类载体之一。PEI具有较好的质子缓冲能力,可以通过“质子海绵”效应从内体中逃逸。大分子量的PEI具有很强的细胞毒性,小分子量的PEI毒性很小,但转染效率也差。所以,开发兼具高转染效率和低毒性的非病毒载体是一个重要的研究方向。内质网是连续的膜状结构,它与多种细胞器（核膜、高尔基体等）均有联系,尤其是与核膜直接相连。所以,基于内质网靶向基因载体的开发具有很广阔的应用前景。受内质网荧光染料结构的启发,本论文将内质网靶向分子4-[2-（4-氨磺酰基-苯基）-乙基氨基甲酰基]-丁酸（SPEBA）与小分子量PEI结合,通过优化筛选,得到了内质网靶向基因递送系统PEI-ER。研究结果:（1）一系列理化性质的表征证明了材料的成功合成,得出了结合比例,验证了它具有良好的DNA复合能力和质子缓冲能力。（2）体外实验表明,PEI-ER具有良好的溶血性和细胞毒性,并且SPEBA和PEI以0.5:1摩尔比制得的材料具有最好的转染效率,不同分子量PEI修饰后的转染实验证明了SPEBA的修饰能够增加转染效率。（3）细胞摄取实验结果说明大部分PEI-ER/DNA复合物经小窝蛋白介导的内吞进入细胞,然后靶向内质网并释放DNA。综上所述,本研究制备了一种内质网靶向基因递送系统（PEI-ER）,PEI-ER/DNA复合物通过小窝蛋白介导的内吞进入细胞,然后靶向内质网并释放DNA,最终借助内质网与核膜的密切联系实现转染过程。该载体结构简单,毒性低,基因转染效率高,有很大的应用前景。
王浩[9]（2021）在《多级微环境“自适型”基因递送系统的构建及评价》文中研究指明中心法则提出之后,人们认识到疾病发生的根源是基因发生有害缺陷或突变,基因治疗应运而生。但由于基因本身易被降解的缺陷,需要载体来负载基因进行治疗。病毒载体虽然具有极高的基因转染效率,但其免疫原性致命,且外源基因可能会永久整合到宿主细胞染色体中,存在潜在的诱癌风险,近年来,随着纳米医学技术的发展,非病毒载体由于便于功能化修饰在递送基因过程中取得理想的效果,成为目前研究的热点。本研究针对非病毒载体在递送基因过程中所面临的多级生理屏障,设计合成了一种具有多级响应性的基因递送系统。以聚赖氨酸（PLys）为核心,二硫键（S-S）交联结合基因,温敏中间层聚丙基丙烯酰胺（PNIPAM）保护基因,聚乙二醇（PEG）外壳延长血液循环时间,主动靶向（RGD）增加肿瘤富集,基质金属蛋白酶2（MMP-2）响应短肽（GPLGVRG）去PEG化增加内吞以及胞内运输效率。本研究为基因治疗提供了一种可行性策略,具体研究内容如下:1、阳离子载体的合成与表征通过酰胺反应、点击反应和开环聚合反应等合成方法合成了多个基因递送载体PEG-PLys-SH、PEG-GPLGVRG-PLys-SH、RGD-PEG-GPLGVRG-PLys-SH、PNIPAM-PLys-SH.2、载体/基因复合物的制备及理化性质通过琼脂糖凝胶电泳实验和肝素竞争实验验证了载体结合基因的能力及稳定性;动态光散射（DLS）观察复合物的粒径及电位,各载体/基因复合物粒径80-90 nm,电位3-5 m V,接近电中性;MTT细胞毒性实验证实了细胞存活率高,载体生物相容性好。3、载体及载体/基因复合物各级微环境响应性及基因转染通过琼脂糖凝胶电泳实验和肝素竞争实验验证了复合物胞内还原环境响应性;核酸酶保护、DLS、透射电子显微镜（TEM）、核磁共振氢谱（1H NMR）验证温敏复合物温度响应性,温度由室温升高至生理温度,中间屏障由亲水变为疏水;激光共聚焦显微镜（CLSM）、流式细胞仪（FCM）验证主动靶向性,加入RGD细胞摄取效率增加约3倍;凝胶渗透色谱（GPC）、DLS、CLSM、FCM、乳酸脱氢酶（LDH）活性实验验证MMP响应去PEG化性能,去PEG化之后载体分子量有明显变化,复合物电位升高,细胞摄取能力增加约6倍,溶酶体逃逸速度加快;倒置荧光显微镜观察了复合物的基因转染能力,加入主动靶向RGD以及去PEG化策略都提升了复合物的基因转染能力。4、温敏载体/基因复合物联合索拉菲尼体内抑癌能力通过荷瘤小鼠体内抑癌实验,证明相较于单基因和药物治疗组,联合治疗组肿瘤体积增长最为缓慢,抑癌效果最为明显;苏木精-伊红（HE）染色结果表明所有治疗组均对小鼠主要器官没有明显的毒副作用;血管内皮生长因子（VEGF）免疫组化验证了治疗基因通过抑制VEGF表达达到抗肿瘤效果。
李守湖[10]（2020）在《虹鳟传染性造血器官坏死病-传染性胰腺坏死病二联活载体疫苗的研制》文中研究表明传染性造血器官坏死病病毒（IHNV）主要引起以鲑鳟鱼类感染为主的传染性造血器官坏死病（IHN）,该病能对自然条件下及人工养殖的鲑鳟鱼类造成主要以肾脏和脾脏等造血器官出血、坏死为主要特征的高度接触性传染病。该病的病原IHNV是一种负向单链RNA病毒,隶属于弹状病毒科的诺拉弹状病毒属。传染性胰腺坏死病（IPN）是由传染性胰腺坏死病病毒（IPNV）引起的一种以鲑鳟鱼类感染为主的传染病,该病给鲑鳟鱼类的养殖业造成了严重的经济损失。该病的病原IPNV是一种双RNA病毒,隶属于双RNA病毒科的水生双链RNA病毒属,是目前已知鱼类病毒病中最小的RNA病毒。该两种疫病主要危害鲑鳟鱼类的幼鱼和鱼苗,在鱼苗和幼鱼中致死率均在90%以上,IHN被我国水生动物口岸确定为一类检疫对象,也是我国农业农村部列为的二类动物疫病。IHN与IPN分别于1990年和1986年在我国东北地区首次被发现,该两种疫病均给世界各国的鲑鳟鱼类的养殖带来了沉重的打击,严重的影响了多个国家的水产养殖业。1.通过鲤鱼上皮瘤细胞（EPC）分别对IHNV和IPNV进行盲传培养,先在14℃时对病毒进行盲传,待到细胞接种病毒出现稳定的病变时开始升温,直至温度升高到18℃为止,将收集的病毒液进行正常EPC细胞的传代。本试验中成功的驯化出一株IHNV,16-18℃条件下48h可出现稳定的病变,命名为IHNV GS株。同时驯化出一株IPNV,18-20℃条件下48-60h可出现稳定的病变。利用PCR方法对分离出的IHNV GS株和IPNV GS株分别进行保守基因的扩增,从分子水平方面对两种病毒建立了诊断方法,对甘肃省永登县疑似暴发的IHN疫情和甘肃省永靖县疑似暴发的IPN分别进行了确诊,并对IHNV G基因和IPNV VP2基因分别进行了系统进化树的分析,结果显示,IHNV G基因与国外IHNV的代表性毒株IHNV Ch YU78、IHNV Auke77、IHNV Ch Ab76和IHNV HV7601有相对较近的遗传关系,IPNV VP2基因与与国外IPNV代表性毒株IPNV SP、IPNV Denizli05、IPNV HAH-3和IPNV Ka 470/07的遗传关系较近。对IHNV和IPNV分别建立的分子诊断方法,结合本试验中建立的通过细胞系对鲑鳟鱼类病毒进行分离、培养的方法,为临床上更好的对IHNV和IPNV的诊断提供了理论依据。2.为分别克隆传染性造血器官坏死病（IHNV）G基因、连接肽F2A基因和传染性胰腺坏死病VP2基因,构建IHNV G基因、F2A基因和IPNV VP2基因的重组腺病毒载体。利用PCR技术扩增出IHNV G基因、F2A基因和IPNV VP2基因,利用多片段快速融合技术将IHNV G基因、F2A基因和IPNV VP2基因插入到腺病毒穿梭载体中,经过线性化的腺病毒穿梭载体与腺病毒骨架载体在大肠杆菌内发生重组,构建成带有靶基因的重组质粒,利用PCR对靶基因的扩增及NotⅠ和HindⅢ双酶切鉴定后,经PacⅠ酶切后,回收的目的片段用于转染293细胞而进行病毒的包装,获得带有靶基因的重组腺病毒,通过观察重组腺病毒的绿色荧光来监控病毒,用Western-blot法分别检测G蛋白和VP2蛋白的表达,并利用TCID50方法测定重组病毒的滴度。结果显示,本试验成功克隆出IHNV G基因、F2A基因和IPNV VP2基因,基因总长度为3036bp,。成功构建了IHNV G、F2A基因和IPNV VP2基因的重组腺病毒。绿色荧光蛋白（GFP）监测显示,带有靶基因的重组腺病毒被转染成功。重组腺病毒能在293细胞中分别表达出约58 k D产物（G蛋白）和54 k D（VP2蛋白）的产物,表达的分子质量与预期相符,重组病毒的TCID50能达到1.0×1010.0m L-1。结果表明,成功构建带有IHNV G基因和IPNV VP2基因的重组腺病毒载体,重组腺病毒的滴度稳定且较高。3.为评测IHN-IPN二联活载体疫苗对免疫后虹鳟在IHNV和IPNV感染时的保护效果。通过浸泡途径免疫虹鳟,含有IHNV G基因和IPNV VP2基因的活载体疫苗在虹鳟鱼中诱导了保护性免疫应答。q RT-PCR显示,在接种的虹鳟鱼脾脏中IHNV G基因和IPNV VP2基因的表达在3dpv（days post-vaccination,dpv）达到最高水平,在3dpv到15dpv之间逐渐降低。在3dpv到15dpv之间TLR-3、TLR-7和TLR-8的表达呈上调,IFN-1、Mx-1、Mx-3、Vig-1和Vig-2的表达水平在3 dpv时检测到最高表达。与对照组相比,3dpv和15 dpv之间,接种虹鳟的脾脏中适应性免疫应答的四个标记物（CD4、CD8、Ig M和Ig T）的表达持续增加。为获得最佳的保护效果,先将活载体疫苗以1:100的稀释度稀释,然后把幼体虹鳟在疫苗稀释液中浸泡10 min。疫苗接种的虹鳟和对照组（空载体对照病毒接种组）之间的累积死亡率百分比差异显着。抗体中和试验结果表明,接种的虹鳟显示出高水平的抗IHNV和抗IPNV感染的血清抗体,并且在IPNV攻击后相对存活率百分比（RPS）达到87.5%,在IPNV攻击后相对存活率百分比（RPS）达到86.84%。试验结果表明,我们构建的活载体疫苗,可用于保护虹鳟免受IHNV和IPNV感染。综上所述,本试验分别建立了IHNV和IPNV的细胞和分子诊断的方法,构建出带有IHNV G基因和IPNV VP2基因的重组腺病毒,评测了活载体疫苗免疫虹鳟后对于IHNV和IPNV感染时的保护效果,为下一步对传染性造血器官坏死病和传染性胰腺坏死病临床上更好的防控提供了参考。
二、三种非病毒载体转染方法的比较（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、三种非病毒载体转染方法的比较（论文提纲范文）
（1）MERS-CoV与SARS-CoV-2亚单位疫苗与核酸疫苗研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 引言 |
| 1. 冠状病毒概述 |
| 1.1 冠状病毒结构 |
| 1.2 冠状病毒的感染与复制 |
| 1.3 人类冠状病毒 |
| 2. 冠状病毒动物模型研究进展 |
| 3. MERS-CoV与SARS-CoV-2疫苗研究进展 |
| 3.1 灭活病毒疫苗 |
| 3.2 亚单位疫苗与病毒样颗粒疫苗 |
| 3.3 重组病毒载体疫苗 |
| 3.4 核酸疫苗 |
| 4. 研究背景与目的 |
| 实验材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 生物学材料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 质粒构建 |
| 2.2 疫苗制备 |
| 2.3 抗原检测及表达验证 |
| 2.4 动物免疫与分组 |
| 2.5 免疫学检测 |
| 2.6 攻毒保护实验 |
| 2.7 统计学分析 |
| 结果 |
| 第一部分 MERS-CoV重组亚单位疫苗与mRNA疫苗研究 |
| 前言 |
| (一) MERS-CoV重组RBD抗原亚单位疫苗研究 |
| 1. MERS-CoV RBD重组蛋白设计与制备 |
| 1.1 MERS-CoV RBD重组抗原设计与构建 |
| 1.2 MERS-CoV RBD重组抗原蛋白的制备与鉴定 |
| 2. 重组抗原蛋白RBD-T4f的免疫原性初步研究 |
| 2.1 重组蛋白RBD-T4f诱导高水平的中和抗体 |
| 2.2 重组蛋白RBD-T4f可以诱导特异性细胞免疫应答 |
| 3. 重组抗原蛋白RBD-T4f的黏膜免疫应用研究 |
| 3.1 重组蛋白RBD-T4f配合黏膜佐剂诱导系统性体液免疫应答 |
| 3.2 重组蛋白RBD-T4f配合黏膜佐剂诱导呼吸道高水平中和IgA |
| 3.3 重组蛋白RBD-T4f配合黏膜佐剂诱导肺组织细胞免疫应答 |
| (二) MERS-CoV mRNA疫苗研究 |
| 1. 自扩增mRNA疫苗制备优化与体内表达研究 |
| 1.1 自扩增mRNA分子体外转录制备优化 |
| 1.2 自扩增mRNA疫苗分子可在小鼠体内持续表达目的蛋白 |
| 2. 基于重组三聚体靶抗原RBD-T4f的两种mRNA疫苗的设计与构建 |
| 2.1 重组抗原mRNA与自扩增mRNA疫苗设计 |
| 2.2 重组抗原mRNA与自扩增mRNA的表达验证 |
| 3. 重组抗原RBD-T4f的两种mRNA疫苗的免疫原性研究 |
| 3.1 重组抗原mRNA疫苗可诱导有限的体液免疫应答 |
| 3.2 重组抗原mRNA疫苗与自扩增mRNA疫苗诱导较强的细胞免疫应答 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 SARS-CoV-2核酸疫苗研究 |
| 前言 |
| (一) SARS-CoV-2 DNA疫苗免疫原性与保护性研究 |
| 1. SARS-CoV-2 DNA疫苗构建与表达鉴定 |
| 2. SARS-CoV-2 DNA疫苗免疫原性研究 |
| 2.1 SARS-CoV-2 DNA疫苗可以诱导中和活性抗体 |
| 2.2 SARS-CoV-2 DNA疫苗诱导Th1型细胞免疫应答 |
| 3. SARS-CoV-2 DNA疫苗免疫后可产生攻毒保护效果 |
| (二) SARS-CoV-2 mRNA疫苗免疫原性与保护性研究 |
| 1. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗物理性状与表达鉴定 |
| 2. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗免疫原性研究 |
| 2.1 mRNA-LPP疫苗诱导高中和活性且较为持久的体液免疫应答 |
| 2.2 mRNA-LPP疫苗诱导广谱中和活性抗体 |
| 2.3 mRNA-LPP疫苗可以诱导高水平Th1型细胞免疫应答 |
| 3. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗可产生持久的保护性 |
| 4. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗与DNA疫苗免疫效果比较 |
| 5. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗恒河猴攻毒保护效果评价 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文总结 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）基于睾丸支持细胞研究4.1R蛋白在少精症小鼠模型中的作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 中英文缩略词表 |
| 第一章 研究背景 |
| 1 少精症与动物模型 |
| 2 少精症与精子发生 |
| 3 4.1R蛋白与精子发生 |
| 4 血睾屏障与精子发生 |
| 5 Wnt/β-catenin信号通路与精子发生 |
| 6 研究意义与内容 |
| 7 试验方案 |
| 第二章 4.1R蛋白在少精症小鼠模型中的表达与作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料、仪器与试剂 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 仪器 |
| 2.3 试剂 |
| 3 方法 |
| 3.1 少精症小鼠模型的建立 |
| 3.2 睾丸组织中4.1R蛋白表达水平检测 |
| 3.3 睾丸组织中epb41 基因转录水平检测 |
| 3.4 睾丸组织中4.1R蛋白表达分布检测 |
| 3.5 血睾屏障功能分析 |
| 3.6 统计方法 |
| 4 结果 |
| 4.1 少精症模型小鼠精子密度测定 |
| 4.2 少精症模型小鼠附睾和睾丸形态学检测 |
| 4.3 4.1R蛋白在小鼠睾丸组织中的表达 |
| 4.4 少精症小鼠睾丸中epb41 基因转录水平检测 |
| 4.5 少精症小鼠睾丸组织中4.1R蛋白表达分布 |
| 4.6 少精症模型小鼠血睾屏障功能分析 |
| 4.7 少精症模型小鼠睾丸中Wnt/β-catenin信号通路组分转录检测 |
| 4.8 少精症模型小鼠睾丸中Wnt/β-catenin信号通路组分蛋白表达 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第三章 4.1R蛋白表达对睾丸支持细胞增殖和连接的调节作用研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料、仪器与试剂 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 仪器 |
| 2.3 试剂 |
| 3 方法 |
| 3.1 Epb41 基因CRISPR-cas9 质粒载体构建与验证 |
| 3.2 CRISPR-Cas9 慢病毒载体构建 |
| 3.3 过表达慢病毒载体的构建 |
| 3.4 TM4 细胞培养 |
| 3.5 原代睾丸支持细胞培养 |
| 3.6 Lenti-Cas9-sgRNA-EGFP慢病毒载体转染TM4 细胞 |
| 3.7 Lenti-Cas9-sgRNA-EGFP慢病毒载体转染原代睾丸支持细胞 |
| 3.8 过表达慢病毒载体转染TM4 细胞 |
| 3.9 过表达慢病毒载体转染原代睾丸支持细胞 |
| 3.10 慢病毒载体转染后TM4 细胞增殖检测 |
| 4 结果 |
| 4.1 Epb41-sg RNAs与 pGL3-U6-sg RNA-puromycin和 pSpCas9(BB)-2A-GFP载体连接 |
| 4.2 pGL3-U6-epb41-sg RNAa-puromycin和 pSpCas9(BB)-epb41-sg RNAb-2A-GFP共转染N2a细胞 |
| 4.3 Lenti-Cas9-sgRNA-EGFP 慢病毒载体检测 |
| 4.4 过表达慢病毒载体的构建与验证 |
| 4.5 慢病毒载体转染TM4 细胞 |
| 4.6 慢病毒载体转染原代睾丸支持细胞 |
| 4.7 慢病毒载体转染后TM4 细胞增殖检测 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第四章 4.1R蛋白表达对体内睾丸支持细胞间连接的调节作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料、仪器与试剂 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 仪器 |
| 2.3 试剂 |
| 3 方法 |
| 3.1 质粒载体电转染小鼠活体睾丸组织 |
| 3.2 慢病毒载体睾丸活体转染 |
| 3.3 小鼠活体睾丸转染效果验证 |
| 4 结果 |
| 4.1 质粒载体活体电转染睾丸组织方法验证 |
| 4.2 重组CRISPR-Cas9 基因敲除质粒载体电转染睾丸 |
| 4.3 过表达慢病毒载体转染睾丸 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 1 总结 |
| 2 创新点 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 在读期间发表论文和研究成果等 |
| 导师简介 |
| 附件 |
（3）基于遗传密码扩展技术构建复制可控的重组口蹄疫病毒的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 遗传密码子扩展技术 |
| 1.1.1 遗传密码的扩展与非天然氨基酸 |
| 1.1.2 遗传密码子扩展技术原理 |
| 1.1.3 遗传密码子扩展技术的应用 |
| 1.1.4 遗传密码子扩展技术在病毒学领域的应用 |
| 1.1.5 小结 |
| 1.2 口蹄疫及其疫苗研究进展 |
| 1.2.1 口蹄疫概述 |
| 1.2.2 口蹄疫病毒的分子生物学特征 |
| 1.2.3 口蹄疫疫苗 |
| 1.2.4 小结 |
| 1.3 选题的目的和意义 |
| 1.4 研究的主要内容和基本思路 |
| 1.4.1 本研究的主要内容 |
| 1.4.2 本研究的基本思路 |
| 第二章 携带琥珀密码子解码机制的正交翻译稳定细胞系的构建 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 生物材料 |
| 2.1.2 试剂和耗材 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 基因设计与合成 |
| 2.2.2 质粒DNA的提取 |
| 2.2.3 质粒构建 |
| 2.2.4 细胞转染 |
| 2.2.5 细胞系的筛选 |
| 2.2.6 正交翻译功能的鉴定 |
| 2.2.7 实时荧光定量PCR |
| 2.2.8 Western Blot |
| 2.2.9 病毒包装 |
| 2.2.10 病毒TCID_(50)的测定 |
| 2.2.11 细胞总RNA的提取 |
| 2.2.12 数据统计学分析 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 正交翻译元件表达质粒构建与鉴定 |
| 2.3.2 琥珀终止密码子解码功能的鉴定 |
| 2.3.3 非天然氨基酸插入效率的鉴定 |
| 2.3.4 正交翻译细胞克隆的筛选与鉴定 |
| 2.3.5 非天然氨基酸浓度对正交翻译的影响 |
| 2.3.6 转基因细胞系的遗传稳定性分析 |
| 2.3.7 转基因细胞系对病毒拯救系统的兼容性 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 携带提前终止密码子的重组FMDV的构建与拯救 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 生物材料 |
| 3.1.2 试剂和耗材 |
| 3.1.3 仪器设备 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 氨基酸突变位点的选择 |
| 3.2.2 氨基酸的保守性分析 |
| 3.2.3 PTC-FMDV的设计与构建 |
| 3.2.4 重组PTC-FMDV的拯救 |
| 3.2.5 病毒RNA的提取 |
| 3.2.6 重组PTC-FMDV的鉴定 |
| 3.2.7 病毒包装效率的评估 |
| 3.2.8 重组PTC-FMDV的遗传稳定性分析 |
| 3.2.9 病毒噬斑纯化 |
| 3.2.10 双点PTC-FMDV的设计与拯救 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 重组PTC-FMDV构建的可行性探索 |
| 3.3.2 FMDV蛋白的氨基酸保守性分析 |
| 3.3.3 PTC突变位点的筛选 |
| 3.3.4 重组PTC-FMDV包装效率的评估 |
| 3.3.5 重组PTC-FMDV遗传稳定性分析 |
| 3.3.6 病毒噬斑纯化结果 |
| 3.3.7 Dual-PTC-FMDV的构建与评估 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 携带四联体密码子的重组FMDV的构建与拯救 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 生物材料 |
| 4.1.2 试剂和耗材 |
| 4.1.3 仪器设备 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 基因合成 |
| 4.2.2 质粒构建 |
| 4.2.3 细胞转染 |
| 4.2.4 四联体密码子解码功能的鉴定 |
| 4.2.5 非天然氨基酸的筛选 |
| 4.2.6 细胞系的筛选 |
| 4.2.7 细胞系的鉴定 |
| 4.2.8 重组TAGA-FMDV拯救质粒的构建 |
| 4.2.9 重组TAGA-FMDV的拯救 |
| 4.2.10 重组TAGA-FMDV突变体的鉴定 |
| 4.2.11 重组TAGA-FMDV的遗传稳定性分析 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.3.1 四联体密码子解码元件表达质粒的构建与鉴定 |
| 4.3.2 四联体密码子解码功能的鉴定 |
| 4.3.3 非天然氨基酸的筛选 |
| 4.3.4 稳定细胞系的筛选与鉴定 |
| 4.3.5 重组TAGA-FMDV拯救质粒的构建与鉴定 |
| 4.3.6 重组TAGA-FMDV的拯救 |
| 4.3.7 重组TAGA-FMDV的鉴定 |
| 4.3.8 重组TAGA-FMDV的遗传稳定性分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录A 表A-1实时荧光定量PCR引物和探针序列表 |
| 附录B 表B-1PTC-FMDV构建引物序列表 |
| 附录C 表C-1TAGA-FMDV构建引物序列表 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）锍修饰的PEI化合物的合成及其作为基因载体能力的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 基因治疗 |
| 1.2 病毒型基因载体 |
| 1.2.1 逆转录病毒(RV) |
| 1.2.2 腺病毒(AV) |
| 1.2.3 腺相关病毒(AAV) |
| 1.2.4 慢病毒(LV) |
| 1.2.5 单纯疱疹病毒(HSV) |
| 1.3 非病毒型基因载体 |
| 1.3.1 阳离子脂质体 |
| 1.3.2 阳离子聚合物 |
| 1.4 锍类化合物研究进展 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验仪器 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 菌株及细胞株 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 锍类聚合物的设计 |
| 2.2.2 锍类聚合物结构表征 |
| 2.2.3 锍类聚合物性能测试 |
| 2.2.4 锍类聚合物细胞毒性测定 |
| 2.2.5 锍类聚合物细胞内分布情况测定 |
| 2.2.6 锍类聚合物转染能力测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 锍类聚合物的合成及表征 |
| 3.1.1 化合物SI合成及表征 |
| 3.1.2 聚合物SIPEI合成及表征 |
| 3.2 锍类聚合物与DNA复合能力测定 |
| 3.3 锍类聚合物与 DNA复合物粒径大小与Zeta电势测定 |
| 3.4 锍类聚合物细胞毒性测定 |
| 3.5 锍类聚合物细胞内分布情况测定 |
| 3.6 锍类聚合物转染能力测定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 锍类聚合物的合成 |
| 4.1.1 化合物SI的合成 |
| 4.1.2 聚合物SIPEI的合成 |
| 4.1.3 聚合物SIPEI的表征 |
| 4.2 纳米粒子制备通法 |
| 4.3 琼脂糖凝胶阻滞实验 |
| 4.4 锍类聚合物细胞毒性测定 |
| 4.5 锍类聚合物细胞内分布情况测定 |
| 4.6 锍类聚合物转染能力测定 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）卡介苗与焦亡溶瘤策略的构建及其在宠物肿瘤治疗中的应用初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(Abbreviations) |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 宠物肿瘤 |
| 1.2 肿瘤免疫疗法 |
| 1.3 免疫筛查阻断疗法 |
| 1.3.1 免疫筛查位点阻断疗法的机遇与挑战 |
| 1.4 肿瘤免疫疗法新靶点——肿瘤微环境 |
| 1.4.1 肿瘤微环境概述 |
| 1.4.2 “加热”肿瘤微环境的方法 |
| 1.5 卡介苗 |
| 1.5.1 卡介苗概述 |
| 1.5.2 卡介苗的非特异性效应及应用 |
| 1.5.3 卡介苗在肿瘤免疫治疗中的应用 |
| 1.6 焦亡 |
| 1.6.1 焦亡概述 |
| 1.6.2 焦亡的分子机制 |
| 1.6.3 焦亡在肿瘤治疗中的应用 |
| 1.7 重组腺相关病毒载体 |
| 1.7.1 重组腺相关病毒载体概述 |
| 1.7.2 重组腺相关病毒载体的包装及纯化 |
| 1.7.3 重组腺相关病毒载体在肿瘤治疗中的应用 |
| 1.7.4 携带细胞毒性基因重组腺相关病毒载体的包装策略 |
| 1.8 三阴性乳腺癌 |
| 1.9 多形性胶质母细胞瘤 |
| 第二章 目的及意义 |
| 第三章 材料和方法 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 菌株、细胞系、病毒和实验动物 |
| 3.1.2 载体与质粒 |
| 3.1.3 流式抗体及药物 |
| 3.1.4 工具酶及主要试剂 |
| 3.1.5 细胞培养及转染产品 |
| 3.1.6 主要的培养基、抗生素、缓冲液及其配制 |
| 3.1.7 实验设备 |
| 3.1.8 相关软件 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 感受态细胞的制备 |
| 3.2.2 质粒构建 |
| 3.2.3 细胞及BCG培养 |
| 3.2.4 4T1-luc及 C6-luc细胞系的构建 |
| 3.2.5 三阴性乳腺癌小鼠模型构建 |
| 3.2.6 BCG治疗对三阴性乳腺癌小鼠模型TME的影响 |
| 3.2.7 BCG治疗三阴性乳腺癌小鼠模型 |
| 3.2.8 BCG治疗对三阴性乳腺癌小鼠模型肿瘤转录组的影响 |
| 3.2.9 单倍剂量卡介苗和抗PD-L1 联合治疗TNBC小鼠模型 |
| 3.2.10 三质粒包装系统包装r AAV |
| 3.2.11 杆状病毒包装系统包装r AAV |
| 3.2.12 r AAV纯化及滴度测定 |
| 3.2.13 哺乳动物启动子的筛选 |
| 3.2.14 利用杆状病毒包装系统包装表达GSDMD~(NT)的oAAV-P1 |
| 3.2.15 利用三质粒包装系统包装表达GSDMD~(NT)的oAAV-P2 |
| 3.2.16 oAAV-P1和oAAV-P2 细胞实验 |
| 3.2.17 oAAV-P1和oAAV-P2 治疗GBM大鼠模型 |
| 3.2.18 oAAV-P2 治疗TNBC小鼠模型 |
| 3.2.19 oAAV-P2 联合抗PD-L1 治疗TNBC小鼠模型 |
| 3.2.20 oAAV-P2 治疗TNBC裸鼠模型 |
| 3.2.21 rAAV瘤内注射安全性实验 |
| 3.2.22 表达GSDM~(NT)蛋白oAAV系统通用性验证 |
| 3.2.23 利用诱导型启动子包装表达GSDMD~(NT)蛋白的rAAV |
| 3.2.24 oAAV-P2 在临床宠物肿瘤治疗中的应用 |
| 第四章 利用卡介苗靶向肿瘤微环境增强抗肿瘤免疫 |
| 4.1 卡介苗治疗增加了TNBC小鼠模型TME中浸润淋巴细胞数量 |
| 4.2 卡介苗治疗抑制TNBC小鼠模型肿瘤生长 |
| 4.3 卡介苗治疗上调了TNBC小鼠模型肿瘤内PD-L1 的表达 |
| 4.4 单倍剂量卡介苗联合PD-L1 阻滞剂可有效抑制TNBC小鼠模型肿瘤生长 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 构建表达焦亡蛋白的重组腺相关病毒载体以增强抗肿瘤免疫 |
| 5.1 利用哺乳动物启动子包装rAAV-GSDM~(NT) |
| 5.1.1 哺乳动物启动子m CBA的鉴定 |
| 5.1.2 哺乳动物启动子m CBA的分析 |
| 5.1.3 oAAV-P1 的包装 |
| 5.2 利用四环素诱导型启动子包装rAAV-GSDM~(NT) |
| 5.3 利用Cre/lox重组酶系统包装r AAV-GSDM~(NT) (oAAV-P2) |
| 5.4 oAAV-P1和oAAV-P2 可以使肿瘤细胞焦亡 |
| 5.5 oAAV-P1和oAAV-P2 诱导细胞焦亡的效率不同 |
| 5.6 oAAV-P1 治疗原位多形性胶质母细胞瘤大鼠模型 |
| 5.7 oAAV-P2 治疗原位多形性胶质母细胞瘤大鼠模型 |
| 5.7.1 oAAV-P2在GBM大鼠模型中有很好的疗效 |
| 5.7.2 oAAV-P2在GBM大鼠模型中可以暂时性打开血脑屏障 |
| 5.7.3 oAAV-P2 治疗双侧接种瘤的GBM大鼠模型 |
| 5.8 oAAV-P2 治疗原位三阴性乳腺癌小鼠模型 |
| 5.9 oAAV-P2 治疗TNBC小鼠模型肿瘤浸润淋巴细胞单细胞转录组分析 |
| 5.10 oAAV-P2 治疗TNBC裸鼠模型 |
| 5.11 oAAV-P2 治疗TNBC小鼠模型肿瘤转录组分析 |
| 5.12 oAAV-P2 治疗TNBC小鼠模型肿瘤浸润淋巴细胞流式分析 |
| 5.13 oAAV-P2 联合PD-L1 阻断治疗TNBC小鼠模型 |
| 5.14 rAAV瘤内注射的安全性评价 |
| 5.15 表达GSDM~(NT)蛋白oAAV系统通用性验证 |
| 5.16 oAAV-P2 在临床宠物肿瘤治疗中的初步应用 |
| 第六章 讨论 |
| 6.1 利用卡介苗靶向肿瘤微环境增强抗肿瘤免疫 |
| 6.2 构建表达焦亡蛋白的重组腺相关病毒载体以增强抗肿瘤免疫 |
| 6.3 宠物肿瘤治疗前瞻 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（6）LIM矿化蛋白1调控人牙髓干细胞复合氧化石墨烯改性支架促进组织再生研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 人牙髓干细胞的分离、培养及鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要材料和试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 hDPSCs的分离、纯化和培养 |
| 2.2 hDPSCs的鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 hDPSCs的分离、纯化和培养 |
| 3.2 hDPSCs的鉴定 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第二章 LMP-1对hDPSCs增殖与定向分化能力的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要材料和试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 慢病毒预感染hDPSCs |
| 2.2 慢病毒转染hDPSCs后LMP-1表达情况检测 |
| 2.3 慢病毒转染hDPSCs后细胞增殖能力检测 |
| 2.4 慢病毒转染hDPSCs后ALP活性检测 |
| 2.5 慢病毒转染hDPSCs后茜素红染色及半定量检测 |
| 2.6 慢病毒转染hDPSCs后矿化相关基因表达情况 |
| 2.7 慢病毒转染hDPSCs后矿化相关蛋白表达情况 |
| 2.8 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 慢病毒预感染hDPSCs |
| 3.2 慢病毒转染hDPSCs后LMP-1的表达 |
| 3.3 慢病毒转染对hDPSCs增殖能力的影响 |
| 3.4 慢病毒转染hDPSCs后ALP活性检测 |
| 3.5 慢病毒转染hDPSCs后茜素红染色 |
| 3.6 慢病毒转染hDPSCs后矿化相关基因的表达 |
| 3.7 慢病毒转染hDPSCs后矿化相关蛋白的表达 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第三章 LMP-1调控hDPSCs定向分化的MAPK通路机制 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要材料和试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 MAPK通路抑制剂作用下细胞的ALP活性检测 |
| 2.2 MAPK通路抑制剂作用下细胞的MAPK通路和矿化相关蛋白表达情况 |
| 3 结果 |
| 3.1 MAPK通路抑制剂作用下细胞的ALP活性 |
| 3.2 MAPK通路抑制剂作用下细胞的MAPK通路和矿化相关蛋白表达情况 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第四章 GO/GS复合支架材料的制备研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要材料和试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 改良Hummers法合成GO |
| 2.2 GO的结构表征检测 |
| 2.3 GO涂覆的明胶海绵复合支架的制作 |
| 2.4 GO涂覆的明胶海绵复合支架的理化性能检测 |
| 2.5 GO涂覆的明胶海绵复合支架对细胞生物学特性的影响 |
| 2.6 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 GO的合成及结构表征 |
| 3.2 支架的表征和理化性能 |
| 3.3 支架对细胞生物学特性的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第五章 LMP-1转染hDPSCs复合GO/GS支架的体内研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要材料和试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 LMP-1转染hDPSCs |
| 2.2 细胞接种 |
| 2.3 细胞与支架复合物体内培养 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录一 综述 LMP-1在干细胞中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录二 中英文缩略词对照表 |
| 成果 |
| 致谢 |
（7）促绵羊iPSC生成效率的miRNAs筛选与评价及向雌性PGC样细胞定向分化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1 研究的目的和意义 |
| 2 国内外研究进展 |
| 2.1 诱导多能干细胞的研究进展 |
| 2.1.1 体细胞重编程的机制 |
| 2.1.2 多能干细胞由不同信号通路调节 |
| 2.1.3 提高体细胞重编程效率的研究 |
| 2.2 家畜诱导多能干细胞的研究现状 |
| 2.2.1 猪诱导多能干细胞 |
| 2.2.2 绵羊和山羊诱导多能干细胞 |
| 2.2.3 牛诱导多能干细胞 |
| 2.3 miRNAs与多能干细胞 |
| 2.3.1 miRNA简介及生物学功能 |
| 2.3.2 miRNA在多能干细胞中的作用 |
| 2.3.3 miRNAs促进体细胞重编程 |
| 2.4 多能干细胞定向分化原始生殖细胞的研究进展 |
| 2.4.1 形成原始生殖细胞的关键因子和基因 |
| 2.4.2 ESC/iPSC定向分化原始生殖细胞的途径 |
| 2.4.3 ESC/iPSC体外诱导分化为生殖细胞的培养体系 |
| 3 研究内容 |
| 4 技术路线 |
| 第二章 试验研究 |
| 试验一 促进绵羊体细胞重编程miRNAs的筛选研究 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 动物和细胞 |
| 1.1.2 主要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂耗材 |
| 1.1.4 质粒 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 绵羊肾细胞(SKC)分离培养及鉴定 |
| 1.2.2 小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)分离培养与饲养层细胞制作 |
| 1.2.3 促绵羊体细胞重编程miRNAs的初步筛选 |
| 1.2.4 慢病毒质粒提取与酶切鉴定 |
| 1.2.5 慢病毒包装 |
| 1.2.6 慢病毒收集及病毒滴度测定 |
| 1.2.7 miRNAs促绵羊肾上皮细胞重编程效率比较 |
| 1.2.8 siPSC的鉴定 |
| 1.2.9 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 绵羊体细胞的分离纯化 |
| 2.2 MEF细胞分离培养及饲养层细胞的制备 |
| 2.3 慢病毒质粒提取与酶切鉴定 |
| 2.4 成功包装各类慢病毒 |
| 2.5 促绵羊SKC重编程的miRNAs筛选 |
| 2.5.1 慢病毒成功感染SKC |
| 2.5.2 比较不同miRNA诱导绵羊SKC的效率 |
| 2.5.3 miR-200c-141+8因子诱导绵羊iPSC |
| 2.6 由miR-200c-141促进重编程获得的siPSC的多能性鉴定 |
| 2.6.1 AP染色鉴定 |
| 2.6.2 细胞免疫荧光技术鉴定siPSC中多能性蛋白因子表达 |
| 2.6.3 qPCR鉴定siPSC中多能性因子基因转录 |
| 2.6.4 siPSC中多能基因Nanog启动子甲基化分析 |
| 2.6.5 siPSC核型分析 |
| 2.6.6 siPSC向拟胚体(EB)三胚层分化鉴定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 绵羊iPSC的特征及诱导效率 |
| 3.2 miRNA提高干细胞诱导效率 |
| 4 小结 |
| 试验二 miR-200c提高羊体细胞重编程机制研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞和载体 |
| 1.1.2 重要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 miR-200c靶蛋白的预测 |
| 1.2.2 合成绵羊miR-200c模拟物、抑制物和阴性对照 |
| 1.2.3 双荧光素酶报告基因载体的构建 |
| 1.2.4 双荧光素酶报告基因分析miR-200c靶基因 |
| 1.2.5 实时荧光定量PCR检测miR-200c靶基因的m RNA水平 |
| 1.2.6 Western blot检测miR-200c靶基因的蛋白水平 |
| 1.2.7 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 miR-200c靶基因的预测 |
| 2.2 双荧光素酶报告基因载体的构建 |
| 2.2.1 靶基因ZEB1和TWISTNB3’UTR区扩增测序 |
| 2.2.2 靶基因双荧光素酶报告载体的构建 |
| 2.3 靶基因双荧光素酶报告系统分析 |
| 2.4 实时荧光定量PCR检测ZEB1、TWISTNB及 E-cadherin转录水平 |
| 2.5 Western blot检测ZEB1、TWISTNB及 E-cadherin蛋白表达水平 |
| 3 讨论 |
| 3.1 TGF-β信号通路与细胞重编程 |
| 3.2 miRNA提高重编程的机制 |
| 4 小结 |
| 试验三 绵羊iPSC定向分化雌性PGC样细胞研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞和载体 |
| 1.1.2 重要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 绵羊生殖相关基因DAZL和 BOULE慢病毒载体的构建 |
| 1.2.2 PLVX-Dazl和 PLVX-Boule的慢病毒包装 |
| 1.2.3 慢病毒滴度测定 |
| 1.2.4 绵羊卵巢细胞的分离培养 |
| 1.2.5 绵羊iPSC定向分化原始生殖细胞样细胞(PGCLC) |
| 1.2.6 绵羊iPSC定向分化雌性PGC样细胞鉴定 |
| 1.2.7 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 绵羊生殖相关基因DAZL和 BOULE慢病毒载体的构建 |
| 2.1.1 绵羊生殖相关基因DAZL和 BOULE的扩增 |
| 2.1.2 成功构建绵羊生殖相关基因DAZL和 BOULE慢病毒载体 |
| 2.1.3 成功包装慢病毒LV-DAZL和 LV-BOULE |
| 2.2 绵羊卵巢细胞分离培养 |
| 2.3 稳转DAZL和 BOULE基因siPSC的建立 |
| 2.4 原始生殖细胞样细胞(PGCCL)的鉴定 |
| 2.4.1 绵羊PGC样细胞的分化条件和过程 |
| 2.4.2 细胞免疫荧光技术检测绵羊PGC样细胞 |
| 2.4.3 实时定量RT-PCR验证绵羊PGC样细胞 |
| 3 讨论 |
| 3.1 原始生殖细胞与多能干细胞 |
| 3.2 体外重构原始生殖细胞的方法 |
| 4 小结 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 作者简历 |
| 石河子大学博士研究生学位论文导师评阅表 |
（8）内质网靶向基因递送系统的构建及转染性能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 绪论 |
| 1.1 基因治疗 |
| 1.2 基因治疗载体 |
| 1.2.1 病毒载体 |
| 1.2.2 非病毒载体 |
| 1.3 内质网靶向药物递送系统 |
| 1.3.1 基于分子的ER靶向 |
| 1.3.2 基于多肽的ER靶向 |
| 1.3.3 基于载体的ER靶向 |
| 1.4 本课题研究目的和意义 |
| 2 内质网靶向基因载体的构建及理化性质表征 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验试剂、材料及仪器 |
| 2.2.1 实验试剂和材料 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 合成SPEBA |
| 2.3.2 PEI-ER内质网靶向基因递送载体的合成实验 |
| 2.3.3 PEI-ER内质网靶向基因递送载体的核磁表征 |
| 2.3.4 PEI-ER内质网靶向基因递送载体的紫外吸收光谱表征 |
| 2.3.5 PEI-ER内质网靶向基因递送载体的质子缓冲能力表征 |
| 2.3.6 PEI-ER/DNA纳米复合物的粒径电位表征 |
| 2.4 实验结果与讨论 |
| 2.4.0 SPEBA的合成及表征 |
| 2.4.1 PEI-ER内质网靶向基因载体的合成 |
| 2.4.2 PEI-ER的紫外吸收光谱 |
| 2.4.3 PEI-ER的质子缓冲能力 |
| 2.4.4 PEI-ER/DNA复合物的粒径电位表征 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 PEI-ER外源基因递送效率研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验试剂、材料和仪器 |
| 3.2.1 实验试剂和材料 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 琼脂糖凝胶电泳实验 |
| 3.3.2 PEI-ER的溶血试验 |
| 3.3.3 PEI_(25K)-ER的合成实验 |
| 3.3.4 细胞培养 |
| 3.3.5 MTT比色法测定PEI-ER的细胞毒性 |
| 3.3.6 PEI-ER/DNA复合物的转染效果研究 |
| 3.3.7 流式细胞仪对转染结果的定量分析 |
| 3.4 实验结果与讨论 |
| 3.4.1 琼脂糖凝胶电泳实验结果 |
| 3.4.2 溶血实验结果 |
| 3.4.3 细胞毒性实验结果 |
| 3.4.4 PEI-ER介导的基因转染实验 |
| 3.4.5 PEI_(25K)-ER介导的基因转染实验 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 PEI-ER内化机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验试剂、材料及仪器 |
| 4.2.1 实验试剂和材料 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 FITC标记PEI-ER实验 |
| 4.3.2 细胞摄取机制研究 |
| 4.3.3 转染实验验证摄取结果 |
| 4.3.4 内质网共定位实验 |
| 4.3.5 统计分析 |
| 4.4 实验结果与讨论 |
| 4.4.1 PEI-ER和 PEI细胞摄取机制研究 |
| 4.4.2 转染实验验证摄取结果 |
| 4.4.3 内质网荧光共定位 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间研究成果 |
| 致谢 |
（9）多级微环境“自适型”基因递送系统的构建及评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 基因治疗 |
| 1.1.1 基因及基因治疗 |
| 1.1.2 基因治疗用于癌症 |
| 1.2 病毒载体及其缺陷 |
| 1.2.1 腺病毒载体 |
| 1.2.2 逆转录病毒和慢病毒载体 |
| 1.2.3 腺相关病毒和其它病毒载体 |
| 1.3 非病毒载体递送基因过程中的生理屏障 |
| 1.3.1 血液屏障 |
| 1.3.2 组织屏障 |
| 1.3.3 胞内屏障 |
| 1.4 非病毒载体的设计要求 |
| 1.4.1 循环稳定 |
| 1.4.2 肿瘤富集 |
| 1.4.3 深层渗透 |
| 1.4.4 细胞内化 |
| 1.5 非病毒载体的分类及优缺点 |
| 1.5.1 无机纳米颗粒 |
| 1.5.2 阳离子脂质体 |
| 1.5.3 阳离子聚合物 |
| 1.6 本论文的选题依据及研究内容 |
| 2 纳米载体材料的合成与表征 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 试剂和仪器 |
| 2.2.1 试剂 |
| 2.2.2 仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 阳离子聚合物载体的合成 |
| 2.3.2 核磁共振氢谱(~1H NMR) |
| 2.3.3 傅里叶红外光谱(FTIR) |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 载体/基因复合物制备及理化性质表征 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 试剂和仪器 |
| 3.2.1 试剂及材料 |
| 3.2.2 仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 载体/基因复合物的制备 |
| 3.3.2 载体/基因复合物稳定性 |
| 3.3.3 纳米粒径、ζ电位及透射电子显微镜(TEM) |
| 3.3.4 细胞复苏及传代培养 |
| 3.3.5 载体及复合物的细胞毒性实验 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 阳离子载体结合pDNA的能力及稳定性分析 |
| 3.4.2 载体/基因复合物的粒径、电势及形态 |
| 3.4.3 载体及复合物生物相容性分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 载体及复合物多级微环境响应性及基因转染 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 试剂和仪器 |
| 4.2.1 试剂及材料 |
| 4.2.2 仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 载体/基因复合物对还原环境响应性研究 |
| 4.3.2 温敏载体/基因复合物制备及对温度敏感性研究 |
| 4.3.3 载体/基因复合物MMP-2响应性及RGD主动靶向性能研究 |
| 4.3.4 统计学分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 载体/基因复合物还原环境响应性分析 |
| 4.4.2 载体/基因复合物温度敏感性分析 |
| 4.4.3 载体/基因复合物主动靶向性能分析 |
| 4.4.4 载体及载体/基因复合物MMP-2响应去PEG化性能分析 |
| 4.4.5 载体/基因复合物基因转染能力分析 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 温敏载体/基因复合物联合索拉菲尼体内抑癌能力研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 试剂和仪器 |
| 5.2.1 试剂及材料 |
| 5.2.2 仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 建立荷瘤小鼠模型 |
| 5.3.2 基因递送系统体内抑癌实验 |
| 5.3.3 小鼠组织切片HE染色 |
| 5.3.4 血管内皮细胞生长因子(VEGF)免疫组化染色 |
| 5.3.5 统计学分析 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 温敏载体/基因复合物联合索拉菲尼体内抑癌能力分析 |
| 5.4.2 联合治疗的系统毒性评估 |
| 5.4.3 VEGF免疫组化结果分析 |
| 5.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文 |
| 致谢 |
（10）虹鳟传染性造血器官坏死病-传染性胰腺坏死病二联活载体疫苗的研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 传染性造血器官坏死病研究进展 |
| 1.1 传染性造血器官坏死病病原学概况 |
| 1.1.1 传染性造血器官坏死病病毒分类、命名 |
| 1.1.2 IHNV形态学结构 |
| 1.1.3 IHNV宿主系统 |
| 1.1.4 IHNV基因组结构 |
| 1.2 传染性造血器官坏死病流行病学 |
| 1.3 IHN临床症状和病理变化 |
| 1.4 IHN疫苗研究概况 |
| 2 传染性胰腺坏死病研究进展 |
| 2.1 传染性胰腺坏死病病原学概况 |
| 2.1.1 IPNV分类 |
| 2.1.2 IPNV形态结构 |
| 2.1.3 IPNV宿主系统 |
| 2.1.4 IPNV基因组结构 |
| 2.2 传染性胰腺坏死病流行病学特征 |
| 2.3 IPN临床症状和病理变化 |
| 2.4 IPN疫苗研究进展 |
| 3 腺病毒表达系统概述 |
| 3.1 腺病毒概况 |
| 3.2 腺病毒载体的发展历程 |
| 3.2.1 复制型腺病毒载体 |
| 3.2.2 复制缺陷型载体 |
| 3.3 重组腺病毒载体的构建方法 |
| 3.3.1 双质粒共转染法 |
| 3.3.2 Ad-Easy重组法 |
| 3.3.3 Ad-Max双质粒共转染法 |
| 3.4 腺病毒载体的应用 |
| 4 2A肽的概况 |
| 5 传染性造血器官坏死病-传染性胰腺坏死病二联重组腺病毒疫苗的研究展望 |
| 第二章 传染性造血器官坏死病病毒、传染性胰腺坏死病病毒的分离与鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒、细菌菌株、细胞和试剂 |
| 1.2 主要仪器和设备 |
| 1.3 IHNV的分离与鉴定 |
| 1.3.1 病料的处理 |
| 1.3.2 EPC细胞的复苏及传代 |
| 1.3.3 病毒的分离和培养 |
| 1.3.4 IHNV滴度的测定 |
| 1.3.5 IHNV总 RNA的提取 |
| 1.3.6 IHNV G基因的扩增 |
| 1.3.7 IHNV G基因与T载体的连接 |
| 1.3.8 连接产物的转化 |
| 1.3.9 质粒的提取 |
| 1.4 IPNV的分离与鉴定 |
| 1.4.1 病料的处理 |
| 1.4.2 病毒的分离、培养 |
| 1.4.3 IPNV滴度的测定 |
| 1.4.4 IPNV总 RNA的提取 |
| 1.4.5 IPNV VP2 基因的扩增 |
| 1.4.6 VP2 基因与载体的连接 |
| 1.4.7 连接产物的转化 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 IHNV的分离与鉴定结果 |
| 2.1.1 病毒驯化时在EPC细胞上的病变 |
| 2.1.2 病毒在EPC细胞的病变 |
| 2.1.3 IHNV滴度的测定 |
| 2.1.4 IHNV G基因的扩增和酶切结果 |
| 2.1.5 IHNV G基因的同源性分析 |
| 2.2 IPNV的分离与鉴定结果 |
| 2.2.1 病毒驯化时在EPC细胞上的病变 |
| 2.2.2 病毒在EPC细胞的病变 |
| 2.2.3 IPNV滴度的测定 |
| 2.2.4 IPNV VP2 基因的扩增和酶切结果 |
| 2.2.5 IPNV VP2 基因的同源性分析 |
| 3 讨论 |
| 第三章 传染性造血器官坏死病-传染性胰腺坏死病重组腺病毒载体的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 技术路线见图3-1 |
| 1.2 质粒、细菌菌株和试剂 |
| 1.3 主要仪器和设备 |
| 1.4 IHNV G基因、F2A基因和IPNV VP2 基因的扩增 |
| 1.4.1 IHNV G基因的扩增 |
| 1.4.2 F2A肽的扩增 |
| 1.4.3 IPNV VP2 基因的扩增 |
| 1.5 G基因、F2A肽基因和VP2 基因与p Ad-Track-CMV载体的快速连接 |
| 1.6 重组 p Ad-Track-CMV载体与p Ad-Easy-1 骨架载体的同源重组 |
| 1.6.1 电转化感受态细胞的制备 |
| 1.6.2 乙醇沉淀法进行大片段DNA回收 |
| 1.6.3 穿梭载体与骨架载体的同源重组 |
| 1.7 重组腺病毒质粒转染HEK-293 细胞 |
| 1.8 重组腺病毒抗原蛋白的Western-blot检测试验 |
| 1.8.1 重组腺病毒VP2 蛋白表达的Western-blot试验 |
| 1.8.2 重组腺病毒G蛋白表达的Western-blot试验 |
| 1.9 重组腺病毒滴度的测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 IHNV G基因和IPNV VP2 基因的扩增结果 |
| 2.1.1 IHNV G基因的扩增结果 |
| 2.1.2 IPNV VP2 基因的扩增结果 |
| 2.2 重组腺病毒构建的结果分析 |
| 2.3 重组腺病毒G基因和VP2 基因的表达鉴定 |
| 2.4 重组腺病毒滴度的测定 |
| 3 讨论 |
| 第四章 传染性造血器官坏死病-传染性胰腺坏死病活载体疫苗的生物学评价 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒与实验动物 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器和设备 |
| 1.4 实验动物饲养条件 |
| 1.5 活载体疫苗的临床安全性评价 |
| 1.5.1 小白鼠的临床安全性试验 |
| 1.5.2 本动物的临床安全性试验 |
| 1.6 疫苗最佳使用剂量的确定试验 |
| 1.7 免疫试验 |
| 1.8 样品的处理 |
| 1.9 通过两步法定量逆转录PCR(q RT-PCR)测定基因的表达水平 |
| 1.10 病毒感染试验 |
| 1.10.1 IHNV感染试验 |
| 1.10.2 IPNV感染试验 |
| 1.11 抗体中和试验检测 |
| 1.11.1 抗IHNV血清抗体中和试验的检测 |
| 1.11.2 抗IPNV血清抗体中和试验的检测 |
| 1.12 结果统计分析方法 |
| 1.13 活载体疫苗的免疫持续期试验 |
| 1.14 活载体疫苗的保存期试验 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 活载体疫苗的临床安全性评价结果 |
| 2.1.1 小白鼠的临床安全性试验结果 |
| 2.1.2 虹鳟的临床安全性试验结果 |
| 2.2 疫苗最佳使用剂量的确定 |
| 2.3 活载体疫苗免疫后对IHNV G基因、IPNV VP2 基因、IFN-1、IFN诱导的基因、TLRs受体、CD4、CD8、Ig M和 Ig T基因表达的影响 |
| 2.4 病毒感染试验结果 |
| 2.4.1 IHNV感染试验结果 |
| 2.4.2 IPNV感染试验结果 |
| 2.5 血清抗体中和试验结果 |
| 2.5.1 抗IHNV血清抗体的检测 |
| 2.5.2 抗IPNV血清抗体的检测 |
| 2.6 活载体疫苗的免疫持续期试验结果 |
| 2.7 活载体疫苗的保存期试验 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介1 |
| 导师简介2 |
四、三种非病毒载体转染方法的比较（论文参考文献）
- [1]MERS-CoV与SARS-CoV-2亚单位疫苗与核酸疫苗研究[D]. 杨韧. 中国疾病预防控制中心, 2021(02)
- [2]基于睾丸支持细胞研究4.1R蛋白在少精症小鼠模型中的作用机制[D]. 李小英. 甘肃农业大学, 2021(01)
- [3]基于遗传密码扩展技术构建复制可控的重组口蹄疫病毒的研究[D]. 郝荣增. 中国农业科学院, 2021
- [4]锍修饰的PEI化合物的合成及其作为基因载体能力的研究[D]. 路艳杰. 黑龙江八一农垦大学, 2021
- [5]卡介苗与焦亡溶瘤策略的构建及其在宠物肿瘤治疗中的应用初探[D]. 鲁愿. 华中农业大学, 2021(02)
- [6]LIM矿化蛋白1调控人牙髓干细胞复合氧化石墨烯改性支架促进组织再生研究[D]. 穆睿. 南方医科大学, 2021(02)
- [7]促绵羊iPSC生成效率的miRNAs筛选与评价及向雌性PGC样细胞定向分化研究[D]. 张云峰. 石河子大学, 2021(01)
- [8]内质网靶向基因递送系统的构建及转染性能研究[D]. 马剑鹤. 常州大学, 2021(01)
- [9]多级微环境“自适型”基因递送系统的构建及评价[D]. 王浩. 大连理工大学, 2021(01)
- [10]虹鳟传染性造血器官坏死病-传染性胰腺坏死病二联活载体疫苗的研制[D]. 李守湖. 甘肃农业大学, 2020(01)