王贺双1 纪军1 张利1 尹良伟2 高雁艳1 杨晋1
(1大连市中心医院中心实验室 辽宁 大连 116033)
(2大连市中心医院生物治疗室 辽宁 大连 116033)
【摘要】 目的:对比研究不同抗原负载情况下机体DC细胞对肿瘤细胞杀伤性功能。方法：取10例肺鳞癌患者癌细胞制备不同的肿瘤抗原，同时取正常人外周血单核细胞制备成DC细胞，分为对照组、CEA组、CA19-9组、CEA+CA19-9联，分析各组间差通过不同肿瘤抗原致敏DC细胞，分析致敏后DC细胞CD分子表达、T细胞增殖指数及杀伤肿瘤细胞的能力。结果：CEA+CA19-9联合应用组DC细胞表面分子CD1a、CD83、CD80、CD86、HLA-DR的表达最高，各组间差异有统计学意义(P<0.05)。对照组T细胞增值指数最小，而CEA+CA19-9组组刺激作用最高，各组差异有显著性（P＜0.05）。各组间对肿瘤细胞杀伤力差异有统计学意义(p<0.05)。结论：CEA+CA19-9抗原联合刺激能够明显提高DC细胞杀死肿瘤细胞的能力，T细胞增殖的能力提高，发挥更强的抗肿瘤作用。
【中图分类号】R730.5 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）23-0214-02
树突状细胞(dendritic cells,DC)是体内功能最强大的抗原提呈细胞(antigen-presenting cell, APC)，在激发和维持机体免疫反应中发挥着重要作用[1]。不同肿瘤抗原负载方式间缺乏系统的比较，因此对DC抗原负载方案进行比较及优化具有重要意义，以期进一步提高DC细胞介导的抗肿瘤作用，收到更好的治疗效果[2]。
1.实验材料
2014年1月2014年到6月，我院外科住院手术的癌症患者10例，男7例，女3例，年龄56~76(62.3±8.4)岁，病理组织类型均为肺鳞癌。同时取健康人群10例外周血提纯DC细胞，并作为正常对照组，男5例，女5例，年龄55~75(60.3±9.4)。
2.方法
2.1 肿瘤抗原的制备
切取的肺癌组织经过组织细胞溶解，制成细胞液体，经液氮反复冻融5次, 经 0.22μm 滤膜过滤灭菌, 通过紫外荧光光度计测定肿瘤细胞裂解物的蛋白含量，通过蛋白分离提纯，制备CEA、CA19-9抗原。
2.2负载肿瘤抗原的 DC 疫苗制备
取健康志愿者外周血 100ml，制备单个核细胞，将其放入10ml含 5%自体血清的X-VIVO15培养液的培养瓶中，在 37℃，5% CO2培养箱温浴2-4 h，吸出悬浮细胞行CIK 细胞培养。贴壁细胞加入新鲜 DC 细胞培养液(5%自体血清, GM- CSF 800u/ml，IL- 4 500u/ml，X-VIVO15 培养液)，置 37℃、5% CO2培养箱中培养。于培养的第 3 天、第 5 天重新加入新鲜细胞因子，在培养的第 5 天加入不同的肿瘤抗原。第 7天加入肿瘤坏死因子-α (TNF-α，终浓度 1000 U/ml)，第9天收集成熟 DC 细胞，用流式细胞术检测CD1a、CD83、CD80、CD86、HLA-DR表达情况。
2.3同种异体混合淋巴细胞反应（MLR）
取上述培养至第7d的各组DC，调整细胞浓度为2×105/ml，取上述培养至第7d的异体淋巴细胞，调整细胞浓度为2×106/ml，分别加入96孔培养板中，按5：1、10：1、20：1、40：1的比例加入各组DC，总体积200μl/孔，分设3复孔，混匀，同时设对照组（只加培养基）。37℃，5%CO2条件下培养72h。培养终止前4h，加入MTT液（5㎎/ml）20μl/孔，充分混匀，继续培养4h。离心培养板（1000rpm,5min），弃上清。每孔加入150μlDMSO （二甲基亚砜），充分混匀，静置数分钟，用酶标仪检测每孔490nm的OD值，计算细胞增殖指数。增殖指数（SI）=实验孔OD值/对照孔OD值。
2.4 CTL的体外肿瘤杀伤实验
将经方法2.4培养的效应细胞配成 2×106/ml 的细胞悬液，按5 : 1、10：1、0：1 的效靶比例混合，加到 96孔圆底培养板中，每孔加入效应细胞、靶细胞各 50μl，另设效应细胞自发释放孔、靶细胞自发释放孔、靶细胞最大释放孔、培养基对照孔和体积对照孔，以上各组均设 3个复孔。置 37℃，5%CO2 环境培养 24 h，轻轻混匀细胞，1000rpm 离心5min。取各孔培养上清 50μl，加入相应底物。避光，室温反应 30min 后，加入终止液终止反应，用酶标仪检测各孔 492nm的光密度值，用下列公式计算杀伤率：杀伤率（%）＝（OD(E+T)－ODE自发－ODT自发）/（ODT最大－ODT自发）。
2.5 统计学处理
用SPSS15.0软件包进行数据分析，数据用均数±标准差表示，用方差分析和t检验统计，P＜0.05为差异显著。
3.结果
3.1 不同抗原负载方式对DC细胞表型的影响
不同抗原负载组DC细胞表面分子的表达有差异，CEA+CA19-9联合应用组DC细胞表面分子CD1a、CD83、CD80、CD86、HLA-DR的表达最高，各组间差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。
表1 各组CD分子表达情况对比
3.2 以不同方式负载抗原的DC对同种异体T细胞增殖的影响
同种异体的混合淋巴细胞反应结果表明，各组 DC 对异体 T 细胞有不同程度的刺激作用，其中对照组增值指数最小，而CEA+CA19-9组组刺激作用最高，各组差异有显著性（P＜0.05），见图1。
图1 各组负载不同抗原的DC对同种异体T细胞增殖指数对比
3.3各组CTL对肿瘤杀伤率的对比
CEA组对肿瘤细胞杀伤率为23.67±4.7%，CA19-9组为27.70±2.3%，CEA+CA19-9联合组为34.56±3.9%，而对照组为21.67±4.7%，各组间差异有统计学意义(p<0.05)。
4.讨论
大量的研究表明，负载肿瘤抗原的DC（即DC肿瘤疫苗）能激活具有抗肿瘤免疫的细胞毒性T细胞（CTL）[3]。DC肿瘤疫苗的基本原理是首先在体外分离出DC细胞并诱导分化成熟，然后提取肿瘤抗原，通过各种方法将各类肿瘤相关抗原负载于上，成功制备出疫苗后回输肿瘤患者，从而激活并产生大量的CTL，启动患者体内抗肿瘤免疫应答[4]。
DC所负载的抗原主要是肿瘤细胞的裂解物或经提纯的肿瘤细胞相关抗原，将这些抗原与DC共同培育，有效抗原在培育过程中即被DC识别、摄取、处理及递呈[5]。目前，DC在抗肿瘤免疫治疗中的应用主要致敏方式有已知序列的抗原肽、自体肿瘤组织蛋白、凋亡的肿瘤细胞、肿瘤细胞裂解物以及肿瘤细胞来源的RNA等。其中，自体肿瘤组织蛋白、凋亡的肿瘤细胞、肿瘤细胞裂解物为肿瘤全抗原，全抗原法不需分离特异的抗原肽，其操作方法简单，可广泛应用于不同的肿瘤[6]。同时，这种多价肿瘤抗原可以诱导出针对多种抗原决定簇的T淋巴细胞克隆，不受抗原调变的影响，保证了抗肿瘤免疫反应的全面性和有效性，降低肿瘤免疫耐受出现的可能性[7]。本研究结果显示，CEA+CA19-9抗原联合刺激能够明显提高DC细胞杀死肿瘤细胞的能力，T细胞增殖的能力提高，发挥更强的抗肿瘤作用，但具体机制带进一步研究。
5.实验结论
5.1肿瘤抗原致敏后的DC, 功能分子HLA-DR、CD80、CD83、CD86、CD1a表达升高,且不同致敏方式上述分子表达升高程度不同，细胞系裂解蛋白与凋亡的细胞联合负载的方式升高程度最高。
5.2肿瘤细胞裂解物及凋亡的肿瘤细胞系两种负载方式效果优于已知序列的抗原肽
5.3与单一抗原负载相比，联合应用组能提高DC诱导淋巴细胞增殖的能力，并且能显著提高效应细胞CTL：细胞因子IFN-γ的分泌水平及杀瘤活性。
6.创新点与不足之处
本研究的创新点
（1）首次对DC的不同抗原负载方式及其联合应用进行较为全面和系统的评价。
（2）证实肿瘤细胞裂解物及凋亡的肿瘤细胞系两种负载方式效果优于已知序列的抗原肽。
本研究的不足之处
（1）由于实验条件的限制，缺少DC细胞荧光染色及电镜下的细胞形态观察。
（2）取得临床肿瘤患者的手术标本的难度较大，未能与患者自身的肿瘤组织裂解物负载DC细胞进行对比。
【参考文献】
[1] Yang B, Lu X C, Yu R L, et al. Repeated transfusions of autologous cytokine-induced killer cells for treatment of haematological malignancies in elderly patients: a pilot clinical trial[J]. Hematol Oncol,2012,30(3):115-122.
[2] Shi S B, Ma T H, Li C H, et al. Effect of maintenance therapy with dendritic cells: cytokine-induced killer cells in patients with advanced non-small cell lung cancer[J]. Tumori, 2012, 98(3): 314-319.
[3] Liu L, Zhang W, Qi X, et al. Randomized study of autologous cytokine- induced killer cell immunotherapy in metastatic renal carcinoma [J].Clin Cancer Res, 2012,18(6): 1751-1759.
[4] Li R, Wang C,Liu L, et al.Autologous cytokine-induced killer cell immunotherapy in lung cancer:a phase II clinical study[J].Cancer Immunol Immunother, 2012, 61(11):2125-2133.
[5] 陈虎，唐晓义，张斌.树突状细胞肿瘤疫苗:全球临床试验巡礼[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2012,19(1):1-10.
[6] DeFrancesco L．Landmark approval for Dendreon’s cancer vaccine [J]. Nat Biotechnol, 2010, 28( 6) : 531-532．
[7] 王其京,王慧,潘科等.自体CIK、DC-CIK与半合子DC-CIK抗肿瘤免疫反应的比较研究[J].癌症,2010,29(7):641-648.
论文作者:王贺双1,纪军1,张利1,尹良伟2,高雁艳1,杨晋
论文发表刊物:《医药前沿》2015年第23期供稿
论文发表时间:2015/10/19
标签：细胞论文; 抗原论文; 肿瘤论文; 负载论文; 方式论文; 抗肿瘤论文; 淋巴细胞论文; 《医药前沿》2015年第23期供稿论文;