刘卓刚, 臧师竹, 宋毅, 王欢, 矫德馨[1]2004年在《WT1基因反义寡核苷酸对急性白血病细胞的抑制作用》文中指出WT1基因表达产物能够抑制G CSF对髓前体细胞的分化作用,诱导其促进增殖作用。WT1反义寡核苷酸是与WT1基因转录本mRNA翻译起始段互补的一段18nt寡核苷酸链[1 3 ] 。我们的目的是通过WT1反义寡核苷酸抑制WT1基因的表达,观察细胞凋亡的情况
顾伟英, 胡绍燕, 王志林, 王琳, 贺白[2]2007年在《WT1反义寡核苷酸对K562白血病细胞生长抑制作用研究》文中认为目的探讨WT1反义寡核苷酸(WT1-ASO)对白血病细胞生长抑制作用。方法合成一段与WT1基因转录本翻译起始序列互补的、含18个碱基的WT1反义寡聚核苷酸序列,以200μg/ml与白血病细胞系K562和U937共培养,同时设立WT1-SO组及单纯培养基对照组,锥虫蓝拒染实验确定活细胞数,测定细胞生长曲线,观察WT1-ASO对白血病细胞生长抑制作用,实时定量RT-PCR技术检测相应细胞系中WT1基因表达水平变化。结果WT1-ASO能够特异性抑制WT1表达的K562细胞的生长,与WT1-SO组及对照组相比差异有统计学意义(P<0.01),而WT1-ASO对WT1低表达的U937细胞生长无明显抑制作用,WT1-ASO能够特异性下调K562细胞中WT1基因表达水平。结论WT1-ASO能够特异性抑制表达WT1基因的白血病细胞生长,下调其WT1基因表达,可以应用于白血病治疗。
吴晓雄, 汪月增, 裴雪涛, 达万明[3]2006年在《白血病细胞系WT1的表达及反义核苷酸对其的抑制作用》文中指出目的:探讨RT-PCR方法测定白血病细胞系WT1基因的表达以及WT1反义寡核苷酸对白血病细胞系增殖的抑制作用。方法:应用RT-PCR方法测定K562、HL-60、TF-1及U937 4株白血病细胞系WT1基因的表达,然后应用针对WT1翻译起始位点的反义寡核苷酸(WT1 ASO)处理K562细胞系、U937细胞系,采用锥虫蓝拒染法确定白血病细胞的增殖。结果:K562、HL-60及TF-1 3株白血病细胞系均高度表达WT1,而U937细胞系未测到WT1。WT1 ASO能够抑制WT1表达阳性的K562细胞的生长,对WT1表达阴性的U937则无抑制作用;而WT1有义寡核苷酸对K562细胞系、U937细胞系均无抑制作用。结论:RT-PCR测定方法可以检测WT1基因在白血病细胞系表达,WT1反义寡核苷酸对白血病细胞有特异的抑制作用。WT1基因在白血病细胞增殖过程中起一定作用。
佚名[4]2003年在《《中华血液学杂志》2003年第24卷关键词索引》文中指出关键词基本按照中国医学科学院医学信息研究所 1998年出版的《医学主题词表 (英汉对照 )》标引 ,按照汉语拼音字母及论文发表的先后顺序排列。B白细胞介素 2 单倍体相合骨髓移植中急性移植物抗宿主病预防新方案的临床研究 (纪树荃 ,陈惠仁 ,王恒湘 ,等
吴晓雄, 汪月增, 裴雪涛, 楼方定, 张伯龙[5]1999年在《WT1反义寡核苷酸对白血病细胞增殖和凋亡的影响》文中研究指明目的 了解ＷＴ１ 反义寡核苷酸对白血病细胞增殖和凋亡的影响。方法 应用ＷＴ１ 基因的反义寡核苷酸（ＷＴ１ ＡＳＯ）处理Ｋ５６２、Ｕ９３７、ＨＬ６０ 细胞系，白血病患者以及正常人骨髓细胞，然后以台盼蓝拒染法、细胞集落法及流式细胞仪检测法确定白血病细胞的增殖和凋亡。结果 ＷＴ１ ＡＳＯ 能够抑制ＷＴ１ 表达阳性的Ｋ５６２ 细胞生长，对ＷＴ１ 表达阴性的Ｕ９３７ 细胞则无抑制作用；ＷＴ１ ＡＳＯ对８ 例急性髓系白血病患者中４ 例的白血病细胞集落（ＣＦＵＬ）有显着抑制作用，对８ 例正常对照骨髓细胞的ＣＦＵＧＭ 则无抑制作用；而ＷＴ１ 有义寡核苷酸（ＳＯ） 对白血病细胞系、白血病患者的ＣＦＵＬ以及正常对照骨髓ＣＦＵＧＭ 均无抑制作用。ＷＴ１ ＡＳＯ可以引起Ｋ５６２ 细胞的凋亡，随着作用时间的延长凋亡数增加，结合小剂量Ｖｐ１６（１０ μｇ／ｍｌ） 后细胞凋亡率明显提高；ＨＬ６０ 细胞经ＷＴ１ ＡＳＯ处理２４ 小时及６０ 小时均无明显凋亡，接近有义链组及对照组，但ＷＴ１ ＡＳＯ与Ｖｐ１６（１０ μｇ／ｍｌ）联合处理６０ 小时后细胞凋亡增加，大于单独应用Ｖｐ１６ 及Ｖｐ１６＋ ＳＯ引起的凋亡。结论 ＷＴ１ 反义寡核苷酸对白血病细胞有特异的抑制?
佚名[6]2004年在《《中华血液学杂志》2004年第25卷关键词索引》文中指出关键词基本按照中国医学科学院医学信息研究所 1998年出版的《医学主题词表 (英汉对照 )》标引 ,按照汉语拼音字母及论文发表的先后顺序排列。A阿糖胞苷 含有大剂量阿糖胞苷的联合化疗治疗难治和复发急性白血病 (吴德沛 ,傅 ,唐晓文 ,等 ) (11
宋毅[7]2004年在《WT1反义寡核苷酸抑制急性白血病细胞的生长》文中认为目的 WT1基因定位于11p13，首先在Wilms瘤中发现并克隆。WT1基因长约50Kb，编码分子量为52-54KD的转录调控蛋白。WT1蛋白具有激活和抑制双重功能。近年来，人们发现WT1基因在多种白血病中异常表达，表达水平与预后呈负相关，表达水平升高与复发相关，但它在白血病的发生发展中所起的作用仍未明确。 反义寡核苷酸技术是基因治疗的一种常用方法，它通过特异性封闭有害基因的表达，来达到治疗的目的。 本实验的目的是通过WT1反义寡核苷酸特异性封闭急性白血病细胞中WT1基因的表达，从而下调WT1蛋白的表达，观察细胞的变化，研究WT1基因在白血病发生发展中的作用，探讨WT1反义寡核苷酸在白血病反义治疗或骨髓净化中的作用。 实验材料 1．K562细胞系和急性白血病患者的细胞 2．WT1反义寡核苷酸链和正义寡核苷酸链 3．Western印迹的相关试剂 实验方法 1．急性白血病患者细胞中WT1蛋白表达的检测 1．1 骨髓单个核细胞的分离与培养 取骨髓2ml，肝素抗凝，PBS稀释3-4倍，缓慢加至Ficoll淋巴细胞分离液上，离心，取界面层单个核细胞(MNC)，PBS洗涤2次。加入含10％小牛血清(FBS)、100IU／ml青霉素、100IU／ml链霉素的RPMI 1640培养液培养，剩余一滴细胞悬液滴片，用瑞氏—姬姆萨染色液染色，光镜下观察细胞形态，白血病细胞超过90％。细胞置于37℃、5％CO_2、饱和湿度的培养箱中常规传代培养。 1.2细胞中总蛋白的提取 取对数生长期细胞，加人RIPA裂解液，充分混匀后冰上裂解1小时，离心收集上清。提取的总蛋白用紫外分光光度法测定蛋白浓度。 1.3 Western印迹检测急性白血病细胞中WTI蛋白的表达 2.WTI反义寡核昔酸对急性白血病细胞的抑制 WTI蛋白阳性细胞分3组，AS组、SE组和空白对照组，分别加人等体积的反义寡核昔酸链、正义寡核昔酸链和1640培养液，寡核昔酸试剂的终浓度为200卜扩耐，以后每24小时追加一次，寡核昔酸试剂终浓度为100林g/d，连续培养%小时。培养条件:37℃、5%CO:、饱和湿度。 2.1细胞形态学检测 细胞用瑞氏一姬姆萨染色液染色，光镜下观察细胞形态。 2.2 Westem印迹检测反义寡核昔酸对Wl，1蛋白表达的影响。结果 1.Westem印迹检测9例急性白血病细胞中Wl，1蛋白的表达，6例阳性，其中AML(6/8)，ALL(0/1)。 2.反义寡核昔酸处理急性白血病细胞后的结果: 2.1 AS组细胞出现核固缩、核碎裂，细胞的数量没有增多。而SE组和空白对照组细胞形态无明显变化，数量则明显增多。 2.2 Western印迹结果显示AS组WTI蛋白表达与SE组和空白对照组相比有明显下降。结论 WTI在急性白血病中表现为一种癌基因，Wl，1反义寡核昔酸能抑制急性白血病细胞中WTI蛋白的表达，抑制细胞的增殖，促进细胞死亡。W，rl反义寡核昔酸可能成为一种有效的反义制剂或骨髓体外净化的手段。
刘媛媛[8]2011年在《Apollon反义寡核苷酸对K562细胞增殖、凋亡和耐药影响的研究》文中研究说明目的：探讨Apollon反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide, ASODN)对白血病细胞K562增殖、凋亡及耐药的影响,力求寻找临床治疗白血病的新方法。方法：设计合成特异性的Apollon硫代磷酸ASODN及其对照错义寡核苷酸(missense oligonucleotide, MSODN),脂质体介导转染K562细胞后,采用四甲基偶氮唑盐光吸收法(MTT)检测K562细胞的增殖,Annexin V-FITC法检测细胞的凋亡,用MTT法检测K562细胞对依托泊苷、长春新碱及联合用ASODN耐药性。结果：Apollon反义寡核苷酸对K562细胞的生长抑制呈浓度-时间依赖性。Apollon ASODN在终浓度为600nmol/L作用K562细胞时,能明显抑制其增殖,K562细胞凋亡率显着增加(P<0.01),联合用药组对细胞的半数抑制浓度(IC50)低于单用药组。结论：Apollon反义寡核苷酸可下调Apollon基因表达,有效抑制K562细胞的增殖,并促进K562细胞凋亡,Apollon反义寡核苷酸与依托泊苷和长春新碱联合作用可降低细胞生存率,降低细胞耐药性。
臧师竹[9]2003年在《WT1反义寡核苷酸对急性白血病细胞的抑制作用》文中研究指明前言 WT1基因首先在Wilms′瘤细胞中发现，位于11p13，全长50kb，共有10个外显子，转录52-54KDa的DNA结合蛋白。近年来，人们对它在造血系统中的作用进行了研究。发现去除鼠胚胎WT1基因后，鼠造血系统发育迟缓。WT1能调控CSF-1基因、TGF(转化生长因子)基因、bcl-2、c-myc以及维甲酸受体基因的表达，从而调节造血细胞的功能。在白血病细胞中，该基因有以下表现：1．过度表达；2．表达水平与预后呈负性相关；3．表达升高与复发有关；4．抑制G-CSF对髓前体细胞的分化作用，诱导其促进增殖作用；5．WT1在一些白血病中发生突变，不能调控细胞的生长、分化和增殖。这些现象提示WT1在白血病的发生中起癌基因作用。WT1反义寡核苷酸是与WT1基因转录本mRNA翻译起始段互补的一段18nt(nucleotide)的寡核苷酸链。 本实验目的是通过WT1反义寡核苷酸抑制WT1基因表达，观察白血病细胞形态及增殖行为的变化，进一步研究WT1基因在白血病发生发展中的作用，探讨WT1反义寡核苷酸在白血病反义治疗中的应用。 实验材料 一、主要试剂和仪器：Ficoll淋巴细胞分离液、Trizol、氯仿、异丙醇、dNTP(四种脱氧核糖核苷酸)、RNA酶抑制剂、逆转录酶、Taq酶、RPMI1640完全培养液。上述试剂均由传染病实验室提供。引物、反义寡核苷酸由宝生物公司合成。CO_2培养箱(TE-HER WATER JACKET CO。GAS INCUBATOR）、高速冷冻离o机（HERAEUS BIOFUGE PRIMOR）、PCR扩增仪（PE删NELMERGENE AMP PCR SYS亚M 2400）、电泳仪（DYY－Ill型稳压稳流电泳仪X－152℃低温冰箱门ANYO MDF－1155X－30℃低温冰箱（SANYO eDICAL FREEZER）。 实 验 方 法 一、WTI基因阳性细胞的筛选和培养 用RT－PCR检测白血病患者骨髓单个核细胞WI’1基因，将阳性的白血病细胞生长于含有m％胎牛血清5 链霉素和100IU／Inl青霉素的 RPMll640培养液中，于 37℃j％CO八饱和湿度的培养箱中传代培养。所有实验均采用对数生长期细胞。 二、反义寡核耷酸的制备 采用针对翻译起始位点的反义DNA寡核耷酸链，序列如下：有义链 5’CAGCAAATGGGCTCCGAC3’，反义链 5’GTCGGAGC－CCA…CCTG3’，均为硫代修饰刀PLC纯化。寡核着酸链由宝生物公司合成。 叁、反义寡核着酸处理细胞 1．2 X 10VInl和 ZX 10’／Inl的白血病细胞悬液分别接种于培养瓶和96孔培养板中。每个培养瓶内细胞悬液总量为500ul，用于 WTI基因表达检测；96孔培养板中每孔内加 50ul细胞悬液，用于形态学观察以及细胞相对生存率的检测。 L不同培养方式的细胞均分 3组进行实验：AS－oh驴iner（反义链寡核耷酸）组百一olisome（有义链寡核着酸）组和对照组，分别加人等体积的反义链寡核耷酸、有义链寡核耷酸及培养液。细胞初始浓度：96孔培养板中为 IX 10Vnil，培养瓶中为IX 10～ml。寡核管酸试剂的终浓度：96孔板为15oUyInL，培养瓶中为18oU才 ·二· Inl。先在初始浓度下培养24小时，以后每24小时追加一次试剂 （每次浓度4OUgimLmLL共持续培养96小时。实验中所有加样方法 相同。 四、结果检测 1．W’TI基因的检测 96小时后收集培养瓶中各组细胞，采用RT－PCR进行WTI 基因检测。 2．细胞形态学检测 各组细胞分别制成细胞涂片，经瑞氏一姬姆萨染色。在光学 显微镜下观察其形态变化。 3．细胞生长曲线 从加人寡核耷酸起，每24小时计数96孔培养板中各组细胞 浓度，并计算细胞相对存活率：实验组细胞创对照组细胞数X 100％。 五、统计分析 ：采用 SPSSll．0统计软件分析，数据以 kn表示，数据分析采 用方差分析等方法，p＜0．05认为有统计学意义。 实 验 结 果 一、WTI基因的检测 寡核着酸处理96小时后，收集各组细胞，用RT－PCR方法进 行W’YI基因检测。发现AS组WTI基因由阳性转变成阴性。S 组和对照组仍为阳性。说明反义寡核着酸有效地阻断了基因的表 达。 二、细胞形态学检测 各组细胞进行形态学比较，显微镜下AS组细胞核固缩或破 碎，细胞死亡增多。说明WTI反义寡核耷酸能促进细胞死亡。进 ·3·一步揭示WTI基因在白血病细胞中的癌基因作用。 叁、细胞生长曲线 每 24小时取 AS组3组和对照组细胞做细胞计数。计算细胞相对存活率：实验组细胁对照组细胞 X 100％。结果显示 AS组细胞生长明显受到抑制，相对存活率低，而S组细胞无明显抑制。说明W’I’1反义寡核管酸对白血病细胞的增殖有明显抑制作用。 讨 论 本实验用WTI反义寡
杨璐[10]2006年在《WT1反义寡核苷酸对白血病微小残留病的体外净化作用》文中研究说明前言 随着新化疗药物的应用以及造血干细胞移植等治疗方法的开展,急性白血病的完全缓解率已得到很大提高,生存期明显延长,但完全缓解患者体内存在的微小残留病仍是白血病复发的主要根源。造血细胞的增殖受多种因子的调控,白血病的发生与基因的异常表达有关。Wilms瘤基因(WT1)位于染色体11p13位点,是具有转录抑制和激活双重功能的调节因子,可能作为调控造血细胞增殖和/或分化基因的转录抑制剂,在白血病的发生、发展及预后中起一定的作用。 反义寡核苷酸(ASO)是与mRNA互补的核苷酸序列,通过影响基因转录、mRNA剪切及抑制mRNA的翻译等环节发挥特异性封闭靶基因表达的作用。 本实验目的是通过WT1反义寡核苷酸抑制WT1基因的表达,观察微小残留病模型及患者基因表达的变化,进一步研究WT1基因在白血病发生发展中的作用,探讨WT1反义寡核苷酸在白血病微小残留病反义治疗中的应用。 实验材料 1.试剂:Ficoll淋巴细胞分离液、Trizol、氯仿、异丙醇,dNTP(四种脱氧核糖核苷酸)、RNA酶抑制剂、逆转录酶、Taq酶、RPMI1640完全培养液。上述试剂均由传染病实验室提供。引物、寡核苷酸由Takara公司合成。 2.仪器:CO_2培养箱、高速冷冻离心机、紫外分光光度仪、PCR扩增仪、电泳仪、自动电泳凝胶成像分析仪、-152℃低温冰箱、-30℃低温冰箱。
参考文献：
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[9]. WT1反义寡核苷酸对急性白血病细胞的抑制作用[D]. 臧师竹. 中国医科大学. 2003
[10]. WT1反义寡核苷酸对白血病微小残留病的体外净化作用[D]. 杨璐. 中国医科大学. 2006
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