（复旦大学生命科学学院 200030）
【摘要】目的：本文旨在明确Lnc RNA CCAT1是否通过调控线粒体凋亡通路影响结肠癌细胞增殖。方法：首先通过RT-PCR测定结肠癌癌组织与癌旁组织及多种结肠癌细胞系中CCAT1的表达量，然后设计合成si-Scramble、si-CATT1分别感染结肠癌细胞SW480，测定感染及对照组的细胞增殖能力、凋亡情况及细胞周期，并应用蛋白印迹法分析与线粒体凋亡通路相关的基因Caspase-3、Caspase-9、Bax和Bcl-2的蛋白表达。结果：CCAT1在结肠癌癌组织及结肠癌细胞中的表达显著高于癌旁组织及正常细胞，敲除CATT1后的结肠癌细胞活力下降，凋亡数增加、细胞周期阻滞在G2/M期。敲除CCAT1的癌细胞中Caspase-3、Caspase-9、Bax的表达显著高于对照组，而Bcl-2明显低于对照组。结论：长链非编码RNA CCAT1能通过调控线粒体凋亡通路影响结肠癌细胞增殖。
【关键词】 结肠癌；Lnc RNA CCAT1；线粒体；凋亡；增殖
【中图分类号】R73 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）35-0371-04
The molecular study of Lnc RNA CCAT1 influences colon cancer cell proliferation by regulating mitochondrial apoptotic pathway
【Abstract】Objective: To confirm whether Lnc RNA CCAT1 influence colon cancer cell proliferation by regulating mitochondrial apoptotic pathway. Methods: First, mRNA levels of Lnc RNA CCAT1 in cancer tissues，paratumor tissues and many colon cancer cell lines were determined. Then, si-Scramble and si-CATT1 were designed synthetized and transfected on colon cancer cell SW480. Cell proliferation, apoptosis and cell cycle of SW480 after transfection and in the control were determined. Western blot assay was used to determine protein expression of mitochondrial apoptotic pathway related gene Caspase-3、Caspase-9、Bax and Bcl-2. Results: mRNA level of Lnc RNA CCAT1 in cancer tissue and colon cancer cell lines were significantly higher than paratumor tissues and the normal cells. For SW480 with knockdown of CATT1, the cell viability decreased and apoptosis rate increased markedly, cell cycle was resisted at G2/M. Protein expression of Caspase-3、Caspase-9 and Bax in cell SW480 with knockdown of CATT1 were much higher than the control and si-Scramble group, which the expression of Bcl-2 was much lower. Conclusion: Lnc RNA CCAT1 can influence colon cancer cell proliferation by regulating mitochondrial apoptotic pathway.
【Key words】Colon cancer; Lnc RNA CCAT1；Mitochondria；Apoptosis；Proliferation
结肠癌(colorectal cancer) 是世界最常见的恶性肿瘤之一。在发达国家，每年接近100万人罹患结直肠癌，其特定疾病死亡率接近33%[1]。目前为止，治疗癌症最有效的方法还是根治手术治疗联合化学疗法，然而将近50%的患者在发现时己经有转移，甚至只有局部肿瘤未转移的患者[2]。超过1/3的患者在手术治疗之后复发[3]。因此研究结肠癌发病机制，寻找有效的风险因子和治疗靶点已成为当今科学界普遍关注的问题。近年来，人们发现，LncRNAs与肿瘤的发生和发展有着密切的关系。其可能通过染色质修饰复合体来影响表观遗传学状态，并传递多个肿瘤进展和转移所需要的表型[4, 5]。CCAT1是研究较少的LncRNA之一，其长度为2628bp，位于转录因子c-myc附近。与正常组织比较，CCAT1在结肠癌组织中高度表达。本实验拟通过相关实验方法检测LncRNA CCAT1对结肠癌细胞增殖的影响及敲除结肠癌细胞株中的CCAT1后，观察结肠癌细胞增殖、细胞周期分布和细胞凋亡的变化。
1.材料与方法
1.1组织及细胞来源
结肠癌组织及癌旁组织收集自2014年6月1日～2014年11月1日在中山医院30例结肠癌患者的癌组织及癌旁组织手术标本，所有标本经病理学检查确诊，符合WHO结肠癌组织学分类和分级标准，患者术前均未接受化疗及放疗。结肠癌细胞SW480和HT29购自中国科学院上海细胞库。
1.2材料
DEME培养基，小牛血清购于美国Hyclone公司，限制性内切酶、DNA、Marker、胶回收试剂盒、T4连接酶试剂盒、SYBR购于大连宝生物试剂公司、PCR引物购自美国Life Technologies公司。CADM1抗体购自Abcam公司，免疫印迹化学发光（ECL）系统购自Syngene公司。PCR表达载体购自Addgene公司。RNA抽提试剂TRIzol、逆转录试剂盒、Lipofectamine2000购自Invotrogen公司。
1.3Real-time PCR检测组织及细胞系中LncRNA CCAT1表达
根据说明书采用Trizol提取细胞系总RNA，RecoverAllTM 总核酸提取试剂盒提取肿瘤组织及正常组织总RNA。SmartSpec Plus分光光度计（Bio-Rad, USA）对纵RNA进行定量。以取100 ng总RNA按操作说明书进行反转录cDNA，反应程序：16℃ 30min，42℃ 30min，85℃ 5min。按Taqman MicroRNA Assays说明检测成熟的LncRNA，以CCAT1及β-actin作模板，LncRNA CCAT1荧光探针作引物扩增，反应程序为：95℃ 45s，95℃ 15s，60℃ 15s，45个循环，所有试验重复3次，相对定量分析2-△△Ct法测定LncRNA CCAT1变化。
1.4细胞培养与转染
设计合成siRNA-scramble及siRNA-CCAT1。结肠癌细胞SW480使用含10%胎牛血清的DEME培养基，在37℃、5%CO2培养箱培养。将处于对数期生长的细胞消化后接种于６孔细胞培养板中，待细胞融合60%～70%，根据LipfectamineTM2000转染试剂说明书分别将siRNA-scramble及siRNA-CCAT1转染SW480细胞。对照组以及结肠癌细胞SW480转染siRNA-scramble及siRNA-CCAT1 48h后，提取siRNA-scramble（1组）及siRNA-CCAT1（3组）四组细胞总RNA。qRT-PCR检测CCAT1的表达变化，CCK-8法检测结肠癌细胞系SW620的增殖水平。
1.5 CCK-8法测定SW620细胞中敲除LncRNA CCAT1后的增殖变化
采用CCK-8试剂盒(上海同仁化学研究所)检测转染siRNA-scramble、siRNA-CCAT1组及对照组的细胞活性。在96孔培养板中每孔加入0.1 mL细胞悬液(细胞数目约为5×103个)，置5％CO2、37℃ 培养箱中培养3d后，见细胞生长近融合，更换无血清培养液(MCDB131)(Gibco，USA)，每组设4个平行板，，每孔加入CCK-8试剂10μL，继续培养1h，酶标仪(Bio-Tek Instiruments．Inc)测吸光度A450值。计算细胞增殖活性(存活率)，细胞增殖活性(%)=(A药物处理组一A空白组)/(A对照组一A空白组)×100%。
1.6 Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡变化
用不含EDTA的的胰酶消化细胞，1000r/min，离心5min，收集细胞，用预冷PBS洗涤细胞2次，1500 r/min，离心5 min，将上清弃净，收集的细胞加入Annexin缓冲液悬液。加入5μL的Annexin V 和1μL PI染色、混匀后，避光，室温孵育约15min；于流式细胞仪上测细胞凋亡情况。每组均设2个复孔，实验重复3次。
1.7蛋白印迹法检测
敲除CAAT1的癌细胞中细胞凋亡蛋白表达水平 为了测定CAAT1对细胞中线粒体凋亡通路的影响，使用蛋白印迹法测定正常癌细胞、敲除CAAT1的癌细胞及转染空载CAAT1质粒的癌细胞中的Caspase-3、Caspase-9、Bax和Bcl-2的蛋白表达变化。收集转染48 h后的SW480细胞对对照组细胞，每孔加入蛋白裂解液90μL，冰上静置30min后，4℃ 12000g离心30min，取上清液。采用二辛可宁酸(BCA)法测定总蛋白浓度。每个样本取60μg蛋白在12％十二烷基硫酸钠(SDS)一聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)中电泳，电泳结束后转至聚偏二佛乙烯(PVDF)膜，与CADM1抗体孵育，然后与相应二抗孵育，最后应用化学发光法检测，使用DU．800型紫外分光光度计(美国Beckman Couher公司产品)Quantity One软件分析各电泳条带的灰度值。用ECL试剂于暗室中显影并曝光。以GAPDH作为内参。
1.8流式细胞仪检测细胞周期变化
流式细胞术检测正常癌细胞、敲除CAAT1的癌细胞及转染空载CAAT1质粒的癌细胞细胞周期分布情况，取l×106个细胞接种于100 mL培养瓶内，加入无血清培养液，培养3 d收集细胞，用PBS液洗2次，缓慢加入一20℃预冷的70％乙醇l mL，固定l h后用PBS液洗二次将等体积的细胞悬液和PI染液混合，4"C放置30 min，将样本放人FCM 的样品室，以激发波长488 nm测定，并用Modfit LT2．0软件分析细胞周期分布。
1.9统计学处理
采用SPSS 18.0软件进行统计学分析，所有计量资料均以平均值x-±s表示，两组间比较用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2.结果
2.1 LncRNA CCAT1在结肠癌组织和细胞系中过表达 为了测定LncRNA CCAT1在结肠癌组织及细胞系中的表达，使用RT-PCR相对定量检测方法检测LncRNA CCAT1在30例结肠癌组织及10例癌旁组织中的mRNA水平表达差异。结果发现LncRNA CCAT1在肿瘤组织中高表达，在癌旁组织中呈现低表达态势（图1A）。为了进一步验证CCAT1在结肠癌病人中是否过表达，使用RT-PCR测定CCAT1在正常细胞系293-T、结肠癌细胞系SW620、HCT116及HT29中的表达并比较，结果发现CCAT1在3株结肠癌细胞系中的表达均显著高于对照组（P＜0.01），而CCAT1在结肠癌细胞SW620中的表达又高于HCT116和HT29（图1B）。因此，在后期探索CCAT1对结肠癌细胞增殖及活性的影响及分子机制时，使用细胞系SW620进行实验。
图1 qRT-PCR测定LncRNA CCAT1在结肠癌组织及细胞系中的表达 A：qRT-PCR测定CCAT1在30例结肠癌组织及癌旁组织中的表达；B：qRT-PCR测定CCAT1在正常细胞系293-T、结肠癌细胞系SW620、HCT116及HT29中的表达
2.2 敲除CCAT1后癌细胞SW620中的CCAT1表达及细胞活性变化 使用空载CCAT1的siRNA及整合CCAT1的siRNA感染癌细胞SW620，为了验证转染达到一定效果，使用RT-PCR测定转染siRNA-Scramble、siRNA-CCAT1后的癌细胞SW620中CCAT1的相对表达水平，结果发现CCAT1相对表达水平在si-CCAT1-1、si-CCAT1-2及si-CCAT1-3组显著高于si-Scramble组（图2A），这说明癌细胞SW620中的CCAT1被成功敲除。使用CCK-8试剂盒测定对照组、si-Scramble组及si-CCAT1组中SW620细胞活性随培养时间的变化。结果如图2B所示，SW620细胞活性均随培养时间的增加而增加，但在si-CCAT1组的增长速度低于对照组及si-Scramble组，并且在细胞培养的第3、4、5天，SW620在si-CCAT1组的细胞活性均显著低于对照组及si-Scramble组（第3天：P＜0.05，第4、5天，P＜0.01）。
图2 RT-PCR测定癌细胞SW620中的CCAT1表达及SW620细胞活性变化 A：RT-PCR测定转染si-Scramble及si-CCAT1的癌细胞SW620中的CCAT1表达；B：CCK-8法测定转染si-Scramble、si-CCAT1的SW620细胞及对照SW620细胞的细胞活性。
2.3结肠癌细胞SW480敲除CCAT1后的凋亡变化 将si-CCAT1、si-Scramble转染至结肠癌细胞SW480，并且使用CCK-8测定完细胞的增殖活性后，使用流式细胞仪检测这3组细胞的凋亡情况并进行比较。结果发现凋亡细胞百分率在si-Scramble组及对照组几乎一致，而其在si-CCAT1组的值显著高于si-Scramble组及对照组（P＜0.01），这表明敲除CCAT1后，结肠癌细胞SW480凋亡率增加，CCAT1的表达会影响癌细胞的凋亡（图3）。
图3结肠癌细胞SW480在对照组、si-CCAT1组及si-Scramble组的凋亡情况 A: 对照组；B：si-Scramble组；C：si-CCAT1组
2.4 CCAT1对线粒体凋亡通路的影响 为了探索LncRNA CCAT1对线粒体凋亡通路的影响，我们使用蛋白印迹法测定线粒体凋亡通路相关基因Caspase-3、Caspase-9、Bax和Bcl-2在对照组、si-Scramble组及si-CCAT1组的蛋白表达并进行比较，结果如图4所示。结果表示Caspase-3、Caspase-9、Bax蛋白表达在si-CCAT1组均显著高于对照组及si-Scramble组（P＜0.01），Bcl-2基因在si-CCAT1组的蛋白表达显著低于对照组及si-Scramble组（P＜0.01）。
图4 线粒体凋亡通路相关基因Caspase-3、Caspase-9、Bax和Bcl-2在对照组、si-Scramble组及si-CCAT1组的蛋白表达
2.5结肠癌细胞SW480敲除CCAT1后的细胞周期变化 上述结果已经给出了CCAT1对癌细胞增殖及凋亡的影响，为了进一步探索CCAT1对癌细胞的影响，我们使用流式细胞术测定结肠癌细胞SW480敲除CCAT1后的细胞周期变化。分析发现，对照组SW480细胞的DNA在Go/Gl期较高为63.35％，S期为26.08％，G2/M 期为l0.57％，表明DNA合成期细胞比例高，增殖能力强。si-Scramble组的数据与对照组类似。而si-CCAT1组的DNA在Go/Gl期较高为57.45％，S期为19.78％，G2/M 期为22.77％，凋亡增大，这干扰CCAT-1后，细胞周期阻滞在G2/M期。
图5结肠癌细胞SW480在对照组、si-CCAT1组及si-Scramble组的细胞周期情况 A: 对照组；B：si-Scramble组；C：si-CCAT1组；D：Go/Gl、S、G2/M期在对照组、si-CCAT1组及si-Scramble组中的比例。
3.讨论
结肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，目前对于结肠癌的形成、发展、预后以及治疗都有了新的认识，但要治愈和预防结肠癌的发生，关键问题是了解结肠癌的病因及发病机制[6]。但是，仍然有较多的患者因为缺乏有效的治疗手段而失去健康， 因此很有必要进一步研究结肠癌的致癌效应并寻找出新的治疗策略。随着分子生物学的发展，LncRNA与肿瘤发生发展的相关性得到越来越多的研究者的关注。长链非编码RNA(LncRNA)是一类转录本长度超过200nt的RNA分子,它们虽不编码蛋白，但以RNA的形式在多个层面上(表观遗传的调控、转录的调控和转录后的调控等)调控相关基因的表达[7]。到目前为止，很多肿瘤的发生与lncRNA的关系已被阐明。例如：在结肠癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌等多种实体肿瘤中出现了异常的表达[8]。直至目前,发现的具有功能的IncRNA已超过了7000个，其中有些可以作为肿瘤诊断及监测进展的指标,并能够为肿瘤的治疗提供紀点，未来也许也可以成为肿瘤的疗效判定标准之一[9]。CCAT1是一种在与正常组织相比，在结肠癌组织中过表达的LncRNA，能够促进结肠癌细胞增殖与侵袭，临床上与病人的临床分期、淋巴结转移和预后密切相关[10]。此外，人体组织的研究发现最小的CCAT1在正常肝组织和小肠组织表达很少；并且，许多其他人体组织经过检测没有发现CCAT1的表达。另外，CCAT1位于人染色体8q24.21，被描述为“热点”，导致结肠癌的基因突变[11]。Pang等人研究发现在胃癌中，CCAT1的不正常表达能够导致胃癌细胞的增殖及转移[12]。Sun 等人研究发现CATT1是结肠直肠癌的一种潜在生物标记物，可以对结肠直肠癌进行预测诊断及预后[13]。本研究拟在前人研究的基础上，进一步探讨CCAT1通过调控线粒体凋亡通路影响结肠癌细胞增殖的机制，寻找有效的结肠癌风险因子和治疗靶点，为结肠癌的诊断、治疗及预后判断提供生物标志物参考。
本实验中，我们首先选取30例新鲜结肠癌组织及其自身癌旁组织，应用RT-PCR法检测结肠癌癌变组织与癌旁组织中及多种结肠癌细胞系中CCAT1的表达量，结果发现CCAT1在结肠癌癌组织及结肠癌细胞中的表达显著高于癌旁组织及正常细胞，为了探索CCAT1对结肠癌细胞增殖及凋亡的影响，使用si-CATT1感染结肠癌细胞以敲除其中的CATT1，再使用CCK-8法测定敲除CATT1后结肠癌细胞的增殖能力及流式细胞仪测定细胞凋亡情况，结果发现敲除CATT1后的结肠癌细胞活力下降，凋亡数增加，这表明人体内CATT1的低表达能够降低结肠癌细胞的增殖能力，并能增加凋亡率。为了探索CATT1影响结肠癌细胞增殖的分子机制，我们分析检测敲CCAT1后结肠癌细胞中与线粒体凋亡通路相关的基因Caspase-3、Caspase-9、Bax和Bcl-2的蛋白表达并与对照组进行比较，结果发现敲除CCAT1的癌细胞中Caspase-3、Caspase-9、Bax的表达显著高于对照组，而Bcl-2明显低于对照组。线粒体是真核生物能量和代谢的中心, 也是在细胞凋亡, 信号转导中起关键调节作用的细胞器。目前，在细胞凋亡的机制研究中提出了两条主要信号途径，即线粒体途径和死亡受体途径。caspases是凋亡信号转导的共同通路，许多调控细胞凋亡的因素都通过caspases酶系起作用[14]。Caspase-3是Caspase家族中最重要的一员，是细胞凋亡过程中的关键效应分子，其在不同肿瘤组织中表达及意义存在差异，其量增加会促进细胞凋亡。结直肠癌Caspase-3阳性表达率显著高于正常结肠粘膜，且其高表达与肿瘤复发相关[15]。caspase-9是启动caLspase，细胞受到凋亡信号刺激后，caspase．9前体通过自身水解而活化，活化的caspase-9与下游效应caLspaLse-3结合，激活的caspase-3能对大量的底物进行切割、裂解，包括抗凋亡成分及结构蛋白，最终导致细胞死亡[16]。Bcl-2和Bax属于bcl-2家族，共同调控细胞的凋亡过程，其中bcl-2为抗凋亡基因，通过许多刺激因素如神经营养和增长因子的缺乏、Ca-渗透、热休克、辐射和某些病毒等而阻止细胞死亡，可导致DNA受损的细胞持续生存、突变产物聚集，从而促进肿瘤的发生发展[17]。Miyashita发现bcl-2蛋白能抑制抗肿瘤药物诱导的细胞凋亡[18]。bax为促凋亡基因，当细胞中bax表达增高、bcl-2表达降低，导致Caspase-3表达增加，细胞凋亡增加。Qu通过下调bcl-2的表达，上调bax和Caspase-3的表达，增加肺癌NCI-H209细胞及前列腺癌PC-3细胞的凋亡[19]。对敲除CATT1的结肠癌细胞进一步的周期分析也发现干扰CCAT-1后，细胞周期阻滞在G2/M期。这说明CATT1通过通过调控线粒体凋亡通路影响结肠癌细胞增殖与凋亡。
综上所述，长链非编码RNA CCAT1能够通过调控线粒体凋亡通路影响结肠癌细胞的增殖与凋亡，此研究为结肠癌预后判断和后期治疗提供实验依据。
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论文作者:赵志洋
论文发表刊物:《医药前沿》2015年12月第35期
论文发表时间:2016/5/6
标签：癌细胞论文; 细胞论文; 结肠论文; 凋亡论文; 组织论文; 结肠癌论文; 细胞系论文; 《医药前沿》2015年12月第35期论文;