张瑞玲[1]2004年在《菊粉酶高产菌株的生物学特性研究》文中指出本论文以菊粉酶的高产菌株Asp.niger M89、Asp.niger H8和突变菌株Asp.niger U γ-2为研究对象，对叁株菌的主要生物学特性进行了研究。研究内容包括菌株形态学研究、菌株所产酶系的研究和菊粉酶基因序列的研究。 在菌株形态学研究方面，对叁株高产菊粉酶菌株在察氏培养基、麦芽汁培养基、PDA培养基、同化亚硝酸盐培养基中的菌落形态；显微镜下的分生孢子头、分生孢子梗、足细胞、顶囊等个体形态；扫描电镜下的分生孢子表面形态等方面做了较系统的研究。根据资料可将菌株Asp.niger M89和Asp.niger H8鉴定为黑曲霉群泡盛酒曲霉种(Aspergillus awamori)，诱变菌株Asp.nigerU γ-2可鉴定到黑曲霉群臭曲霉种(Aspergillus foetides)。诱变使菌落形态发生了很大的变化。并且通过此方面的研究建立起一套简便有效的用于霉菌形态鉴定当中样品的处理方法。 对菌株所产酶系的研究方面，分别测了菊粉酶、蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、纤维素酶的产生曲线。此叁株菌株除高产菊粉酶外，均产生不同水平的蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、纤维素酶，其中菊粉酶的产酶水平较高，产其他酶系的活力相对较低。诱变菌株除菊粉酶活力大幅度提高以外，淀粉酶和果胶酶也有明显提高。对于同一菌株来说酶系中不同酶的产酶高峰不同，酶量高峰出现的早晚不同。其酶活力高峰随发酵时间依次是蛋白酶、淀粉酶、菊粉酶和果胶酶，纤维素酶因不同菌株有一定差异。 针对GenBank所报道的四种来源于黑曲霉菌株的菊粉酶序列，分别设计引物，以本研究菌株基因组DNA为模版，进行PCR扩增，并进行了核苷酸序列的测序。测序结果与原序列进行了同源性比较分析，同源性并不高，可以推测本研究菌株所产菊粉酶基因序列与所报道的有所不同。
魏微[2]2009年在《高产菊粉酶菌株的诱变选育及其酶的固定化》文中进行了进一步梳理菊粉是由D-呋喃果搪以β-2,1-糖苷键连接的多聚果糖。其还原端接一个葡萄糖基,呈直链结构,富含于菊芋等多种菊科植物中,菊芋块茎主要成分是菊粉,其含量占干重的70%-80%。菊芋适应性强,耐贫瘠,种植简易,产量较高,是制备果搪或高果糖浆、菊粉寡糖和燃料酒精的极好原料。而菊粉酶是水解菊粉的高效专一作用剂,微生物源菊粉酶通常是底物诱导性的外切酶,主要通过催化水解菊粉链的非还原性末端的糖苷键,逐一水解释放出果糖,主要产物是果糖。为选育高产菊粉酶菌株,以本试验室所保存的Penicillium sp.B01为出发菌株,分别通过物理诱变、化学诱变和复合诱变的方法达到诱变目的。其中化学诱变是通过使用不同浓度的化学剂吖黄素、硫酸二乙酯对原始菌株的孢子悬液进行了不同时间的处理；物理诱变是通过钴射线对孢子悬液进行达到一定累计计量电离辐照；复合诱变则是通过先通过化学诱变再经过物理诱变来完成。在得到大量的诱变突变体后再经过初筛和复筛,最终在30μg/ml吖黄素诱变时间2 h,剂量率为4.11Gy/min的60Co-γ射线辐射使累计剂量为20.55 Gy复合诱变的条件下,筛选出一株菊粉酶活比出发菌株高32%的突变菌株B01-Al3-Co31。将此菌种连续传代6次进行产酶性能的稳定性测定,证明了此菌株具有良好的遗传稳定性。突变菌株Penicillium sp. B01-A13-Co31所产菊粉酶在pH值4.5至5.5之间酶活变化不明显,最适pH为4.5,最适温度为55℃。为更好地运用菊粉酶进行菊粉深加工的工业化生产,将突变菌株纯化后扩大培养,对菊粉酶进行固定化技术研究。固定化试验通过海藻酸钠包埋法,SLD263阴性树脂吸附法和人造纤维共价偶联法叁种方法进行,并分别对叁种固定化酶酶活回收率进行了测定,结果表明：采用浓度为4%的海藻酸钠包埋法所固定的固定化酶的酶活回收率最高,在加酶量为3 U／ml时酶活回收率达72.8%。叁种固定化酶反应最适温度均为55℃,在温度稳定性方面,固定化酶的相对酶活的稳定性都高于游离酶,其中微晶纤维固定化酶的相对酶活受温度影响最小。叁种固定化酶的反应最适pH不同,其中微晶纤维固定化酶和阴性树脂固定化酶的最适pH为4.0,海藻酸钠固定化酶的最适pH为4.5,与游离酶相同。在pH稳定方面,当pH大于4.5后微晶纤维、阴性树脂固定化酶的相对酶活发生了明显下降,其相对酶活受pH影响很明显,较游离酶的稳定性更低,而只有海藻酸钠固定化酶在相同pH范围下相对酶活稳定性高于游离酶。从固定化酶酶活回收率、相对酶活的稳定性和固定化过程的可操作性综合考虑确定突变菌株Penicillium sp. B01-A13-Co31所产菊粉酶采用海藻酸钠包埋法固定化方法优于其他两种方法。
徐金利[3]2012年在《产乳糖酶酵母菌株的遗传改良和乳糖酶的发酵生产》文中指出马克斯克鲁维酵母菌（Kluyveromyces marxianus）具有代谢底物广、耐热性好及比生长速率快等多种优良特性，并且能合成大量的乳糖酶、菊粉酶、β-葡萄糖苷酶和其它酶，因而引起国内外学者的广泛关注。与其它种类的微生物相比，该酵母菌是一类在食品工业中普遍采用的微生物，用作酶源非常合适。微生物中普遍存在葡萄糖阻遏现象，当有葡萄糖存在时，许多酶的合成和基因表达都会受到抑制。参与葡萄糖阻遏作用的主要为Snf1复合体和Mig1蛋白，当培养基中葡萄糖浓度较高时，Snf1复合体去磷酸化，Snf1复合体失去活性，这时Migl由于不能被磷酸化，进入细胞核中与受葡萄糖阻遏基因的启动子结合，使基因表达受到抑制，说明Mig1在菌株的酶合成和调控中起重要的作用。如果将编码Mig1的MIG1基因敲除，相关基因的阻遏效应解除。因而本研究通过基因敲除法阻断K. marxianus km菌株MIG1基因，然后研究该基因的敲除对该菌株酶的合成和相关基因的表达产生的影响。首先利用编码潮霉素的HPT基因的ORF替换km-15菌株的MIG1基因的ORF，在含有潮霉素的YPD平板上筛选获得了敲除菌株km-15，它能在含有2-脱氧-D-葡萄糖的乳糖培养基平板上生长，而野生型菌株km则都不能，表明敲除菌株葡萄糖阻遏作用解除。与野生型菌株km相比，敲除菌株km-15的乳糖酶、菊粉酶和β-葡萄糖苷酶的产量均有很大提高，同时编码这些酶基因的表达量也有极大提高。这表明，K. marxianus km中的Mig1确实能阻遏某些基因的表达，对一些酶的合成具有调控作用。对敲除菌株km-15产乳糖酶培养基进行了优化，确定了最佳培养基成分为（w/v）：乳清粉10.0%、酵母粉1.5%、蛋白胨1.0%和MnCl21.0mM。在28°C、pH7.0条件下180rpm振荡培养48h，km-15菌株乳糖酶产量为111.7U/mL。经过2-L发酵罐发酵，该菌株乳糖酶产量提高到121.7U/mL。同时，确定了酶法水解乳糖的适宜条件，即乳糖浓度9.0%（w/v）、乳糖酶使用量为440U/g乳糖、40°C、pH7.0和水解时间2.5h，在这种条件下乳糖水解率为99.2%。在同样条件下，12.0%（w/v）的乳清粉经过该酶水解3.5h后，乳清粉中乳糖水解率为98.7%。调节乳糖酶使用量为260U/g乳糖添加到5.0mL牛奶中，水解3.0h后，牛奶中乳糖水解率为99.3%。将上述水解液进行薄层层析，结果显示水解产物只有单糖，即葡萄糖和半乳糖，其中的乳糖完全水解，表明该乳糖酶在食品工业中具有潜在的应用价值。就上面所说的那样，该酵母菌还产菊粉酶。对敲除菌株km-15产菊粉酶培养基进行了优化，确定了最佳培养基成分为（w/v）：菊粉8.0%、酵母粉3.0%，在28°C、pH4.5的条件下180rpm振荡培养42h，km-15菌株菊粉酶的活力为69.0U/mL。分别以菊粉和菊芋汁作为碳源，经过2-L发酵罐发酵，发酵48h和60h后，菊粉酶活性分别为79.9U/mL和73.3U/mL。然后，确定了酶法水解菊粉的适宜条件，即菊粉浓度6.0%（w/v）、菊粉酶使用量为400U/g菊粉、50°C、pH4.5、水解时间3.0h，菊粉水解率为96.2%。将其水解产物进行薄层层析分析，水解终产物以单糖为主，仅有少许寡糖，表明km-15菌株所产菊粉酶为外切菊粉酶。本实验室自南极海洋沉积物中分离出1株耐冷酵母Guehomyces pullulans17-1菌株在15°C可同时产胞外和与细胞结合的乳糖酶。故采用NTG对G.pullulans17-1菌株进行诱变，结合X-gal显蓝斑和发酵培养测定的选育方法，获得乳糖酶活力达24.8U/mL且遗传稳定的突变菌株NTG-133，产量比野生型菌株（13.9U/mL）提高近一倍。对突变菌株NTG-133产乳糖酶培养基进行了优化，确定了最佳培养基成分为（w/v）：乳清粉4.0%、蛋白胨1.0%、酵母粉0.5%，于15°C、pH4.5条件下，170rpm振荡培养132h，乳糖酶活达38.0U/mL。采用发酵罐发酵产酶，乳糖酶活提高到48.1U/mL。然后，确定了酶法水解乳糖的适宜条件，即乳糖浓度9.0%（w/v）、乳糖酶的使用量为550U/g乳糖、40°C、pH4.0、水解时间6.0h，乳糖水解率为91.8%。在最适水解条件下，12.0%（w/v）的乳清粉，水解7.5h后，乳清粉中乳糖水解率为88.3%。将上述水解液进行薄层层析分析，结果显示水解产物主要是单糖，即葡萄糖和半乳糖，但没有水解完全，仍有残留乳糖存在。
郭宁[4]2009年在《一株高产酵母突变株菊糖酶的生产和酒精发酵的研究》文中研究说明菊粉(Inulin)是一种广泛存在于菊科植物如菊芋(Jerusalem artichoke)等根部或块茎中的一种贮存性多糖,自然界中储量非常丰富,是生产果糖糖浆、低聚果糖、液体燃料酒精等的优质可再生原材料。菊粉酶(Inulinase)是一种主要来源于微生物的一类水解酶,能够水解β-2,1-D-果聚糖糖苷键,学名为β-2,1-D-果聚糖酶(EC.3.2.1),能够将菊粉水解为果糖和葡萄糖。但自然界中微生物所产的菊粉酶活力一般比较低,酶产量也不高,不足以满足工业生产的需要。本实验以实验室保藏的一株季也蒙毕赤酵母(Pichia Guilliermondii)菌株1作为出发菌株,经过紫外线结合氯化锂诱变方法得到一株高产菊粉酶的突变株M-30,使其酶活力较原始菌株有了很大的提高。同时还利用了表面响应法(Surface Response Methodology, SRM)对得到的海洋季也蒙毕赤酵母突变株M-30的液体发酵条件进行了优化,得到的最终优化条件为菊粉2.0%(w/v),酵母粉0.5%(w/v),接种量2.0%(v/v),28℃培养,初始pH6.5。在最优条件下,突变株M-30的液体发酵酶活力达到了127.7 U/ml,远远高于原始出发菌株1在相同培养条件下的48.1U/ml。并且发现该突变株所产的粗酶液能够有效的将菊粉转化为单糖。说明通过紫外线结合氯化锂诱变方法,使得突变株的酶活力有了明显提高,并且具有较高的外切菊粉酶活性。在上述实验的基础上,进一步利用突变株M-30所产的菊粉酶和本实验室保藏的一株酿酒酵母W-0菌株,以菊粉和菊芋块茎提取液为底物,进行了糖化和发酵生产酒精实验。以菊粉为底物的发酵培养基,发酵结束后得到的酒精浓度为12.93 0.30%(v/v),而以菊芋块茎提取液为底物的培养基,产生的酒精浓度为7.03 0.21%(v/v)。在目前能源危机和粮食危机的双重背景下,为液体燃料酒精的非粮化生产做出了积极的探索和尝试。
徐艳新[5]2013年在《菊粉酶产生菌的选育及其酶学性质的初步研究》文中认为本文以实验室保藏的黑曲霉为出发菌株，对其进行了诱变，对突变株的发酵条件进行了优化，并对菊粉酶进行了分离纯化及酶学性质的研究，最后对菊芋粉的水解进行了初步研究，主要结论如下：(1)出发菌株黑曲霉YH-1的菊粉酶活力Ⅰ为60.9U/mL，I/S=0.38。对其进行了亚硝基胍诱变、高温和高菊芋粉相结合的梯度驯化后，最终选育出一株产酶较高的菌株YH-3，菊粉酶活力Ⅰ为85.2U/mL，I/S=0.38保持不变。(2)对菌株YH-3进行产酶培养基及发酵条件优化，确定最佳产酶培养基：菊芋粉25.2g/L、豆饼粉40g/L、蔗糖酯4.9g/L和氯化钠5.5g/L；最佳发酵条件：接种量0.8mL孢子液/瓶，发酵温度37℃，装液量80mL/500mL，发酵周期96h，在最佳的发酵条件下菊粉酶活力Ⅰ为196.0U/mL，比出发菌株提高了2.2倍。(3)发酵液经过硫酸铵分级沉淀、MonoQ5/50GL强阴离子柱、Superdex20010/300GL凝胶柱分离纯化，得到的两个外切型酶菊粉酶Exo-Ⅰ和Exo-Ⅱ。经过SDS-PAGE电泳验证，分子量分别为76kDa和65kDa。(4)对分离得到的菊粉酶组分进行酶学性质研究，发现Exo-Ⅰ和Exo-Ⅱ在pH2.6-5.0范围内比较稳定，最适pH均为3.6。两者最适温度均为68℃，50℃以下酶活较稳定，Exo-Ⅱ强于Exo-Ⅰ耐热性能。金属离子中Mn~(2+)和Cu~(2+)对Exo-Ⅰ和Exo-Ⅱ具有明显的激活作用，其次是Fe~(2+)和Zn~(2+)。K~+对Exo-Ⅰ具有很强的抑制作用，对Exo-Ⅱ几乎没有影响。Ca~(2+)对Exo-Ⅰ具有一定的促进作用，但对Exo-Ⅱ几乎没有影响。以菊糖为底物，测定菊粉酶的动力学参数，Exo-Ⅰ、Exo-Ⅱ的Vmax分别为23.6mmol/(mL·min)和5.3mmol/(mL·min)，Km分别为1.89mmol/L和2.01mmol/L。(5)初步研究了粗酶液与分离得到的两个菊粉酶水解菊芋粉的条件及水解产物的分析，发现加酶量50u/g菊粉，水解10h，降解率达到88%以上。Exo-Ⅰ比Exo-Ⅱ降解菊芋粉的能力强。得到的水解液都以果糖为主，表明都是外切型菊粉酶。
葛向阳[6]2009年在《菊芋发酵生产L-乳酸的研究》文中提出近年来,国内外对L-乳酸的需求日趋增加,而我国L-乳酸的生产技术比较落后。菊芋作为一种生长能力强、抗盐碱、耐沙漠的作物,其在我国中西部地区的种植面积正以基地的形式逐年加大。菊芋深加工的研究引起了国内外学者的广泛关注,然而开展菊芋发酵生产L-乳酸的研究尚未见报道。由于乳酸菌自身不能利用菊粉,本研究采用一株菊粉酶活力较强的黑曲霉为产酶菌株,以乳酸杆菌G-01为L-乳酸生产出发菌株,对以菊芋为原料的L-乳酸的发酵法生产进行了研究。主要内容及结果如下:⑴通过对黑曲霉产菊粉酶培养基组成的优化,得到最佳培养基组成:葡萄糖40 g/L,蛋白胨30 g/L和蔗糖脂4 g/L。并在该优化条件下于30℃,140 r/min下进行摇瓶发酵,96 h后菊粉酶酶活力达到230 U/mL。进一步研究表明菊粉酶是一种诱导酶,从诱导效果上看,蔗糖酯相对于菊粉是一种更有效的合成诱导剂,该物质可以激活用于生产菊粉酶的mRNA的合成。同时由于蔗糖酯在溶液中相对于菊粉,更难水解,所以有着更强的和持续的诱导作用。研究还发现在使用葡萄糖作为碳源,蔗糖酯作为合成促进剂时,更有利于菌丝体的生长和酶的合成。通过对该株菌的基因和形态学分析,确定其为黑曲霉。⑵菊粉酶的提取,先采用30%饱和度的硫酸铵盐析,沉淀除杂,然后采用70%饱和度盐析,经透析除盐,聚乙二醇20000浓缩,得到总酶活25253U,单位酶活1262 U/mL,比酶活64.37 U/mg,回收率83%,纯化倍数2.36。进一步纯化表明黑曲霉产菊粉酶是由两种分子量相差较小的内切酶和外切酶组成,前者分子量在165～210 kDa,而后者的分子量在160～170 kDa。比较转化酶和菊粉酶在30℃的催化动力学发现:转化酶的Km=34.9 mmol/L,Vm=909μmol/min,菊粉酶的Km=68.3 mmol/L,Vm=476.2μmol/min,这表明转化酶的最大反应速率接近菊粉酶的2倍,然而达到最大反应速率所需底物的浓度却接近菊粉酶的一半。⑶通过DES和NTG对乳酸杆菌G-01进行诱变,并进行耐渗透驯化,使菌株以葡萄糖为底物产酸达到92.8 g/L,提高了近1倍。乳酸菌G-02菌株经过多次传代接种,表现出较好的传代稳定性。通过对该菌株的基因、形态学及代谢产物分析,确定其为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei),乳酸同型发酵,而且产物中L-乳酸的光学纯度达到95%以上,为一株较为理想的L-乳酸生产菌株。⑷为了消除菊粉酶合成体系中的产物抑制现象,降低发酵液中黑曲霉菌丝体密度,同时避免在同步糖化与发酵菊芋产乳酸工艺中的染菌问题,使乳酸杆菌在菊芋糖化酶液中提前形成优势菌群,本研究采用在黑曲霉产酶培养基中适时接入乳酸菌的混合培养工艺,并对混合培养工艺条件进行了优化。结果表明,在产酶培养开始12 h接入乳酸杆菌,可以显着提高黑曲霉后期产菊粉酶的活性,在优化的培养基中,经过60 h的培养,菊粉酶活力将达到250 U/mL,较参照水平(50 U/mL)提高了近4倍。进一步研究发现,乳酸菌的接入显着地降低了发酵液中可发酵性糖的浓度,发酵液中黑曲霉菌丝体浓度降低到参照的一半,而且黑曲霉的菌丝体形态发生了明显的改变,从而更有利于生存在竞争的环境中。⑸对采用同步糖化与发酵工艺利用菊芋生产L-乳酸的工艺进行了探索,研究发现最适发酵工艺为菊粉酶活量50 U/mL,接种量为35%,菊芋粉抑制浓度为230 g/L,碳酸钙浓度50 g/L。为了进一步提高乳酸发酵活力,将柠檬酸代谢引入乳酸发酵工艺,结果表明:柠檬酸代谢可以显着提高乳酸杆菌的抗酸胁迫能力和乳酸发酵活性,最适柠檬酸添加浓度为10 g/L。在最佳工艺条件下,通过采用50℃初始水解1h的补料发酵工艺,经40℃,30 h发酵,L-乳酸浓度达到141.5 g/L,得率为52.4g乳酸/100g菊芋粉。
郑彦山[7]2010年在《防风固沙植物菊芋的酶降解机制研究》文中研究表明菊芋为菊科向日葵属多年生草本植物。其菊芋适应性强,生长旺盛,具有优良的防风固沙、保持水土的生态性能。菊芋块茎富含菊糖,是发酵工业潜在的碳源。菊糖经菊粉酶降解可生产果糖或低聚果糖,也可用来发酵生产酒精、有机酸等产品。本研究以菊粉、甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)、四甲基乙二胺(TMEDA)和活性染料为主要原料,通过接枝聚合制备菊粉凝胶,再经染色,制成不溶性呈色菊粉。以此菊粉为培养基唯一碳源从土壤中分离出12株产菊粉酶微生物,其中1株酶活力最高,鉴定为黑曲霉;以其为出发菌株,复合诱变选育出1株高产菊粉酶菌株AU-55;单因素试验和正交试验设计优化的AU-55发酵产酶条件为,菊芋汁250.0mL·L~(-1),玉米浆20.0 g·L~(-1),NH4H2PO4 5.0 g·L ~(-1),MgSO4·7H2O 0.5 g·L ~(-1),NaCl 3.0 g·L,初始pH值6.5,接种量35 g·L~(-1)时,在30℃,200r/min摇瓶培养4d产酶量最高,达42.3U·mL~(-1);菊芋汁酶法降解最优条件为:pH4.5,底物浓度10%,加酶量12%,45℃下,酶解时间14h,水解率达97%以上。
马再超[8]2015年在《海洋产黑色素短梗霉P16菌株产普鲁兰多糖的研究》文中研究指明普鲁兰多糖是一种线性葡聚糖,由重复的麦芽叁糖单位经α-1,6糖苷键连接而成,是由短梗霉产生的水溶性同型胞外多糖,普鲁兰多糖中α-1,4糖苷键和α-I,6糖苷键相互交替,使其具有结构上的弹性和较强的水溶性。普鲁兰多糖在食品、医药、农业及化妆品等行业具有广泛的应用潜力。对100多株分离自红树林生态系统中的短梗霉菌株产胞外多糖能力进行筛选后,发现产黑色素短梗霉P16菌株产胞外多糖的能力最高。P16菌株产胞外多糖最适培养基中的碳源和氮源分别为120 g/1蔗糖和3 g/l酵母粉。在摇瓶培养条件下,120小时内胞外多糖浓度达65.3±2.1 g/l，细胞干重达18.7±0.38g/l。]0-1发酵罐分批发酵120小时,胞外多糖浓度达67.4±4.5 g/l，菌体量达23.01±0.12g/l,总糖剩余1.1%,还原糖剩余0.078%,并且发酵过程中不产黑色素。P16菌株所产的胞外多糖经过纯化后,可以被普鲁兰酶有效地水解；红外光谱检测分析发现,纯化的胞外多糖与普鲁兰多糖标准品的峰型一致,说明P16菌株所产的胞外多糖为普鲁兰多糖。这是对分离自红树林生态系统产黑色素短梗霉高产普鲁兰多糖的首次报道。在接下来的研究中,为了有效转化菊粉生产普鲁兰多糖,在P16菌株中高效表达了Kluyveromyces maximum KM菌株的INUI基因,通过对不同重组菌株利用菊粉产普鲁兰多糖能力的测定,发现重组菌株E136的菊粉酶酶活达40.92±1.08 U/ml,而原始菌株P16的菊粉酶酶活仅为7.57±0.29 U/ml；重组菌株EI36所产的菊粉酶大部分(99.27%)分泌到培养基中。利用含140 g/l菊粉的发酵培养基进行10-1发酵罐分批发酵,108小时内,普鲁兰多糖浓度达70.57±1.3g/l,菊粉酶活力于60小时达到最高,为42.03 U/ml,培养基中的菊粉被EI36菌株所产的菊粉酶有效地水解,大部分的还原糖被EI36菌株用于普鲁兰多糖的生产。P16菌株经过以上的遗传改造后,可以直接利用菊粉生产普鲁兰多糖。普鲁兰多糖合成酶基因PUL1与普鲁兰多糖的生物合成相关,对P16菌株中PUL1基因进行克隆及特征分析后发现,PUL1基因的ORF长592 bp,编码178个氨基酸,含有]段长55 bP的内含子。PUL1基因的启动子中含有1个CAAT box,1个TATA box和1段5’-HGATAR-3'序列,该基因编码的蛋白含有1段长18个氨基酸的信号肽,5个N-糖基化位点。对PUL1基因进行敲除后,发现敲除菌株DP108的普鲁兰多糖产量显着下降,为34.66±0.34g/l,说明PULl基因与普鲁兰多糖的合成相关。GFP-PUL1融合蛋白表达后,位于酵母细胞中的液泡表面,说明普鲁兰多糖的生物合成发生在酵母细胞的胞质中。在P16菌株中超表达了PUL1基因后,发现重组菌株G14所产的普鲁兰多糖浓度超过72.0g/1，而原始菌株P16在相同条件下的普鲁兰多糖浓度为67.4 g/1,说明普鲁兰多糖的产量由于普鲁兰合成酶基因的超表达而提高。纯化后的普鲁兰多糖分子量为4.422 x 105g/mol,并且分子量分布范围较窄。
张曈[9]2010年在《海洋季也蒙毕赤酵母重组菊粉酶及其在产乙醇中的应用》文中提出菊粉(inulin)作为一种贮藏性碳水化合物存在于菊芋(Jerusalem artichoke)、菊苣(chicory)、大丽花(dahlia)和雪莲果(yacon)等植物的根和茎中,这些植物的根和块茎的产量很大,干重中含有超过70%的菊粉。菊粉(Inulin)是由β-2,1-糖苷键连接的D-呋喃果糖分子组成的链状大分子,在还原末端有一个葡萄糖残基以蔗糖型糖苷键连接。菊粉作为一种应用于高果糖浆生产,酒精发酵和寡菊糖生产的可再生原料,近来受到越来越多的关注。菊粉酶(Inulinase)是一种水解酶,它作用于β-2,1糖苷键并将菊粉水解为果糖和葡萄糖。我们发现,从海藻表面分离得到的季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)菌株1(中国海洋微生物菌种保藏中心编号2E00048)能向培养液中分泌大量的菊粉酶。我们将海洋季也蒙毕赤酵母strain1中克隆到的菊粉酶基因INU1在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris) X-33中表达,并优化了产酶条件,实现了菊粉酶的超表达。产酶条件优化之后,在72 h 150.0 mL摇瓶培养之后,在培养液上清中得到79.8±3.5 U/mL重组菊粉酶；经过120 h 2-L发酵罐发酵之后,在上清中获得286.8±5.4 U/mL(比活力8873±55.3 U/mg)的重组菊粉酶。随后我们纯化了重组菊粉酶并研究了它的酶学性质。纯化的重组菊粉酶的分子量为57.6kDa,大于野生型菊粉酶。它的最适pH值和最适温度分别为6.0和60℃。纯化的重组菊粉酶的其他生物化学性质与海洋季也蒙毕赤酵母中的野生型菊粉酶相一致。纯化的重组菊粉酶依然具有很高的外切活性,因此在食品和医药工业中具有广泛的潜在应用价值。我们已经证实,酵母菌株W0能够发酵生产高浓度的酒精,但是W0不能直接利用菊粉作为发酵产酒精的原料。因此我们使用2-L发酵罐发酵得到的重组菊粉酶的粗酶液糖化菊粉,作为W0发酵酒精的原料。经过150.0 mL小发酵瓶和1-L发酵体系的菊粉水解液发酵实验,分别获得14.9±0.4%(v/v)和14.8±0.2%(v/v)的酒精产量。发酵液中的总糖和还原糖的残留极少,说明菊粉已全部被水解并转化为酒精。为了简化酒精发酵工艺,我们对酵母菌株WO进行了代谢改造,将海洋季也蒙毕赤酵母strain1中克隆到的菊粉酶基因INU1在酵母菌株WO的尿嘧啶缺陷突变株W101中表达。转化子Inu-66经过72h的培养能分泌33.7±0.4 U/mL的胞外菊粉酶。我们通过菊粉一步发酵产酒精的实验发现,重组酶接种量为22.8 U/g菊粉时最适合菊粉的水解和酒精的发酵生产。在150.0 mL体系中,酒精产量为13.7±0.5%(v/v),总糖利用率为99.1%。在2-L发酵罐中,酒精产量为14.9±0.6%(v/v),总糖利用率为99.5%,发酵培养基中的菊粉都转化为了酒精、CO2和细胞生物量。使用重组子Inu-66在2-L发酵罐中直接发酵菊芋粉和硫酸铵配制的发酵培养基产酒精,酒精产量为12.1±0.3%(v/v),总糖利用率为90.4±0.5%(w/v),残留还原糖含量为0.05±0.01%(w/v)。这个结果表明菊芋中所含有的总糖不全是可以被重组子Inu-66利用的菊粉,还有一些无法被水解的多糖。
张秀兰[10]2011年在《以菊芋为原料的酒精发酵研究》文中研究说明本实验选用多种不同的培养基,经过广泛的初筛、复筛,得到了14株产菊粉酶的微生物菌种,其中酶活力最高的菌株为B02,其I(内切酶)、S(外切酶)值分别为:4.34U·mL~(-1),5.97U·mL~(-1)。经过对其平板菌落形态的观察以及显微观察等将B02初步鉴定为青霉属菌株。为了获得一株能够直接利用菊芋来进行酒精发酵的融合菌株,选择适宜的原生质体制备与融合条件,将自行筛选所得的一株高产菊粉酶的青霉菌B02与酿酒酵母进行原生质体融合,将菊粉酶基因引入酿酒酵母,使杂交后代具有直接利用菊粉制造酒精的能力,经选择性检出融合子,对其产酶能力、产酒精能力进行测定,进而对其遗传稳定性进行研究,最终筛选出一株各项性能较优的融合菌株R8。酒精发酵试验结果显示,其产菊粉酶能力为:I:8.79,S:25.09,发酵菊粉的酒精得率为41.16%,原料糖分利用率为75.52%,酒精含量为31.6g·L~(-1)。将试验筛选出的融合菌株R8进行酒精发酵条件优化,经过6个单因素试验和正交试验,得到的优化条件为:160g·L~(-1)JAE(菊芋提取液),25g·L~(-1) BE(牛肉膏),8g·L~(-1) NH_4H_2PO_4,0.1g·L~(-1) ZnCl_2,pH6.0,30℃,转速180rpm。最终酒精得率为46.30%,原料糖分利用率达到84.96%。利用响应面优化数据处理软件Design-Expert对培养基碳源、氮源做进一步的分析优化,得到的培养基碳源、氮源浓度分别为:150.70g·L~(-1)JAE,35.67g·L~(-1) BE,15.08g·L~(-1) NH_4H_2PO_4,最终酒精得率为51.46%,原料利用率为94.8%。
参考文献：
[1]. 菊粉酶高产菌株的生物学特性研究[D]. 张瑞玲. 河北农业大学. 2004
[2]. 高产菊粉酶菌株的诱变选育及其酶的固定化[D]. 魏微. 南京农业大学. 2009
[3]. 产乳糖酶酵母菌株的遗传改良和乳糖酶的发酵生产[D]. 徐金利. 中国海洋大学. 2012
[4]. 一株高产酵母突变株菊糖酶的生产和酒精发酵的研究[D]. 郭宁. 中国海洋大学. 2009
[5]. 菊粉酶产生菌的选育及其酶学性质的初步研究[D]. 徐艳新. 江南大学. 2013
[6]. 菊芋发酵生产L-乳酸的研究[D]. 葛向阳. 江南大学. 2009
[7]. 防风固沙植物菊芋的酶降解机制研究[D]. 郑彦山. 辽宁工程技术大学. 2010
[8]. 海洋产黑色素短梗霉P16菌株产普鲁兰多糖的研究[D]. 马再超. 中国海洋大学. 2015
[9]. 海洋季也蒙毕赤酵母重组菊粉酶及其在产乙醇中的应用[D]. 张曈. 中国海洋大学. 2010
[10]. 以菊芋为原料的酒精发酵研究[D]. 张秀兰. 兰州理工大学. 2011
标签：一般化学工业论文; 菊粉论文; 水解论文; 乳糖酶论文; 普鲁兰多糖论文; 酒精发酵论文; 酒精浓度论文; 基因合成论文; 选择性培养基论文; 黑曲霉论文; 多糖论文;