姚鹏[1]2000年在《非水相中固定化脂肪酶催化酯合成反应的研究》文中提出针对对非水相酶催化过程的实验研究较多而理论探索不足等问题，以固定化脂肪酶催化酯合成反应为背景，运用实验方法和理论分析方法对影响酯化反应平衡和脂肪酶催化活力的各种因素进行了系统的研究。主要内容如下： 对用溶胶—凝胶包埋法制备固定化脂肪酶的方法进行了改进。与前人的制备方法相比，改进的方法可直接制得球形的固定化酶颗粒，而且颗粒的大小可以通过在制备过程中加入非离子型表面活性剂加以控制，从而可以提高固定化过程的酶活回收率和减小外扩散效应对酶的表观催化活力的影响；改进的方法还可以通过改变原料硅氧烷的种类及配比来改变最终制得的固定化载体的疏水性质及微观结构，从而通过对脂肪酶的“界面活化”作用和减小内扩散效应提高固定化脂肪酶的表观酯化活力。 以在有机溶剂中用游离或固定化猪胰脂肪酶催化的辛酸与辛醇的酯合成反应为研究对象，实验考察了体系中水含量和水活度对酯化反应平衡的影响，结果表明水活度能够更准确地反映出水对酯化反应的质量作用。实验考察了当改变体系中的加酶量、有机溶剂种类、固定化载体种类等条件时，体系中水的热力学活度对酶的催化活力的影响，结果表明这些因素通过影响水在体系各相间的分配影响酶的催化活力，在此基础上提出了较前人的分析方法更为简便易行的判断酶的催化构象是否改变的方法—“水活度法”。对有机溶剂通过争夺与酶蛋白结合的水分子而使酶失活的分子机理进行了理论分析，推导出预测体系水浓度或水活度及有机溶剂种类对酶催化活力影响的半经验公式，利用该公式成功地对本人和前人得到的实验结果进行了解释。 以在有机溶剂中用游离或固定化猪胰脂肪酶催化的辛酸与辛醇的酯合成反应为研究对象，将非水相酶催化过程中酶催化活力的变化与有机溶剂的性质参数进行了关联。结果发现有机溶剂的介电常数和偶极距与酶催化活力变化的关联程度很差，而表征有机溶剂疏水性的参数logS_(o/w)、logS_(w/o)、logP值以及E_T+DN值与上述变化的关联程度较好。通过对有机溶剂使酶失活的机理进行深入讨论，对在何种情况下使用有机溶剂的何种性质参数与酶催化活性的变化相关联提出了建议。通过对底物在相之间的分配过程以及在不同有机溶剂中的溶剂化过程的理论分析，推导出了预测有机溶剂对酶催化反应动力学参数影响的公式。北京化工大学博士学位论文 通过分析反应物和产物在不同相之间的分配过程以及在不同有机溶剂中的溶剂化过程，提出了预测有机溶剂对酷化反应平衡影响的方法一“分配系数法”和“活度系数法”。分别用“分配系数法”和“活度系数法”对有机溶剂种类对醋化反应平衡常数的影响进行了预测。使用前人的实验数据对预测结果进行了验证，在一定程度上证明两种方法都是有效的。对“分配系数法”和“活度系数法”的预测结果进行了比较，发现“活度系数法”的预测结果更为准确。关键词非水相;固定化脂肪酶;溶胶一凝胶法;酷合成反应;酶催化活力;水活度;有机溶剂:反应平衡;动力学参数一~，网...‘~......~，.......，月.....~，....，甲. .‘ 一11一
魏纪平[2]2003年在《脂肪酶的固定化及其非水相合成已酸乙酯的研究》文中研究表明为促进我国酶法生物技术的发展和提高非水相酶学研究水平，改善己酸乙酯的品质，本论文对脂肪酶的固定化、固定化脂肪酶催化己酸乙酯的反应过程、产物分离提纯进行了研究。 其主要内容如下： 一、对微生物脂肪酶在不同介质(水相、溶剂相、无溶剂体系)中转化进行比较证明：脂肪酶在有机溶剂中的酯化效果远高于在水相和无溶剂体系。同时，在对己酸乙酯的催化研究中表明：选择合适的脂肪酶酶源是反应的关键，并选出催化效果最好的Candida sp脂肪酶。 二、脂肪酶的固定化：研究了在有机溶剂中的脂肪酶的固定化。并确定了固定化脂肪酶的条件，如载体、有机溶剂、初水量、酶量、固定化时间等。固定化脂肪酶的回收率达到62％，且稳定性好，其半衰期为240h。 三、非水相固定化脂肪酶合成己酸乙酯：利用固定化脂肪酶在溶剂相中催化己酸和乙醇的合成反应。研究了反应体系中的含水量、溶剂、反应温度、加酶量、加入分子筛等因素对催化己酸乙酯反应的影响规律：含水量为0.4％、、温度30℃、加酶量0.5g，在环己烷溶剂中，经过8h的反应，加入1g分子筛，己酸乙酯的合成转化率可达86.69％。 四、己酸乙酯的提取：在比较了蒸馏产物分离方式的基础上，成功地用减压蒸馏提取出己酸乙酯。用红外光谱、气相色谱对样品检测，确定为己酸乙酯。对样品的品质分析的结果表明：其重金属离子砷和铅为ppm级，远远低于化学产品；其它品质均符合国家标准。
王宇新[3]2015年在《非水相脂肪酶催化糖酯合成的研究》文中研究说明糖酯是一种用途很广的非离子表面活性剂,具备无毒、易生物降解、亲水亲油平衡值范围广(1-16)等特性,兼具分散润滑、去污、起泡、调节粘度、抑制结晶、抗老化、抑菌性等作用,其应用遍及食品、医药和化妆品等多个行业。作为食品添加剂时,被联合国粮农组织(FAO)及世界卫生组织(WHO)推荐使用。相比于传统化学合成方法,酶催化合成糖酯具有众多优点,非常适合于食品添加剂的生产,因此开展非水相脂肪酶催化糖酯合成的研究意义重大。但如何能够同时溶解两种性质不同的底物,并最大程度上保持酶的活力一直是酶法合成糖酯的难题。本实验利用有机溶剂和底物本身组成了非水相脂肪酶催化合成糖酯的反应体系,最大程度上简化实验的复杂性,并验证了微波辐射-酶耦合催化合成糖酯的可行性,最后对非水相脂肪酶催化合成产品的表面性能进行了测定和比较。主要研究内容如下：(1)本文首先分别对三种脂肪酶的水解活性和酯化活性进行了测定,筛选出适于在非水相系统中合成糖酯的脂肪酶,最后确定了Novozym435脂肪酶为实验用脂肪酶。随后在叔丁醇、叔戊醇和丙酮三种有机溶剂中合成了月桂酸蔗糖酯,并对产品进行了薄层色谱(TLC)和红外光谱分析。薄层色谱显示产品中含有月桂酸蔗糖单酯和月桂蔗糖二酯。红外光谱(FT-IR)显示合成产品在1743cm-1处有明显的伸缩振动吸收峰,是酯键的特征吸收峰,证明反应合成了蔗糖酯。随后确立了月桂酸蔗糖酯的分离方法和实验材料的回收方法。(2)在非水相脂肪酶催化合成糖酯的实验中,用单因素实验了分别考察了反应体系、糖的种类、糖的添加量、反应温度、脂肪酶添加量分子筛添加量以及反应时间对糖酯转化率的影响规律。然后在单因素实验的基础上,优化了非水相脂肪酶催化糖酯合成的反应工艺,确立最佳反应工艺为：反应溶剂为叔丁醇,脂肪酶添加量为30g/L,月桂酸浓度为0.6mol/L,蔗糖添加量为0.085g/L,反应温度50℃,反应时间65h,分子筛添加量为50g/L。对脂肪酶的残余酶活进行了测定,在最优反应工艺下,经5次反应脂肪酶仍可保留62.5%的残余酶活。(3)以非水相脂肪酶合成月桂酸蔗糖酯的反应体系为依托,用微波加热法代替常规加热方法,用微波辐射-脂肪酶耦合的方法合成月桂酸蔗糖酯。用单因素实验,考察了微波功率、分子筛添加量和反应时间对糖酯转化率的影响。在单因素实验的基础上用正交实验优化了反应工艺,最佳反应工艺为：反应溶剂叔丁醇,月桂酸浓度0.6mol/L,蔗糖浓度0.08mol/L,脂肪酶添加量30g/L,分子筛添加量15g/L,功率200W,反应时间25min。三次反应后,残余酶活为52.4%。对产品进行了薄层色谱分析和红外光谱分析。(4)对非水相脂肪酶催化合成的月桂酸蔗糖酯的表面性能做了研究,并与市售食品级蔗糖酯进行了对比。酶法合成的月桂酸蔗糖酯的乳化性能和起泡性能均优于食品级蔗糖酯。
耿博[4]2012年在《脂肪酶催化合成乙酸肉桂酯的应用研究》文中研究说明本文以脂肪酶在酯类化合物合成中的应用为主要研究内容，对不同的酶促酯合成反应路线及反应体系进行了比较，提出了在无溶剂体系中进行转酯化反应合成乙酸肉桂酯的新思路，在保证高转化率的同时提高了酶的稳定性；通过交联酶聚体技术成功制备了无载体固定化脂肪酶，在将其应用于酯类香料的合成反应时取得了理想的效果。本文的主要结论如下：酶促直接酯化反应合成乙酸肉桂酯的研究：在有机溶剂体系中通过脂肪酶催化乙酸与肉桂醇直接酯化反应成功合成乙酸肉桂酯，通过对反应进行优化，得到最佳反应条件为：底物乙酸/肉桂醇摩尔比为5/4，15ml反应体系中酶加入量为30mg（4.5U），反应温度为30oC。在最佳反应条件下肉桂醇的转化率可以达到88%以上。通过对酶回收步骤的优化，使得固定化脂肪酶(Novozym435)在此体系下可以重复使用4次，转化率均在74%以上。酶促转酯化反应合成乙酸肉桂酯的研究：以乙酸乙酯为酰基供体，在无溶剂体系下实现了酶促转酯化反应合成乙酸肉桂酯。优化后的反应条件为：底物乙酸乙酯/肉桂醇摩尔比为15/1，酶加入量为2.67g·L-（1392U·L~(-1)）,反应温度为40oC，最终肉桂转化率为90.06%。在转酯化反应体系中，Novozym435在重复使用6次后活性仅下降5%。通过两种反应体系的对比发现，无论是在肉桂醇的转化率还是在固定化脂肪酶的可重复利用性上转酯化反应体系都具有较大的优势。脂肪酶CLEAs的制备及应用研究：以饱和硫酸铵为沉淀剂，80mM戊二醛为交联剂，经过6h交联反应后制得了南极假丝酵母脂肪酶CLEAs。经过无载体固定化后脂肪酶的热稳定性和pH稳定性与游离酶相比均有所提高。将脂肪酶CLEAs用于催化乙酸乙酯与肉桂醇转酯化合成乙酸肉桂酯的反应中，最终肉桂醇的转化率为84%，固定化酶在重复使用6次后残留活性为80%以上。脂肪酶催化转酯化合成乙酸肉桂酯动力学研究：建立了带有单底物醇抑制的Ping-Pong Bi-Bi反应模型，通过非线性拟合得到反应动力学参数：Vmax=41.807mmol·L~(-1)min~(-1)， KA=2.241mmol·L~(-1)， KB=206.82mmol·L~(-1)，KiB=0.461mmol·L~(-1)。
王艳[5]2013年在《中长链脂肪酸淀粉酯的酶法合成及其性质研究》文中研究说明中长链脂肪酸淀粉酯是一类新型的化学改性淀粉,因其具有较好的粘度、透明度、疏水性、乳化性、冻融稳定性、抗凝沉性和可生物降解性,它的合成现已成为变性淀粉工业中的一个新兴研究热点。但是在目前的研究中,中长链脂肪酸淀粉酯的合成主要采用化学法。由于化学法所需的极端pH值、高温高压高机械条件以及有机溶剂的加入,不仅造成了环境污染和能源浪费,同时危害到人体健康,因此大大限制了其发展与应用。所以,开展生物法合成中长链脂肪酸淀粉酯的研究,生产纯天然、绿色更适合应用于食品、医药以及精细化学品等行业的中长链脂肪酸改性淀粉具有十分重要的现实意义。目前主要在有机溶剂介质中进行酶催化法制备中长链脂肪酸淀粉酯,有机溶剂的使用不仅限制了产品的应用,同时也对酶的催化活性产生一定的抑制作用。发展至今,限制酶促中长链脂肪酸淀粉酯合成的关键问题主要包括：淀粉颗粒结构紧密、活性羟基深藏在分子内部、淀粉和中长链脂肪酸的极性相差较大不易混溶,这就使酶促酯化反应很难进行。为解决以上问题,本论文主要从淀粉的预处理活化、酶的筛选、酰化试剂的选择和反应体系的建立等方面进行深入研究。以天然玉米淀粉为原料,选用各种碳链长度的中长链脂肪酸为酰化剂,脂肪酶为催化剂,在无溶剂体系中进行中长链脂肪酸淀粉酯的绿色合成,并对处理淀粉和各中长链脂肪酸淀粉酯的理化性质进行分析。通过对酶促反应条件的优化、反应机理的探索和反应动力学模型的建立,以棕榈酸为例,揭示酶促玉米淀粉与中长链脂肪酸发生酯化反应所需的必要条件和一般规律。本研究所获得的实验数据不仅将补充和完善现有非水相体系酶催化反应理论,同时也为中长链脂肪酸淀粉酯的实际生产和应用提供一定的理论依据。主要研究内容和结论如下：1、玉米淀粉的预处理活化及对酶促酯化反应的影响。为解决原玉米淀粉颗粒结构紧密不易与中长链脂肪酸发生酯化反应的难题。用NaOH/尿素水溶液在低温条件下对玉米淀粉进行预处理。选择碳链长度适中、熔点在酶最适反应温度范围内的棕榈酸作为中长链脂肪酸的代表性底物,以酶催化预处理淀粉与棕榈酸发生酯化反应的酶促反应初速度和产物取代度为考察指标,获得玉米淀粉处理过程的重要参数值为：氢氧化钠/尿素水溶液的浓度为9%、氢氧化钠与尿素的质量比为2、氢氧化钠/尿素水溶液的预冷温度为-9℃、乙醇的添加量为50%。在此条件下淀粉的冷水溶解度高达96.42%,平均颗粒直径小于0.10μm,结晶度由原来的24.82%降低至10.32%,此时酶的催化反应速度最大(0.34mmol·h-1·mg-1)比催化原玉米淀粉发生酯化反应的速度高出4个数量级,并且棕榈酸预处理淀粉酯的取代度(0.82)明显高于原玉米淀粉酯(0.23×10-2)。原玉米淀粉经预处理后,使酶促酯化反应活性提高的机理在于：预处理后淀粉颗粒粒径越小酶活性中心对其的识别能力越强；结晶度越小活性羟基暴露的越完全,越易进入到酶周围的水化层与分布在水化层表面的棕榈酸发生酯化反应；从而使酶促酯合成的反应速度加快,产物取代度变大。2、甲醇醇解-气相色谱分析测定中长链脂肪酸淀粉酯取代度方法的建立。甲醇醇解-气相色谱分析测定取代度的方法分为两部分：其一,中长链脂肪酸淀粉酯的甲酯化,甲酯化的程度在取代度的测定中起到至关重要的作用。以棕榈酸淀粉酯为例对甲酯化的条件进行了优化,并以棕榈酸淀粉酯的测定值与真实值的拟合度为指标,获得最佳甲酯化条件为：甲醇用量2mL/30mg、甲醇钠用量8mg/30mg、甲酯化温度为70℃、甲酯化时间为40min；其二,脂肪酸甲酯在气相色谱仪中的定量测定,以棕榈酸淀粉酯为例,首先将棕榈酸甲酯的量转化成与淀粉发生酯化反应的棕榈酸的量,再通过公式计算出棕榈酸淀粉酯的取代度。该方法与广泛应用的皂化-滴定法相比,误差小、重复性好更适合用于中长链脂肪酸淀粉酯取代度的测定。3、以棕榈酸淀粉酯的酶催化合成为例,构建酶促中长链脂肪酸淀粉酯的合成体系。在所研究的脂肪酶中,Novozym435在非水相体系中表现出较高的催化预处理淀粉与棕榈酸发生酯化反应的催化活性。以棕榈酸为酯化剂,固定化脂肪酶Novozym435为催化剂,分别在无溶剂体系和微溶剂体系下进行预处理玉米淀粉与棕榈酸的酶促酯化反应。并以取代度和酶酯化比活力为指标考察不同反应体系中酶的催化反应活性。在微溶剂体系中,由于高极性有机溶剂夺取了脂肪酶周围的必须水,酶的刚性增强从而使酶酯化比活力下降,因此在无溶剂体系下可以获得取代度高达1.04的棕榈酸淀粉酯,而在微溶剂体系下只能获得取代度为0.72×10-2的棕榈酸淀粉酯。最终选定无溶剂体系作为Novozym435催化预处理玉米淀粉与中长链脂肪酸发生酯化反应的反应介质。4、无溶剂体系酶促中长链脂肪酸淀粉酯的合成。以平均粒径<0.10μm的预处理玉米淀粉为原料,不同碳链链长度的中长链脂肪酸(C8-C20)为酯化剂,固定化脂肪酶Novozym435为催化剂,在无溶剂体系下进行各中长链脂肪酸淀粉酯的合成。研究发现无溶剂体系中,固定化脂肪酶Novozym435对碳链长度在C8-C16之间的脂肪酸均具有很好的催化能力,酶的酯化比活力基本保持在1.30mmol·h-1·mg-1左右。5、以棕榈酸淀粉酯的酶催化反应合成为例,探讨无溶剂体系酶促中长链脂肪酸淀粉酯的合成机理。在无溶剂体系中,底物分子周围没有有机溶剂,因此不会对酶活力产生影响；同时在反应过程中酶与底物直接接触,无需去溶剂效应这一过程而使反应速度加快；通过控制反应体系的水活度不仅可以为脂肪酶提供发挥其催化活性所必需的水,同时也可以改变酶促反应的平衡,避免水解反应的发生。反应体系适度的水活度使固定化脂肪酶表面形成一层均匀连续的、厚度适宜的水化层。由于脂肪酶催化玉米淀粉与脂肪酸的酯化反应属于界面反应,水化层的连续性和厚度直接影响着底物在油水界面的分布和向脂肪酶活性中心的扩散；预处理淀粉分子上的羟基(亲水性)和棕榈酸上的羧基(疏水性)具有相反的极性,因而适宜比例的两底物可以有序地分布排列在固定化脂肪酶分子的表面；从而在酶分子表面形成水分子层和底物分子层的油水界面,这种水分子层和底物分子层的形成不仅有利于底物分子流动,同时油水界面的形成也为脂肪酶发挥其催化活性提供了必要条件；在对无溶剂体系脂肪酶催化玉米淀粉与棕榈酸酯化反应的反应进程研究中发现,反应速度出现两次突然加快的现象,第一次加速主要是由于底物最大程度的克服了体系中的外扩散和内扩散限制从而使酶促反应速度达到最大；而第二次加速是由于棕榈酸淀粉酯的生成和积累使其发挥了良好的表面活性剂效应,有利于脂肪酶周围油水界面的形成和底物的分布与排列。同时,棕榈酸淀粉酯具有疏水性有助于其生成后迅速脱离酶的催化活性中心,从脂肪酶表面的水化层逃离出来,从而促进酶促酯化反应的进行,避免水解反应的发生,提高酶催化酯化反应活性使反应速度突然加快。产物棕榈酸淀粉酯的HLB值和取代度对脂肪酶Novozym435的催化活性具有一定的影响,产物的HLB(亲水亲油平衡值)越小,取代度越高酶促反应的初速度越大,其对酶酯化活性的促进作用越强。6、以棕榈酸淀粉酯的酶催化反应合成为例,对无溶剂体系酶促预处理玉米淀粉与中长链脂肪酸发生酯化反应的动力学进行研究。对无溶剂体系中影响酶催化活性的条件进行优化,最佳条件为：底物摩尔比1：5；温度65℃；时间24h；酶用量5%；转速180r/min;初始水活度为0.57。在该反应条件下无底物扩散限制,因此可以采用底物摩尔数与反应初速度的关系对反应动力学模型进行推导。研究表明,无溶剂体系Novozym435催化预处理玉米淀粉与棕榈酸的酯化反应符合乒乓反应机制。反应动力学模型为V=(1.7350×Cfatty-acid×Cstarch)/(Cfatty-acid×Cstarch+0.0156×Cstarch+2.3947×Cfatty-acid)。酶促反应顺序为：酰基供体棕榈酸(A)首先与酶结合形成棕榈酸-酶复合体(EA),EA再转化成棕榈酸酰基-酶复合体(EI),此时释放H20(Q)。然后EI再与酰基受体预处理玉米淀粉形成另一个二元复合体(EIB),由于EIB不稳定,最终释放出棕榈酸淀粉酯(P)以及酶。7、预处理淀粉及各中长链脂肪酸淀粉酯理化性质分析。原玉米淀粉经NaOH/尿素水溶液处理后其冷水溶解度和淀粉乳的透明度、凝沉稳定性、冻融稳定性提高,但粘度下降。预处理淀粉经酯化改性后,使其具有良好的乳化性和乳化稳定性,且乳化效果明显好于明胶和蔗糖酯,但与单甘脂相似。同时进一步提高了淀粉乳的粘度、凝沉稳定性和冻融稳定性。与辛烯基琥珀酸淀粉酯和醋酸淀粉酯相比,低取代度中长链脂肪酸淀粉酯的乳化性和冻融稳定性要优于辛烯基琥珀酸淀粉酯和醋酸淀粉酯。且随取代度的升高,乳化性先增强而后降低到40%左右,而冻融稳定性则随取代度的升高而升高。在对中长链脂肪酸淀粉酯乳化性的评价中得出,随中长链脂肪酸淀粉酯质量浓度的增加其乳化性和乳状液稳定性增强；随乳化油量的增多,乳状液稳定性下降；贮存温度越高,乳状液越不稳定；中长链脂肪酸淀粉酯乳状液具有降低油-水界面张力的能力,并随其质量浓度的升高而升高。但在不同油水界面产生的界面压力不同,经实验发现在橄榄油-水界面产生的界面压比在大豆油-水中产生的界面压大。
高红霞[6]2008年在《应用苯基硼酸酶法合成糖酯》文中提出糖酯是一类用可再生资源合成的、无毒、易生物降解的非离子型表面活性剂,目前已经广泛应用于食品、医药和化妆品等行业,并且可以通过调控脂肪酸和糖的种类以及酰化的程度来合成不同HLB值的糖酯。本文针对目前酶法合成糖酯过程中糖在有机溶剂中溶解度低和产物纯度不够高的问题,以葡萄糖月桂酸酯为典型产品,对苯基硼酸在糖酯合成过程中的作用进行了研究。首先对苯基硼酸在糖酯合成的影响过程进行了深入的研究。苯基硼酸的加入明显提高了葡萄糖的溶解度和反应的专一性:在最佳参数葡萄糖/苯基硼酸为1:2(mol/mol)时,葡萄糖在叔丁醇中的溶解度大约提高了2倍,且反应中只有葡萄糖月桂酸单酯生成;糖的溶解度增加以后,成酯反应初期的反应速率提高了一倍,可望显著缩短反应时间;苯基硼酸的引入对单糖和中等链长脂肪酸的酯化率提高有显著效果,对二糖和长链脂肪酸酯化率的提高影响较小。其次对苯基硼酸增溶条件下酶法合成葡萄糖月桂酸酯的间歇生产工艺进行了优化。通过单因素实验,确定了间歇反应最佳工艺条件:葡萄糖50 mol/L,葡萄糖:苯基硼酸为1:2(mol/mol),酸醇摩尔比为3:1,脂肪酶添加量为20 g/L,分子筛添加量为100 g/L,反应温度为50℃,反应溶剂为叔丁醇,反应时间24 h。在以上条件下,葡萄糖月桂酸酯转化率最高为90.1%。研究了苯基硼酸存在条件下,葡萄糖月桂酸酯合成的连续化工艺:溶剂为叔丁醇,1,2:3,5-葡萄糖苯基硼酸酯50 mmol/L,月桂酸150 mmol/L,脂肪酶10g,分子筛5 g,每天更换分子筛5 g,流速为0.2 mL/min。本反应器的产量可以达到12.4 g/(L·d),葡萄糖的转化率为59.2%,葡萄糖酯的产量大大高于间歇式生产。研究了产物的分离纯化方法,利用正己烷对产物进行三次洗涤、离心处理,得到的产物葡萄糖月桂酸酯纯度达到89.46%。在此基础上设计了适合工业生产的工艺流程。采用Karl Fischer滴定法测定了反应体系中不同反应阶段的水分平衡浓度,估算了表观平衡常数。通过Karl Fischer滴定法制定了叔丁醇中3A分子筛的脱水等温线。利用反应过程中水分的质量物料平衡以及物质守恒定律,建立了理论预测葡萄糖酯平衡转化率的数学模型。验证了苯基硼酸存在时,叔丁醇溶剂中脂肪酶催化合成葡萄糖月桂酸单酯的预测模型的正确性。除分子筛过量和酸醇摩尔比高的情况外,葡萄糖月桂酸单酯的理论预测平衡转化率与实验值非常吻合。
戈钧[7]2009年在《脂肪酶纳米凝胶及其非水相催化合成有机化学品的研究》文中认为酶的修饰及稳定化对于实现非水相酶催化,将生物催化的高效率、高选择性和环境友好等优势应用于现代化学品的生产具有重要的基础意义。本文首先综述了非水相酶催化的研究进展,然后通过水相原位聚合制备了脂肪酶纳米凝胶,并将脂肪酶纳米凝胶应用于在有机相中合成葡聚糖基表面活性剂、在无溶剂条件下合成聚酯以及在油水两相体系中制备生物柴油等典型的非水相酶催化过程,综合运用多种结构分析表征手段以及分子模拟研究了脂肪酶纳米凝胶及其耐受有机溶剂和高温的微观机制,为其工业应用提供理论基础。采用水相原位聚合制备出平均直径为25 nm的脂肪酶(Candida rugosa lipase)纳米凝胶,其水解活性为天然酶的85%。分子模拟、动态光散射与荧光探针等分析结果表明,单体与酶分子通过氢键相互作用形成组装结构是制备酶纳米凝胶的基础;凝胶与酶分子间的多点共价连接大幅提高了酶的热稳定性及其在二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇等亲水性有机溶剂中的稳定性。研究了脂肪酶纳米凝胶在无水二甲基亚砜(DMSO)这一有机合成常用溶剂中的稳定性及稳定机理,并将其用于催化合成葡聚糖基表面活性剂。结果显示,在10天的反应过程中,脂肪酶纳米凝胶在60 oC无水DMSO中的活性保持不变,选择性酯化糖单元2-位的羟基;合成的葡聚糖基表面活性剂可自组装成为球型胶束并用于包埋蛋白质和小分子,而脂肪酶水解酯键可以破坏胶束释放蛋白质及小分子,该类型胶束可望发展成为新型的药物控制释放系统。采用脂肪酶纳米凝胶在95 oC,真空度小于10 mmHg条件下催化1,4-丁二酸和1,4-丁二醇缩聚合成聚丁二酸丁二醇酯(PBS),产物PBS的数均分子量为1820 g/mol,重均分子量为1900 g/mol,熔点为107.2 oC。考察了单体种类、反应物组成、溶剂等对反应的影响,初步显示出脂肪酶纳米凝胶在无溶剂条件下催化合成聚酯材料的应用前景。制备了脂肪酶(NS81006)纳米凝胶并研究了其应用于油水两相体系催化大豆油甲醇解制备生物柴油的可行性。在55 oC下,脂肪酶纳米凝胶催化该过程稳定进行的时间为天然脂肪酶的2.5倍,甲醇耐受性显著提高。
肖弥彰[8]2006年在《高产脂肪酶菌种选育与脂肪酶催化合成生物柴油》文中研究表明本研究筛选了高产脂肪酶的菌种，并探讨其应用，意在提高酶的使用次数，降低其成本，并探索该酶在转化菜油时的催化特性。研究内容和结果如下：1．从被油污染的土壤中分离微生物，通过油脂同化平板筛选产胞外脂肪酶菌株；诱变育种获得的部分菌株的发酵能力比原始出发菌株提高十倍以上；按照微生物分类学方法菌株被初步鉴定为假丝酵母、芽孢杆菌、米曲霉、假单孢杆菌。2．对于上述四个高产脂肪酶的菌种的培养条件进行优化；将正常生长的菌种约十万株接种到50mL培养基中发酵一天(45℃)，二十次试验中七次的发酵能力都高于10.8IU／mL(相当于国内文献报道数据11.4IU／mL的95％)；其中5次的发酵能力超过国内文献报道数据的5％。3．对高产脂肪酶的菌种进行了分子生物学研究，测得其序列，证明为新发现菌种。4．通过盐析与层析等方法纯化发酵液中的脂肪酶。对于假丝酵母所产脂肪酶，凝胶材料HNO-E最合适；芽孢杆菌所产脂肪酶，凝胶材料HNO-E、HNO-A、HNO-B的分离效能比较好；米曲霉菌所产脂肪酶，HNO-A的分离效能最强；假单孢杆菌所产脂肪酶，凝胶材料HNO-E的分离效能最强。5．探索合适的脂肪酶载体，并通过数学模型阐述了多种蛋白对于载体的吸附位点的竞争机制；得到的固定化脂肪酶易于在固定床和流化床反应器中使用，性能接近脂肪酶Lipozyme~(IM)。6．对于各种微生物所产脂肪酶，固定化最合适的条件是：每克载体的给酶量为500U；温度为30℃；pH8.0；固定化时间为120min，载体是硅藻土。7．应用发酵生产的脂肪酶将菜籽油转化成了生物柴油；最佳条件为：油／甲醇的摩尔比为1／3、反应温度为40～50℃、固定化酶用量5％(wt)。分段添加甲醇进行反应利于保持固定化脂肪酶的活力；油脂组成影响反应转化率；来自假丝酵母等的脂肪酶对于油酸具有一定的底物特异性，原料中各脂肪酸酰基被转化(与醇氧基结合)的先后顺序为C_(12：0)、C_(14：0)＞C_(16：0)、C_(18：0)＞C_(18：1)＞C_(18：2)、C_(18：3)。分析了液体发酵产脂肪酶进程与催化进程的联系；有机相酯交换催化酶活和水相水解酶活相关性不高，酯交换酶活与水解酶活出现高峰时间不一致，原因是测定脂肪酶的反应条件及反应动力学不相同；液体发酵产脂肪酶进程中水解酶活高峰的出现先于催化酯交换酶活高峰12h。本研究取得如下创新：1．筛选得到了高产脂肪酶的四个菌株，并且优化了微生物的培养条件。2．对高产脂肪酶的菌种进行了基因序列分析，证明为新发现菌种3．证明了发酵脂肪酶适合转化油酸含量中等的菜籽油成为生物柴油；并且获得了良好的生产效果。4．通过数学模型阐述了多种蛋白对于载体的吸附位点的竞争机制；对催化反应动力学方程进行了推导。
张秋华[9]2012年在《非水相脂肪酶的筛选及其在维生素C棕榈酸酯合成中的应用》文中研究表明脂肪酶是一种酯键水解酶，它们能催化天然底物油脂(甘油三酯)水解，产生脂肪酸和甘油。脂肪酶在有机相中可催化的反应主要有：酯合成、酯交换、肽合成、酯聚合、酰化等。利用脂肪酶在有机相催化的各种反应可以合成许多高价值产品。由于并不是所有的脂肪酶都能催化非水相中的酯化反应，造成了现有脂肪酶中能有效催化酯合成反应的酶并不多，开发新的具有高酯合成活性的脂肪酶成为人们研究的热点。维生素C作为一种水溶性抗氧化剂，在食品加工中做抗氧化剂以保存食品价值。但是其水溶性及不稳定性限制了它在油脂及化妆品行业的应用。因此，利用脂肪酶将维生素C转化成脂溶性的脂肪酸酯以提高其价值具有重要的意义。本论文主要从脂肪酶产生菌的筛选、菌株的鉴定、发酵条件的优化、脂肪酶在有机相中的催化等几方面进行了研究。本论文首先建立了维生素C棕榈酸酯的高效液相色谱分析方法，从实验室保藏的产脂肪酶菌株进行筛选实验，筛选到能催化酯化维生素C的菌株2株。分别为基因工程菌C. antarctica ZJB09193和野生菌A113，其中C. antarctica ZJB09193能高效催化酯化反应合成维生素C棕榈酸酯。通过对野生菌A113进行了菌种鉴定包括形态学、生理生化实验、18S rDNA、系统发育树分析，确定该菌株为Yarrowia lipolytica。随后，对筛选到的Yarrowia lipolytica菌株液体摇瓶产脂肪酶的条件进行了优化。确定其最适产酶条件为：橄榄油10g/L，豆粉40g/L，MgSO_47H_2O1g/L，K_2HPO_45g/L，接种量5%，pH6.0，28℃发酵55h后酶活达到最高。利用已经报道的上罐培养基配方对Candida antarcticZJB09193进行了15L (5.5L基础培养基)上罐发酵的培养条件优化，确定通气量10L/min，搅拌速度为800r/min，初始pH5.5，接种量10%，诱导剂量3500mL可以达到较高的产酶量。最后，对固定化的CALB在维生素C棕榈酸酯合成中的应用进行了研究。确定最佳反应条件为：丙酮作溶剂10mL；反应温度，50℃；摇床转速，180r/min；维生素C，0.1056g；酶量，1.2g；摩尔比，1:7；水含量，2%；反应时间24h，最终转化率约86%。其动力学研究表明Km为100.49mmol/L，Vm为3.96mol/min。
卢志洪[10]2012年在《全细胞促阿糖胞苷区域选择性酯合成反应的研究》文中研究说明阿糖胞苷是治疗白血病的常用化疗药物之一。但临床研究发现，阿糖胞苷在血浆中易被脱氨酶降解失活而导致半衰期短，且其亲水性强不易穿膜运输故对实体肿瘤疗效欠佳。而通过酯合成反应，选择性酰化阿糖胞苷糖环上的某个羟基可提高核苷的脂溶性，所制备的阿糖胞苷单酯衍生物已被证明具有较之母药更高的抗癌活性。为克服化学制备方法环境不友好、选择性差、副产物多等缺点，自上个世纪末人们开始研究利用酶法进行核苷单酯的合成。然而，尽管酶法合成具有区域选择性高、反应条件温和、环境友好等优点，其在工业应用上却遭遇成本高、催化剂稳定性差等诸多瓶颈问题。全细胞是生物催化剂的一种，作为酶的天然载体，可以省去酶分离纯化及固定化等步骤，从而大大地降低生产成本。此外，整细胞可为酶提供良好的环境，使酶不至于在非水介质中快速失活。然而，迄今为止，利用高区域选择性微生物全细胞催化阿糖胞苷5'-单酯的合成的研究尚未见报道。鉴于上述研究现状，本论文探讨了不同来源微生物细胞在有机介质中催化阿糖胞苷酯合成反应的可行性；以阿糖胞苷酯合成反应为模型，研究了培养条件对微生物细胞生长及其酶合成活性的影响规律；对比分析了不同种类微生物细胞在有机介质中催化该反应的活性及区域选择性，考察了反应条件对不同种类微生物细胞在该反应中的催化特性及稳定性的影响规律；并建立起适合微生物细胞酯合成活性酶生产的最佳培养条件及适合阿糖胞苷单酯合成的最佳反应体系。在对5种不同假单胞菌属菌株促核苷酯合成活性的研究中发现，荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens催化活性最强，其催化反应的优势产物为阿糖胞苷5′-单酯；与假单胞菌等细菌细胞相比较，所研究的真菌类细胞中米曲霉Aspergillus oryzae具有更高的反应活性，但其区域选择性较低且以3′-单酯为优势产物。在培养条件对荧光假单胞菌合成活性影响的研究中发现，采用混合碳源，即往含有酵母膏的基础培养基中额外补充脂类物质，尤其是大豆油，能明显提高荧光假单胞菌全细胞催化阿糖胞苷酰化反应的活性。然而，当往基础培养基中补充葡萄糖时，获得的生物量和催化活性都很低。综合考虑反应产率和5'-区域选择性，在所考察的各种有机氮源中，酵母膏为最适氮源。由于碳氮源浓度、金属离子浓度和培养时间都是影响培养所得全细胞催化行为的重要因素，我们研究了这些因素对荧光假单胞菌生物量及其全细胞催化行为的影响。结果表明，最适大豆油浓度、酵母膏浓度、Mg2+离子浓度，培养时间分别为0.5%(w/v),0.1%(w/v)，0.05%(w/v)和48小时。在此条件下，荧光假单胞菌全细胞促阿糖胞苷与乙酸乙烯酯酰化在反应120小时后的产率和5'-区域选择性分别为75.4%和96.8%。在对反应条件中的优化中发现：与纯吡啶相比，荧光假单胞菌全细胞在含部分疏水性有机溶剂组成的混合溶剂中有更高的催化效率。荧光假单胞菌细胞促阿糖胞苷与乙酸乙烯酯区域选择性酰化反应的最适混合介质、催化剂用量、酰基供体与阿糖胞苷的摩尔比、反应温度和振荡速度分别为30%正己烷-吡啶、50mg/mL、30:1、30℃和140rpm；在上述最优条件下，反应初速度和产率分别为1.6mmol/L·h和83.1％。当酰基供体为丙酸乙烯酯时，各反应条件对荧光假单胞菌细胞促反应的影响规律与乙酸乙烯酯为供体时相似，只是在最适反应介质、酰基供体与阿糖胞苷的摩尔比上略有不同，在最适条件下，阿糖胞苷丙酰化反应的初速度和产率分别为2.8mmol/L·h和77.9%。各因素对荧光假单胞菌细胞促阿糖胞苷酰化反应区域选择性的影响甚微，5'-区域选择性始终在>92%。通过研究米曲霉细胞催化阿糖胞苷与丙酸乙烯酯的酰化反应发现，与荧光假单胞菌全细胞相比，米曲霉全细胞更倾向于合成阿糖胞苷3'-酯。该反应的初速度和产率与混合溶剂的极性密切相关。该反应的最适混合介质、丙酸乙烯酯和阿糖胞苷摩尔比、全细胞催化剂用量、反应温度和振荡速度分别为30%（v/v）异丙醚-吡啶、90:1、60mg/mL、30℃、180rpm。在上述反应条件下，反应初速度和产率分别是10.7mmol/L·h和88.3%。水分含量和反应温度对米曲霉细胞促阿糖胞苷丙酰化的区域选择性存在较大影响，其他因素的改变对区域选择性影响不大。本研究不仅拓宽了生物催化核苷区域选择性酰化的范围，丰富了全细胞在非水介质中催化核苷酯合成的理论知识，还为阿糖胞苷单酯的工业化制备提供了新路径。
参考文献：
[1]. 非水相中固定化脂肪酶催化酯合成反应的研究[D]. 姚鹏. 北京化工大学. 2000
[2]. 脂肪酶的固定化及其非水相合成已酸乙酯的研究[D]. 魏纪平. 天津科技大学. 2003
[3]. 非水相脂肪酶催化糖酯合成的研究[D]. 王宇新. 哈尔滨商业大学. 2015
[4]. 脂肪酶催化合成乙酸肉桂酯的应用研究[D]. 耿博. 天津大学. 2012
[5]. 中长链脂肪酸淀粉酯的酶法合成及其性质研究[D]. 王艳. 哈尔滨商业大学. 2013
[6]. 应用苯基硼酸酶法合成糖酯[D]. 高红霞. 江南大学. 2008
[7]. 脂肪酶纳米凝胶及其非水相催化合成有机化学品的研究[D]. 戈钧. 清华大学. 2009
[8]. 高产脂肪酶菌种选育与脂肪酶催化合成生物柴油[D]. 肖弥彰. 湖南农业大学. 2006
[9]. 非水相脂肪酶的筛选及其在维生素C棕榈酸酯合成中的应用[D]. 张秋华. 浙江工业大学. 2012
[10]. 全细胞促阿糖胞苷区域选择性酯合成反应的研究[D]. 卢志洪. 华南理工大学. 2012
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