1、河南省虞城县高级中学高三13班；2、四川省人民医院
摘要：目的 探讨一个中国视网膜色素变性-感音神经性耳聋综合征家系的致病基因及其突变位点。方法 在签署知情同意书后，对该家系先证者及父母进行病史收集、常规查体、视野检查及视网膜电图检查。采集家系成员静脉血，提取基因组DNA、全外显子组测序、生物信息数据分析和Sanger测序验证突变位点。结果 该家系有1例患者，表现为青少年时期发病，视野渐进性变窄，周边视力受损，听力受损，耳聋，视网膜现色素沉着，mfERG显示a波、b波振幅下降。患者父母均正常，为杂合突变携带者，符合常染色体隐性遗传模式特征。外显子组测序、数据过滤和Sanger测序验证发现在MYO7A基因上存在两个突变位点：NM_001127180， c.3695_3705del， p.R1232fs和NM_001127180，c.6234＋5 G>A。在1000例健康人对照中没有发现该两个突变。结论 本研究发现MYO7A致病基因上两个新的突变位点，扩大了MYO7A致病突变谱，为临床诊治提供了新靶点。
关键词：视网膜色素变性-感音神经性耳聋综合征；全外显子组测序；常染色体隐性遗传；MYO7A基因
视网膜色素变性-感音神经性耳聋综合征1型（Usher I）是一类以渐进性视网膜色素变性、视力受损、先天性耳聋为之一表现的常染色体隐性遗传性疾病，具较强遗传异质性， 以其发现者英国眼科医生Charles Usher命名。Usher综合征在美国和欧洲的发病率约为4.4/100，000[1]，中国的发病率约为0.03%[2]。眼科症状临床上表现为夜盲，暗光线下视力障碍，行走困难，伴视力渐进性丧失，视野缩小，直至管状／隧道状视野。患者晚期视锥细胞受累病变、死亡，中央视力丧失、失明[3]。耳科症状表现为先天性双耳感音神经性聋，步态不稳。
Usher综合征为常染色体隐性遗传单基因遗传病。目前已克隆了发表率最高的亚型Usher IB疾病基因MYO7A 和USH2A[4，5]。
迄今为止Usher综合征疾病尚无有效药物或手术等治疗干预方法，对病人服务仍以咨询或对症治疗为主。治疗干预乏力的原因在于对该病的病因和病理机制缺乏深入系统的研究[6，7]。本研究通过全外显子组测序，在一个2代3人的Usher综合征家系中找到两个MYO7A基因新的复合杂合突变位点，研究结果报告如下。
1 对象与方法
1. 1 临床资料收集
一个中国汉族北方地区Usher综合征家系，2代共3人，其中1人为患者。本研究经四川省人民医院医学伦理委员会同意，对患者进行知情告知并签署知情同意书。
检测项目及诊断标准：
眼科检查：眼底检查。视网膜功能检查：视野、多焦视网膜电图(mfERG)。
患者现25岁，诊断为视网膜色素变性疾病，12岁表现有夜盲，现视野狭窄。眼底检查发现视盘呈蜡黄色萎缩。视觉电生理ERG电位反应低。
1. 2基因组DNA制备
采集家系成员外周静脉血5 ml，QIAGEN基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。-20℃分装保存。
1. 3 全外显子组测序
先证患者DNA样本超声断裂，纯化后两端加上序列通用接头构建文库，文库加载到测序芯片Flowcell上，进行外显子测序分析。测序覆盖20784个基因和201121个外显子。原始数据由Illumina base calling Software 1.7分析组装。
1. 4 测序数据分析
将测序获得的variants进行过滤后，剩余的variants再经dbSNP137数据库、1000 Genome project数据库、YH数据库、HapMap Project、Broad Exac数据库进行进一步过滤，去除非致病基因。得到的variants经预测软件SIFT和Polyphen2分析，评估突变位点引起的氨基酸改变对蛋白功能的影响，得到候选突变位点。
1.5 致病基因家系样本测序验证
对上述可能的致病基因突变位点，设计引物，Sanger测序在3个家系成员中进行测序验证。
2 结果
2. 1患者临床表现
先证者先天耳聋。12岁表现有夜盲，现视野狭窄（图1）。眼底检查发现视视网膜游色素沉着，视觉电生理ERG电位反应低（图1）。mfERG显示视网膜周边区域a，b波降低（图1）。该家系共有成员3名， 父母2人，子女1名。其中，父母均正常，无视网膜色素变性疾病的临床特征，儿子为先证者。遗传模式为常染色体隐性遗传。家系图见图2。
图2. 家系图和Sanger 测序结果。方形表示男性，圆形表示女性，黑色表示为患者，M1： NM_001127180，c.6234+5 G>A；M2： NM_001127180， c.3695_3705del。
2. 2外显子测序数据分析
对患者进行全外显子组测序，平均测序深度为58×。编码区发现了20325个SNP位点及401和426个编码Indels。重点对非同义突变位点、剪接位点突变，插入和缺失移码突变位点进行分析，并过滤dbSNP137数据库、1000 Genome Project数据库、HapMap project数据库、 Broad Exacdatabase数据库、炎黄基因组数据库中存在的突变位点。此家系为常染色体隐性遗传模式，致病突变位点可为纯合突变或复合杂合突变。上述筛选步骤后还剩下25个编码区variants。此家系中候选基因MYO7A 移码突变NM_001127180， c.3695_3705del， p.R1232fs和变异性剪切位点NM_001127180，c.6234+5 G>A符合此家系遗传模式，是该家系候选致病基因。
2. 3MYO7A突变位点验证
为了验证MYO7A 移码突变 c.3695_3705del， p.R1232fs和变异性剪切位点NM_001127180，c.6234+5 G>A是该家系的致病基因突变，我们设计了扩增该突变位点的PCR引物，用于扩增突变位点上下游300 bp的靶序列。扩增产物电泳纯化后Sangar测序，对DNA样本进行测序分析。测序结果与人类基因组参考序列进行比对，发现患者携带复合杂合突变c.3695_3705del， p.R1232fs和变异性剪切位点NM_001127180，c.6234+5 G>A，而其父携带有变异性剪切位点NM_001127180，chr11：76922982，其母携带移码突变 c.3695_3705del， p.R1232fs（见图2）。验证结果符合常染色体隐性遗传模式。
进一步在1000例正常对照样本中进行此两个突变位点验证，未发现有任一突变位点。两个突变均导致移码突变，截断的MYO7A蛋白，严重影响蛋白功能。因此，MYO7A基因复合杂合突变c.3695_3705del， p.R1232fs和变异性剪切位点NM_001127180，chr11：76922982是造成该家系Usher综合征的遗传学病因。
3 讨论
本研究通过全外显子组测序技术分析了一个中国汉族Usher综合征的家系，发现MYO7A基因复合杂合突变c.3695_3705del， p.R1232fs和变异性剪切位点NM_001127180，c.6234+5 G>A。此两个突变均导致移码突变， MYO7A蛋白被截短（图3）。
图3. 本研究鉴定的两个突变在MYO7A基因上的位置示意图。
MYO7A基因编码含49个外显子的mRNA，已有多个已知突变位点被鉴定[8]。但使用Sanger测序法对49个外显子进行逐一测序筛选效率低下，花费较大。我们选用高通量的二代测序技术（next generation sequencing，NGS）对患者DNA样本做全外显子组测序，以筛选致病突变。二代测序技术能够以较低的费用快速分析人类基因组编码区域，已经广泛用于遗传性眼科疾病研究中[9]。二代测序技术用于视网膜色素变性疾病的研究目前在国内外已经比较多见，比如最近报道的SLC7A14[10]及10q22.1上的新RP致病基因[11]等，都是通过二代测序技术鉴定出来的新的视网膜色素变性致病基因或位点。相信通过此技术，越来越多的视网膜色素变性致病基因将被鉴定出来，为临床的诊断和治疗提供理论基础。
本研究报道了一个中国汉族人Usher综合征疾病家系，运用全外显子组测序技术发现了MYO7A基因复合杂合突变NM_001127180，c.6234+5 G>A和c.3695_3705del， p.R1232fs。此两个位点在该家系中与疾病共分离，是该家系的遗传学病因。本研究丰富了MYO7A的致病突变谱，为该病的遗传筛查和分子诊断提供了依据。
参考文献：
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论文作者:王佳盟,马誓,成静,石毅,朱献军
论文发表刊物:《健康世界》2017年第4期
论文发表时间:2017/4/25
标签：突变论文; 家系论文; 位点论文; 视网膜论文; 基因论文; 综合征论文; 色素论文; 《健康世界》2017年第4期论文;