（1.河北省迁安市人民医院乳腺肿瘤外科）；
（2.河北省迁安市人民医院重症医学科）；
（3.河北省迁安市人民医院神经外科 河北 唐山 064400）
【摘 要】目的：观察不同浓度一氧化碳中毒大鼠海马区脑红蛋白表达变化。方法：雄性SD大鼠150只，随机分为3组，分别是：正常对照组（A组）、持续5%浓度一氧化碳中毒组（B组），间断低浓度5%一氧化碳组（C组）持续1、5、7、14、21d，每组50只，于相应时间点处死，采取免疫组化染色结合阳性细胞记数的方法观察各组大鼠海马区脑细胞脑红蛋白的表达的变化，对所得数据进行统计学分析。结果：与正常对照组相比，其它两组大鼠海马脑红蛋白阳性神经元数目明显增加，差异有统计学意义(P<0.O1)；其中B组脑红蛋白阳性神经元数目在5d最高，与C组相比差异有统计学意义(P<0.O5)。C组脑红蛋白阳性神经元数目仅在第1d增多(P<0.O5)。结论：脑红蛋白表达可能对急性一氧化碳中毒大鼠海马区神经元细胞起保护作用。
【关键词】一氧化碳中毒；脑红蛋白；免疫组化
【中图分类号】R749.6+3 【文献标识码】B 【文章编号】1003-5028（2015）7-0271-02
The effect of Different concentration of CO on the expression of neuroglobin protein of the brain hippocampus in rats
zhao xin-hua1,mu yong-mao2, wang min2, wang yan-li2,li jian-min3,zhang qian-jin3
1 Department of surgical oncology in breastof qianan people’s hospital,
Tangshan 064400，Hebei Province,China;2Intensive Care Unit of qianan people’s hospital.Tangshan 064400,Habei Province,China;3Neurosurgery of qianan people’s hospital,Tangshan 064400,Hebei Province,China
【Abstract】Objective: To observe the effect of different concentration of CO on the expression of neuroglobin protein of the brain hippocampus in rats。Methods: 150 SD male rats were randomly divided into 3 groups: Normal Control Group (Group A),rats were given sustained 5% concentration carbon monoxide (Group B)or intermittent 5% concentration carbon monoxide (Group C) for 1、5、7、14、21ds, 50 rats per group ,They were killed at the corresponding time points.Immunohistochemistry coupled with computer-assisted image analysis were used to observe the changes of NGB protein expression.Statistical analysis was performed on the data.Results: Compared with nomal group，The number of positive neurons in rat hippocampus neuroglobin of others groups were significantly increas-ed. which had significant difference (P<0.01); In which,The number of positive neurons in rat hippocampus neuroglobin of B group increased reached maximal at 5d, compared with the group C had significant difference (P<0.05). The number of positive neurons in rat hippocampus neuroglobin of C group increased only at 1d.Conclusion: Neuroglobin expression may be play a protective role on hippocampus neurons in rats after acute carbon monoxide poisoning.
【Key words】carbon monoxide poisoning;neuroglobin; Immunohistoche-mistry.
一氧化碳中毒(carbon monoxide poisoning)经治疗清醒后经过一段“假愈期”后再次出现一组以痴呆为主的神经精神症状称为急性CO中毒迟发性脑病（DEACMP），是急性CO中毒后最严重的并发症之一。脑红蛋白(neuroglobin，NGB)是体内第三类重要的携氧蛋白，主要在脑组织中表达，在缺血缺氧性损伤中对神经元的保护作用。本研究拟通过观察不同浓度一氧化碳中毒引起大鼠海马区脑红蛋白表达变化，为一氧化碳中毒的临床防治提供佐证。
1 资料与方法
1.1实验动物和试剂
雄性成年SD大鼠150只，体重240～280g。由河北联合大学实验动物中心提供。动物实验用高压氧舱购自北京中兵救援装备有限公司；NGB多克隆抗体由军事医学科学院二所制备并纯化，辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗兔IgG为迈新生物科技有限公司产品，其余试剂为进口和国产分析纯。CO气体(10%)购自北京康福气体公司。
1.2动物模型及标本制备
将60只健康SD大鼠随机分为3组，分别是：正常对照组（A组）、持续5%浓度一氧化碳中毒组（B组），间断低浓度5%一氧化碳组（C组）每组20只，将B、C组大鼠分别放入动物实验用高压氧舱内，密闭舱门，B、C组经进气口给予5%CO气体，B组持续给予5%CO气体，C组每30min放气1h，然后再次给予5%CO气体，持续1、5、7、14、21d，于相应时间点处死。
1.3血HbCO浓度测定方法
于相应时间点处死动物前，取大鼠尾血0.11ml加0.14mol/L氢氧化铵20ml，混匀，加20mg低亚硫酸钠混匀；10min内于535nm及578nm波长下测定其吸光度，按照下列公式计算HbCO含量(%)：
HbCO(%)=(2.44×A535/A578–2.68)×100%
1.4标本制备
实验动物于相应时间点处死。以3％的水合氯醛麻醉后，经心脏灌注生理盐水200ml后，再用10％的多聚甲醛溶液、1％戊二醛的混合液100～200ml灌注固定，整个灌注时间不超过6min。1h后取脑组织，每个标本的大脑海马区各切取1.0mm×1.0mm×1.0mm组织块，放入10％多聚甲醛溶液中固定4～6h，固定后的组织经脱水、浸蜡、包埋后制成石蜡块。于前囟后方进行连续冠状切片，片厚5μｍ，进行免疫组织化学染色。
免疫组化染色：采用SP法（试剂盒为迈新生物科技有限公司产品）一抗为NGB兔抗大鼠多克隆抗体（1:100），二抗为辣根过氧化物酶标记的大鼠抗兔IgG(1:400,迈新生物科技有限公司产品)。石蜡切片常规脱蜡至水，置于体积分数为0.03的H2O2甲醛溶液中15min，磷酸盐缓冲液洗5min；浸入0.01mol/l PH 6.0枸橼酸盐缓冲液中，加热至98℃ 20min(进行抗原修复)，室温冷却30min，磷酸盐缓冲液洗5min；加正常山羊血清封闭液37℃孵育30min，滴加一抗（1：100稀释，兔抗大鼠NGB多克隆抗体）4℃孵育过夜；磷酸盐缓冲液洗5min×3，加入HRP标记链酶卵白素工作液37℃孵育30min；磷酸盐缓冲液洗5min×3， 二氨基联苯胺显色10min.苏木精复染，脱水，透明，封片后显微镜下观察。
1.5图像分析
每个脑组织样本选取5张切片进行图像分析。在光学显微镜（Olympus/BX41）下分别选取海马区域进行照相，每个区域选择4个不同视野（×200），各切片选择视野位置保持一致。将照片输入计算机后，采用ImageJ软件计算出每张照片中的阳性细胞数目。
1.6统计学分析方法
实验数据建立EXCEL数据库，资料用SPSS17.0来处理。各组数据经过Shapiro-Wilk正态性检验和Bartlett方差齐次检验后，利用单因素方差分析（ANOVA）比较各组之间的差异。实验数据以均数±标准差(±s)表示，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 染毒后实验动物活动情况观察：
B组及C组吸入5%CO大鼠10min即可出现明显的中毒反应，表现为拒食少动、行动迟缓、肌力减低、走路不稳、呼吸急促、四肢瘫软、抽搐，粘膜及肢端皮肤可见明显樱桃红色，B组大鼠以上症状持续到8h以后逐渐消失，C组大鼠在第一次开放后上述症状消失。此后14d内观察，实验组大鼠无特殊异常表现，空气对照组无异常表现。
2.2 染毒后血HbCO浓度的变化：
本实验监测B组1d大鼠血HbCO达到15％左右，于5d、7d及14d，血中HbCO浓度可维持在15％左右，未超过20％。C组大鼠监测大鼠血HbCO达到8％左右。对照组大鼠注射空气后，血HbCO水平始终低于5％。
2.3脑海马区NGB免疫组化染色结果：
NGB阳性细胞呈棕色，阳性细胞位于神经元的细胞质中。染毒后免疫组化阳性神经细胞数目：与正常对照组相比，其它两组大鼠海马脑红蛋白阳性神经元数目明显增加，差异有统计学意义(P<0.O1)；其中B组脑红蛋白阳性神经元数目在5d最高，与C组相比差异有统计学意义(P<0.O1)。C组脑红蛋白阳性神经元数目仅在第1d增多明显。
注：与对照组相比，aP<0.O5；bP<0.O1；与实验组A相比cP<0.O5；dP<0.O1；
3 讨论
CO对Hb的亲和力是氧的200～300倍，CO与含铁血红素有高亲和性，结合后使血红素分子的四聚体结构发生变构，使氧解离曲线左移，这不仅妨碍氧与Hb的结合，且抑制了氧的解离，从而造成全身组织严重缺氧。CO中毒实验多采用动式和静式两种方式造模。我们采用静式吸入法对大鼠进行染毒，CO使用量不多，且染毒舱体的体积较大，能有效避免长时间染毒过程中氧分压的降低，二氧化碳升高导致缺氧对实验结果的影响，且可以同时对多只大鼠染毒。对另一组大鼠可随时停止染毒[1]。脑红蛋白（neuroglobin,NGB）是主要位于脑内神经元的携氧球蛋白，其主要在神经元细胞质中表达，是一种在神经组织中携氧，转运氧气，供氧的特异性蛋白，目前已证实其对脑神经细胞有多方面保护机制[2]。在体实验发现缺血缺氧脑损伤时会导致相应区域神经元中Ngb表达量明显上调[3]，并且NgNB在脑内不同区域的表达程度与该区域对缺血、缺氧的敏感程度呈负相关，即神经元NgB含量越高其对缺氧的耐受力越好。海马区与大量学习记忆功能密切相关，其损伤会对这一功能产生严重影响。而一氧化碳中毒迟发性脑病患者临床表现正是以痴呆、记忆力严重受损等神经精神症状为主，提示海马区神经细胞的迟发性凋亡可能是脑病发病的病理基础之一。我们实验结果显示：与正常对照组相比，其它两组大鼠海马脑红蛋白阳性神经元数目明显增加，其中B组脑红蛋白阳性神经元数目在3d最高，与C组相比差异有统计学意义(P<0.O5)。C组脑红蛋白阳性神经元数目仅在第1d增多(P<0.O5)。故在本研究中，我们得出结论：NgB分布的神经细胞受到缺血缺氧损伤后可诱导NgB表达，NGB可能通过阻止凋亡、调节信号转导等作用对急性一氧化碳中毒大鼠海马区神经元细胞起保护作用。
参考文献：
[1]赵天智,常耀明,等. 大鼠急性一氧化碳中毒后迟发性脑病模型的建立.第四军医大学学报,2006, 27(11): 1024-1026.
[2]Burmestcr T,Welch B,Reinhardt S,et a1. A vertebrate globin expressed in thebrain[J].Nature,2000,407(6803):520-523.
[3] Milton S L,Nayak G,Lutz P L,et a1.Gene transcription of neuroglobin is upregulated by hypoxia and anoxia in the brain of the anoxia-tolerant turtle trachemys scripta[J].BomediacalSci,2006,13(4):509-514
作者简介：
赵新华，女，1977年生，河北省迁安市人，汉族，主治医师，主要从事危重急症的中西医结合治疗。
通讯作者：
穆永茂，主治医师，河北省迁安市人民医院重症医学科，河北省唐山市 064400
论文作者:赵新华1,穆永茂（通讯作者）2,王敏2,王艳丽2,李
论文发表刊物:《河南中医》2015年7月供稿
论文发表时间:2015/10/22
标签：氧化碳论文; 神经元论文; 大鼠论文; 阳性论文; 蛋白论文; 数目论文; 迁安市论文; 《河南中医》2015年7月供稿论文;