李爱英[1]2000年在《变铅青链霉菌DNA异常修饰系统的分子生物学研究》文中研究指明变铅青链霉菌的DNA异常修饰系统是一种不同于甲基化修饰的新型修饰系统，它可使变铅青链霉菌DNA在电泳时易遭到氧化双链切割(Dnd表型，DNA degradation)(Zhou et al.,1988)。现已初步揭示这是一种硫元素的修饰(Zhou et al.,1999)。本研究从分子水平上对这种异常修饰进行了研究，缩小定位了异常修饰基因簇，并进行了核苷酸序列测定和分析，同时通过基因置换等技术对异常修饰基因的功能以及基因簇表达调控进行了初步探索。 变钳青链霉菌突变株ZX1由于染色体发生人片段缺失而丧失这种异常修饰系统(Zhou et al.,1994b)。首先对这段缺失区域进行了研究。通过Southern杂交和亚克隆，精确定位和克隆了这段缺失区域的两个端点及缺失界点。两个端点分别定位在野生型菌株基因组文库粘粒16C3的4.3kb的BamH1-EcoR1片段上和17G7的1.2kb的SalⅠ片段上，缺失界点定位在ZX1染色体上的一个2.8kb BamHⅠ片段上。随后制作了这个缺失区域的BamH1酶谱。这项工作不仅为野生型菌株物理图谱的完善提供了必要的信息，证实了与Dnd有关的12kb的区域在ZX1染色体上的完全缺失，也为Dnd功能区的精确定位奠定了工作基础。 为了阐明变铅青链霉菌DNA异常修饰系统的遗传学基础，以这段与Dnd表型有关的12kb区域为基础，获得了不同长度、不同起止点的六个亚克隆pHZ1900～pHZ1905。将这些不同的亚克隆以整合形式导入Dnd表型缺失突变株ZX1中，根据互补能力的不同确定了这段12kb区域中Dnd功能必需区有8.3kb。将这个8.3kb的区域以整合形式导入无Dnd表型的两个异源宿(?)中，均使它们获得了Dnd表型，表明这段8.3kb的区域包含了完整的异常修饰的功能。 为了对Dnd功能区域进行序列测定和分析，通过ExoⅢ缺失实验，获得了38个单向渐减缺失亚克隆。序列测定和分析表明这个8.3kb的区域中含有三个成簇排列的基因dndA(1.1kb)、dndB(1.0kb)和dndC(3.2kb)。其中dndA是第一个早已被分离的异常修饰基因(Zhou et al.,1999)。同源性比较揭示dndA与同氮酶基因mifS高度同源，而dndB和dndC则在数据库中找不到明显同源的序列。为了保证序列的准确性，又从另一个方向制备了28个ExoⅢ单向渐减缺失亚克隆，以备对dnd基冈簇的另一条DNA链进行序列测定，以保证序列的准确无误。 展开了对dnd基因功能的初步研究。首先利用基因置换实验获得分别在dndB、dndC基因内部发生基因中断的突变菌株LA1利LA2，并通过Southern杂交进行了验证。这两个突变株均丧失了Dnd表型，暗示这些基因与变铅青链霉菌的异常修饰直接相关。构建了用于完整基因簇置换的结构pHZ1918利用于双基因置换的结构pHZ1912，以备筛选全基因簇置换突变菌株及双基因同时置换突变菌株。另外通过比较这几个突变株及野生型菌株在产孢和黑色素基因(mel)表达方面的差异，推测dndA及其下游区域与变铅青链霉菌的产孢和刺激外源黑色素基因的表达有关，而dndB和dndC则与之无关，因为LA1和LA2在这两种表型上与野生型菌株无明显差异。 在dnd基因簇调控方面进行了初步探索。当完整的dnd基因簇整合在ZX1染色体上或由1～2个拷贝的自主复制的质粒携带进入ZX1，都能在ZX1中检测到Dnd表型，但是由10个或超过10个拷贝的质粒携带进入ZX1，就检测不到Dnd表型。而在高拷贝质粒上的dnd基因似乎是李爱英变铅青链霉菌DNA异常修饰系统的分子生物学研究能表达的，因为它能红补分别在dn剧、dndB和咖JC发生单个基因突变的菌株，而且这种表达似乎也不会影响野生型菌株1326中原有的dnd基因簇的表达。推测所有的dnd基因若同时超量表达可能会对宿主不利，Dnd蛋白的剂量不能超过宿主忍耐的限度，因而受到严格的控制，另一方面，在宿主可以接受的而且表达平衡的剂量范围内，协调表达的Dnd蛋白会抑制dnd基因簇进一步超量表达。这种自我调控的存在或许是因为其中的某个Dnd蛋白具有感应(sensor)，!兀性。这种luJ一能的白我调控机制说明在野生型菌株中的这种异常硫修饰是受到严格调控的。另外，这儿个Ond蛋白的表达可能是一种程序化的有序的表达，使得这三个蛋白(或其中两个)不能同时超量表达。
纪芳[2]2001年在《变铅青链霉菌DNA的修饰与耻垢分枝杆菌DNA的降解》文中研究说明野生型变铅青链霉菌具有一种不同于甲基化修饰的新型DNA硫修饰系统，使DNA在电泳时易遭到氧化双链切割而导致降解(Dnd, DNA degradation)表型(Zhou et al., 1988, 1994, 1999)。己证实该菌株染色体上一段8.3kb的区域与Dnd表型有关，序列分析显示该区域包含了3个ORFs—dndA, dndB和dndC(Zhou et al., 1999；李爱英，2000)。为了验证这三个基因与Dnd表型的关系，构建了一系列衍生于整合型载体pSET152的质粒：pHZ2150，pHZ2151，pHZ2152和pHZ2153。它们均携带包含3个ORFs的区域(除了pHZ2153在dndB和dndC内缺失了2kb)，但已分别在各ORF上发生单基因中断(pHZ2150，pHZ2151和pHZ2152上外源片段的中断分别发生在dndA，月和C上)。将它们导入Dnd表型缺失突变株ZX1中进行基因互补实验，结果证明变铅青链霉菌and基因簇上的3个ORFs均为Dnd所必需。 对野生型变铅青链霉菌dnd基因簇的生物学功能进行了初步探索。以野生型变铅青链霉菌和各dnd基因突变株为研究对象，对它们在极端培养条件(极端pH，高温，高盐和低氧)下的生长状况和对11株噬菌体的感染性进行了比较，结果在测试条件下，没有发现野生型菌株和不同dnd基因突变株之间存在明显差异。提取各菌株低氧条件下培养物的DNA进行电泳检测，结果揭示该生长条件不能改变这两种菌株原有的Dnd表型。 在PFGE中发现耻垢分枝杆菌mc~2155也具有Dnd表型。将变铅青链霉菌的dnd基因簇与mc~2155的基因组序列(未测完)进行同源比较后，发现mc~2155中存在dndA的同源基因(暂命名为mddl)，且二者在氨基酸水平上的同一性为38％。根据该基因的序列设计了两对特异引物，以mc~2155 DNA为模板，扩增得到0.9kb和1.1kb的产物。其中的0.9kb产物经测序验证与mddl的序列一致。以pHZ132为载体，构建了mc~2155的基因组文库。以0.9kb的扩增产物为探针从文库中钓出10个阳性克隆子。在此基础上构建了用于在mc~2155中进行mddl基因中断的载体pHZ2157。
高小博[3]2001年在《除虫链霉菌DNA降解基因簇add的定位及生物学功能的初探》文中指出制作了携带完整add基因簇的pHZ1318的限制内切酶图谱，根据酶谱进行亚克隆得到pHZ2104和pHZ2105。将它们分别以整合形式导入Dnd表型缺失突变株ZX1中，根据互补能力的不同将Dnd功能必需区定位在11.6kb的XbaⅠ-EcoRⅤ片段上。将这个11.6kb的区域以整合形式导入无Dnd表型的两个异源宿主中，均使它们获得了Dnd表型，表明这段11.6kb的区域包含了完整的异常修饰功能，初步定位了基因簇。同时构建了add基因簇的基因中断质粒pHZ2115，pHZ2116和pHZ217，发现它们都不能赋予ZX1 Dnd表型。 将add基因簇亚克隆到测序载体pBluescript Ⅱ SK(+)上，采用ExoⅢ缺失突变法得到了66个单向递减缺失亚克隆，然后对这些克隆进行测序。同源性比较揭示add基因簇的addA基因与固氮酶基因nifS高度同源，add与变铅青链霉菌dnd核苷酸的同一性为78％。 建立了除虫链霉菌的接合转移系统，并构建了用于置换全部基因簇的基因置换质粒pHZ2114和addA的基因中断质粒pHZ2130，为研究除虫链霉菌add基因簇的生物学功能奠定了基础。
刘光[4]2015年在《天蓝色链霉菌中Ⅳ型限制酶ScoMcrA的功能研究》文中指出由A、T、C、G四种碱基以及表观修饰碱基5-甲基胞嘧啶等组成的DNA是生命体的遗传物质,以往一般认为由C、H、O、N、P五种元素组成。本研究室在天然DNA中发现了第六种元素S,它以由dnd基因簇编码的磷硫酰化修饰的形式存在。DNA的修饰和限制是一对孪生兄弟,在细菌和噬菌体的军备竞赛中,细菌发展出DNA甲基化、羟甲基化等修饰依赖型的限制系统即IV型限制酶,可以对修饰的DNA进行切割以保护细菌自身遗传稳定性。本研究从dnd基因簇在天蓝色链霉菌中的异常表达现象出发,通过实验发现其中含有一种磷硫酰化修饰依赖型的IV型限制酶,并且定位了其编码基因为scoMcrA,实验证实了它位于一个可移动的基因组岛上。在体外表达ScoMcrA的过程中,我们发现带有scoMcrA的表达载体不能导入带有Dcm基因型(DNA胞嘧啶甲基化,位点为C5mCA/TGG)的大肠杆菌,说明ScoMcrA也是一种Dcm甲基化依赖型限制酶。纯化的ScoMcrA在锰离子的存在下可以特异性的识别磷硫酰化修饰的DNA并在离修饰位点两侧17~25个碱基的位置切割磷酸二酯键;同时,还可以特异性的识别Dcm甲基化修饰的DNA并在修饰位点两侧12~16个碱基的位置进行切割。此外,我们还通过Footprinting实验确定了ScoMcrA对甲基化修饰DNA的结合位点。结构生物学的研究解析了ScoMcrA单体及其与磷硫酰化修饰DNA复合物的结构,揭示了ScoMcrA通过将磷硫酰上Rp构型的硫原子嵌入一个疏水口袋并通过疏水作用而特异性的识别并结合的分子机制。另外,还提出了ScoMcrA通过两个独立的结构域分别识别结合磷硫酰化修饰和Dcm甲基化修饰的DNA,并由HNH结构域对DNA进行切割的作用模型。本项研究发现了一种可以同时识别磷硫酰化DNA和甲基化DNA的IV型限制酶,通过体外实验检测了其切割活性、切割位点和修饰位点;通过结构生物学研究首次阐明了蛋白对磷硫酰化DNA的分子识别机制。
徐铁刚[5]2008年在《细菌DNA磷硫酰化修饰与限制》文中提出DNA大分子上的一种特异硫修饰最初发现于革兰氏阳性细菌变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)。DNA分子上除了碳、氢、氧、氮和磷以外,还存在第六种元素-硫。该修饰被确定为DNA的磷酸二酯键发生了磷硫酰化,硫原子取代了羟基上的氧原子成为RP构象的硫代磷酸二酯键。这是除了核酸碱基上的修饰以外,首次发现在DNA骨架上存在的修饰。DNA磷硫酰化的研究始于从野生型变铅青链霉菌中提取的染色体DNA在高压脉冲电泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)和普通凝胶电泳时发生了可被硫脲抑制的降解(DNA degradation, Dnd)。研究证明,修饰的DNA在体外氧化条件下被Tris过酸衍生物攻击而产生双链切割反应,因此在电泳过程中产生6-10 kb的片段。目前与修饰/降解有关的基因簇(dnd cluster)已被定位和测序,内含五个基因,分别命名为dndA、dndB、dndC、dndD和dndE。在与大肠杆菌亲缘关系非常近的革兰氏阴性细菌肠道沙门氏菌中也存在着大量可被硫脲抑制的PFGE分型时发生降解现象的菌株。本研究致力于系统分析变铅青链霉菌上的dnd基因功能,并在沙门氏菌中深入探索DNA磷硫酰化修饰现象,探索其生物学意义。变铅青链霉菌dnd基因簇的核心区域被浓缩到只含五个ORF(dndA-E)的6665 bp大小的DNA片段上,与左侧dndA终止密码子的距离为4 bp,与右侧dndE终止密码子的距离为472 bp。整合含有各单基因缺失的dnd基因簇到HXY6(完整dnd基因簇缺失突变株)的染色体上,得到工程菌株XTG1-5,分析了它们的Dnd表型。dndA, C, D, E的同框缺失导致了Dnd表型的丧失,dndB的同框缺失却加重了Dnd表型。相应基因的表达质粒回补到这些工程菌株中能够恢复原来的Dnd表型,说明dndA, C, D, E是DNA磷硫酰化修饰所必需的,而dndB可能起到调控的作用。通过诱导表达这些蛋白来研究它们对生物体的影响,与DndA,DndB,DndE不同,过量的DndC和DndD会造成菌株完全停止生长,说明整个dnd基因簇是通过五个蛋白严格控制、协调作用来完成DNA磷硫酰化修饰功能的。深入研究Salmonella enterica serovar Cerro 87中的DNA磷硫酰化现象。发现它同样具有Dnd表型并且DNA降解程度高于变铅青链霉菌,说明Salmonella enterica serovar Cerro 87中的DNA发生了高度的DNA磷硫酰化修饰。通过dnd同源基因保守区域设计简并引物克隆赋予Salmonella enterica serovar Cerro 87中Dnd表型的sed基因簇,该基因簇与变铅青链霉菌的dnd基因簇不同,它不含有变铅青链霉菌中参与DNA硫修饰所必须的dndA的同源基因,而只含有dndB-E的同源基因SedB-E。携带这个基因簇的质粒pJTU1238可以在E. coli DH5α中成功地磷硫酰化宿主及其自身的DNA,并最终导致DNA硫修饰结构的确定。DNA磷硫酰化与一种特殊的限制系统相关,从野生型菌株Salmonella enterica serovar Cerro 87或者大肠杆菌DNA磷硫酰化工程菌株中分离出来的经磷硫酰化修饰的质粒能够容易的转化进入Salmonella enterica serovar Cerro 87中,而从突变菌株XTG102或者是大肠杆菌中分离出来的没有被磷硫酰化修饰的质粒的相对转化效率却要低一到两个数量级。缺失掉这个基因簇,突变菌株XTG102的限制表型也相应的丢失了。回补携带sed基因簇的质粒pJTU1238到突变菌珠XTG102后,该突变菌珠又恢复了宿主的限制表型,充分证明sed基因簇除控制DNA磷硫酰化修饰以外还参与了相关的限制功能。通过构建基因组文库,定位了一个与sed基因簇紧密连锁的含有四个ORF(sedF-I)的基因簇,通过基因缺失确定了sedF、sedG、sedH三个基因参与了限制功能,而sedI的缺失不影响宿主的限制功能。进一步对基因库中DNA磷硫酰化修饰-限制同源基因簇进行了分析,并通过实验验证了E.coli B7A中也存在DNA磷硫酰化修饰-限制系统。说明这种磷硫酰化修饰限制现象在生物界中是广泛存在的。
王连荣[6]2007年在《dnd基因簇对细菌DNA骨架的磷硫酰化硫修饰》文中研究说明DNA降解表型(DNA degradation,Dnd)最初是从变铅青链霉菌中观察到的,电泳过程中,变铅青链霉菌的染色体不再是清晰的DNA条带,而是呈现降解状态。进一步研究发现,这是由于DNA上发生了一种异常的复制后修饰,导致DNA在电泳过程中容易遭受阳极产生的Tris过酸衍生物位点特异性攻击而产生双链切割反应。最近,研究者发现,这种异常修饰实际上是与dnd基因簇相关的DNA硫修饰。通过放射性~(35)S喂养,在具有dnd同源基因簇/Dnd表型的变铅青链霉菌66,阿维链霉菌NRRL8165和荧光假单胞菌PfO-1的DNA上检测到放射性硫信号,揭示出除了碳、氢、氧、氮和磷,DNA上还存在第六种元素硫。本研究则致力于探索DNA硫修饰的发生方式,解析这种“前所未见”的生理修饰的精细化学结构,也为后续DNA硫修饰生物途径、生物学意义等研究提供方向性指导。本研究通过~(35)S半胱氨酸喂养获得具有dnd同源基因簇/Dnd表型的大肠杆菌后,获得放射性硫标记的基因组DNA。随后,把基因组DNA酶解成单脱氧核苷并利用高压液相色谱分离,结合液体闪烁计数器对每分钟分离组分的放射性强度检测,从而对硫修饰DNA分子的保留时间进行了精确定位,由此展开了对这种“一无所知”的硫修饰DNA化学结构的探索。基于硫修饰DNA分子在高压液相色谱中的“位置”,继而采用高压液相色谱-质谱联用技术对其组分进行分析,发现了一组可能来自硫修饰DNA分子特征性质谱信号597,446,348,152和136。结合这组核质比信号以及该分子对核酸酶具有抗性的特征,提出DNA分子的硫修饰可能发生在DNA骨架上,磷酸二酯键发生磷硫酰化成为硫代磷酸二酯键,并存在于脱氧鸟苷和脱氧腺苷之间,即5'-d(G_(PS)A)-3'或者5'-d(A_(PS)G)-3',暗示DNA硫修饰不像人们最初预料的那样发生在相对活跃的DNA碱基上。对大肠杆菌中硫修饰DNA分子和合成标准品进行了高压液相色谱-质谱联用、高精度质谱、紫外特征吸收色谱以及四级质谱断裂模式对比分析,最终揭示出DNA硫修饰的化学本质,证实大肠杆菌中硫修饰DNA分子的确以硫代磷酸二酯键的方式、按5'-3'的方向序列特异性发生在脱氧鸟苷和脱氧腺苷之间——5'-d(G_(PS)A)-3'。进一步利用对底物具有空间构象选择性的核酸酶对大肠杆菌中硫修饰DNA分子5'-d(G_(PS)A)-3'进行水解;结合其在高压液相色谱中的保留时间提出DNA硫修饰不但具有序列选择性,还具有空间构象专一性,特异性地以RP构象存在。在Dnd表型的发现菌变铅青链霉菌中,利用放射性硫标记、高压液相色谱-质谱、紫外特征吸收色谱以及高精度质谱分析,发现DNA硫修饰在不同菌属中具有不同的序列选择性。不同于大肠杆菌中的5'-d(G_(PS)A)-3' R_P,链霉菌的DNA硫修饰以硫代磷酸二酯键形式、RP空间构象存在,但却序列特异性发生在两个脱氧鸟苷之间——5'-d(G_(PS)G)-3'。目前已经在100多种微生物中观察到Dnd表型,并在许多广泛分布的细菌中检测到dnd同源基因簇的存在。通过对来自截然不同栖息地的厌氧菌Geobacter uraniumreducens Rf4、遍在远洋杆菌Candidatus Pelagibacter ubique HTCC1002、荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens PfO-1、希瓦氏菌Shewanella pealeana ATCC 700345、海洋细菌Hahella chejuensis KCTC 2396,以及海洋杆菌Oceanobacter sp. RED65进行序列比对发现这些细菌的基因组中都具有dnd同源基因簇,包含5个或4个dnd同源基因。结合高压液相色谱-质谱联用分析,逐一鉴定出这些细菌都发生了DNA硫修饰,都在DNA骨架上发生磷硫酰化成为5'-d(G_(PS)A)-3' R_P或者5'-d(G_(PS)G)-3' R_P。说明DNA硫修饰不是偶然发生的生命现象,是广泛存在的具有序列选择性、空间构象专一性的新型修饰系统。体外化学合成的硫代磷酸二酯键对很多核酸酶的酶解作用具有抗性,结合DNA硫修饰是一种复制后修饰、序列特异性、空间构象专一性的生理特性,提出硫修饰很可能是细菌的一种自我保护机制,通过对自身DNA进行磷硫酰化修饰,保护DNA免受某些核酸酶的酶解;另外,细菌还可以利用硫修饰为标志对自身和外源DNA进行区分,针对性地分辨、清除入侵的DNA分子,维护自身的遗传稳定性。综上所述,DNA硫修饰是一种不同于甲基化的新型的DNA修饰体系,尤其是随着本研究对其精细化学结构的揭示,发现这也是迄今为止国际上唯一发现的DNA骨架上天然发生的序列特异性、空间构象专一性的复制后修饰。
赖崇德[7]2014年在《DNA磷硫酰化修饰体系中dndE基因的功能分析及相关蛋白纯化体系的建立》文中认为在早期的研究中,科研人员在对变铅青链霉菌DNA电泳过程中发现了一种奇特的DNA降解(DNA degradation)现象,简称Dnd现象。经深入研究发现该降解发生的原因是由于细菌染色体上发生了新型DNA表观遗传修饰,即通过一段与降解表型相关的基因簇(命名为dnd基因簇)将DNA骨架上非桥联的氧原子替换为硫原子,造成细菌DNA在Tris缓冲液电泳过程中被阳极产生的Tris氧化衍生物切割,从而导致DNA的降解。该研究的发现,揭示了DNA中第六种物质硫元素的存在,后续研究也证实该类型修饰仅广泛存在于原核生物中,且是一种具有Rp空间结构专一性、修饰位点特异性的DNA表观遗传修饰现象。通过同源性比对预测功能,蛋白纯化测定酶活力,以及蛋白质结晶分析其空间结构、功能及活性位点等技术,研究人员对dnd基因簇中每个基因的功能都展开了一定的研究。科研人员在对DndE进行结晶后发现,在DndE的表面存在K17、K18、K20、K53、K87、K91六个关键的赖氨酸活性位点。体外实验也发现这些赖氨酸的突变,会导致DndE与双链DNA,尤其是缺刻双链DNA的亲和能力的显著下降。本课题利用LC-MS/MS串联质谱技术、定点突变等方法,研究来源于沙门氏菌S. enterica serovar Cerro87中DndE蛋白在体内生理条件下,所发挥的生物学功能及活性。本研究是以质粒pJTU1238为基础通过一系列的基因工程改造完成的。质粒pJTU1238是一个含有沙门氏菌S. enterica serovar Cerro87完整dnd修饰基因簇dndBCDE四个基因的质粒,能够通过异源表达,为外源宿主DNA引入磷硫酰化修饰。而dndE的缺失,会阻断pJTU1238对宿主的磷硫酰化修饰途径,证明dndE在这生理途径中的必须性,同时也证明在宿主细胞中,没有与DndE功能相似或可取代其功能的蛋白,从而为本研究工作的开展提供了清晰的遗传背景。本研究针对质粒pJTU1238上的dndE基因进行定点突变和同框缺失,获得了一系列的pJTU1238衍生质粒,并将其分别同源回补入沙门氏菌硫修饰缺失突变株XTG102中。同时通过异源表达,将pJTU1238及其衍生质粒导入一系列的E. coli模式菌株DH10B、DH5α、ER2796以及Mach Ⅰ中,研究dndE基因突变后对DNA磷硫酰化修饰的修饰频率及修饰位点的影响。本研究结果证实,在DndE蛋白上,K18与K20这两个赖氨酸位点,是DndE蛋白中发挥作用的关键性位点。但同时也证明,即使是这两个位点都进行了突变,仍然不会影响磷硫酰化修饰的发生,而只是降低修饰频率。这说明了DndE蛋白在体内生理条件下,并不只是发挥结合带缺口双链DNA的功能,而是在整个磷硫酰化修饰的生理途径中可能还具有其他方面尚未揭示的功能。当然,在整个E. coli系统中,是否也有其他的蛋白也在协助完成这一修饰系统,也是后续需要研究的。同时,本研究也通过qRT-PCR技术与Western blot技术,研究在XTG102和E.coli DH10B中,pJTU1238及其衍生质粒转入宿主后,dndE上关键位点的突变导致dndE基因在转录以及翻译水平上的变化。并分析在相同的转录水平下对磷硫酰化修饰的修饰频率的影响,以及分析在相同翻译条件下,对磷硫酰化修饰状况的差异。经研究发现,DndE上6个不同赖氨酸位点的突变,会导致在相同菌中修饰频率的差异性很大。而且在不同的菌中,DndE上相同的氨基酸突变位点也会造成很大的影响。目前,对沙门氏菌S. enterica serovar Cerro87中磷硫酰化修饰基因簇中单个蛋白的异源表达和纯化仅有少量报道。本工作将沙门氏菌S. enterica serovar Cerro87中的dnd基因簇中dndA、dndC、dndD、dndE进行体外质粒构建与异源表达与纯化。希望以此为契机,深入了解每个蛋白所发挥的功能及生物学效应,并帮助了解磷硫酰化修饰的生化途径。
王贤哲[8]2010年在《变铅青链霉菌DNA磷硫酰化优先修饰区的功能研究》文中认为DNA的磷硫酰化修饰广泛存在于细菌中。在变铅青链霉菌中的质粒pIJ101上发现了一个优先修饰位点,其位于一段130bp的区域内,含有一个4bp的核心序列,由三个正向重复和两对反向重复环绕。通过荧光凝胶阻滞电泳实验,发现野生型变铅青链霉菌1326的总蛋白与优先修饰序列产生三条迁移条带,其特异性经随机探针的竞争实验得到验证。dnd突变株的实验表明这三个迁移条带并非由Dnd蛋白产生的。经过硫酸链霉素沉淀,硫酸铵分级,疏水柱层析,阴离子交换层析和非变性梯度凝胶电泳等纯化步骤,结合串联质谱鉴定到迁移条带中的两个蛋白质,分别是天蓝色链霉菌DNA旋转酶A亚基(GyraseA, SCO3873)和多核苷酸磷酸化酶(PNPase, SCO5737)的同源蛋白。为了验证这一结果,从变铅青链霉菌的基因组中扩增了pnpase和gyraseA基因,并克隆到表达载体pET15b上。表达并纯化了带有His标签的PNPase和GyraseA的融合蛋白。异源表达的PNPase在凝胶阻滞电泳中显示出与野生型的PNPase相似的迁移条带和结合特异性;而表达的GyraseA则与优先修饰序列结合微弱。用表达的PNPase制备了兔多抗。用超迁移实验证明了变铅青链霉菌总蛋白产生的三条迁移条带中的第二条对应于PNPase。PNPase已知的功能与RNA代谢有关,如mRNA的降解和RNA 3'尾部的合成等。我们发现PNPase与DNA磷硫酰化的优先修饰序列特异地结合,其功能需要进一步的研究。由于有报道pnpase是必需基因,我们采用过表达和反义RNA沉默的方法来改变体内PNPase的水平,以期观察到对细菌生理或硫修饰的影响。这将有助于我们了解DNA磷硫酰化过程中优先选择修饰的生理意义。
谢新强[9]2012年在《磷硫酰化DNA在细菌中作为抗氧化剂的机制研究》文中指出在细菌的DNA上进行磷硫酰化修饰（硫修饰），而硫修饰DNA在电泳过程中发生降解表型(DNA degradation，Dnd)。负责这种磷硫酰化修饰功能的蛋白由5个连锁并存在于一个基因组岛上的5个基因dndA-E编码，其中四个基因dndA和dndC-E是磷硫酰化修饰所必需的基因。而对于生理学意义直到最近，才在天蓝色链霉菌中发现了特异地限制磷硫酰化DNA的基因，在沙门氏菌中发现了磷硫酰化修饰限制系统。到目前为止磷硫酰化修饰DNA电泳过程中降解机制不明，且其生理学意义知之甚少。用化学合成的模拟底物磷硫酰化修饰的二核苷dG~SA和PAA-TAE激活液反应，作为研究磷硫酰化DNA电泳过程中降解机制的模拟反应，产物在HPLC图谱上显示6个新的UV_(254nm)吸收峰。PAA-TAE激活液的化学组成包括了过氧化氢、过氧乙酸、乙酸、Tris碱和乙二胺四乙酸（EDTA）。将各个组分解离开来分析，其中PAA能够直接将去离子水中的dG~SA氧化切割生成6个产物（化合物2-7），不需要Tris等一级胺的参与。在不同pH的Tris溶液中用PAA氧化切割dG~SA，得到各个氧化切割产物的比例是不一样的。在1%乙酸溶液中用PAA处理dG~SA，可以得到高比例的过渡态氢膦酸酯化的二核苷dG~HA（化合物2），这为后续很多实验奠定了基础。通过高分辨质谱的数据分析得到各个化合物的精确分子量和可能的化学分子式，再根据各个化合物断裂后形成的离子碎片与原结构的比较，初步推测了化合物2-7的可能结构。根据推测的结构，利用化学合成的标准品与各个化合物的HPLC保留时间、紫外吸收特征、质谱、二级质谱等特性的比较，最终确定了各个氧化切割产物的具体结构。化合物2是腺嘌呤鸟嘌呤脱氧核糖核苷二核苷的氢膦酸二酯dG~HA，化合物3是正常的二核苷酸dG~OA，化合物4是带有鸟嘌呤脱氧核糖核苷的氢膦酸单酯，化合物5是腺嘌呤脱氧核糖核苷，化合物6是鸟嘌呤脱氧核糖核苷，化合物7是带有腺嘌呤脱氧核糖核苷的氢膦酸单酯。通过在酸性环境下制得高比例的过渡态化合物2，然后将反应液冷冻干燥，再溶解在不同pH溶液中进行HPLC-MS检测，在pH>5.0的条件下氢膦酸二核苷dG~HA发生水解断裂，最终提出了磷硫酰化DNA被PAA通过先氧化再水解的两步降解机制。用磷硫酰化二乙酯作为底物和PAA或者过氧化氢反应，反应液经冷冻干燥后发现有刺激气味的黄色物质产生，用GC-MS确定了该物质是单质硫。在酸性条件下制得了高比例的氢膦酸酯化的二核苷dG~HA，然后用Tris碱迅速调节pH到7.0，发现有大量的氢膦酸酯化的二核苷转化到正常的二核苷。而磷硫酰化的基因组DNA也具有类似的现象，当PAA处理后的样品迅速调pH之后DNA降解现象急剧减弱甚至消失。过氧化氢也能够和磷硫酰化DNA直接发生反应，并将磷硫酰化DNA氧化到正常状态的磷酸酯DNA或使其氧化损伤断裂。最终提出磷硫酰化DNA在电泳过程中发生的化学反应即降解机制，磷硫酰化DNA的最终命运有两种可能性，一种是磷硫酰化DNA可以在PAA等氧化剂的作用直接氧化到正常的DNA，或者先被氧化到氢膦酸酯然后再被氧化到正常的DNA而不会引起磷硫酰化DNA断裂降解；另一种是磷硫酰化DNA被PAA氧化到氢膦酸酯的DNA，然后被水解而表现为磷硫酰化DNA电泳过程中的降解。当用不同浓度的磷硫酰化二核苷dG~SA与过氧化氢反应，HPLC检测反应后剩余的过氧化氢量，磷硫酰化dG~SA量的增加可明显地消耗更多的过氧化氢，而正常的磷酸酯化的二核苷dG~OA则不能够消耗过氧化氢，证明磷硫酰化DNA能够作为还原剂消耗过氧化氢。用不同浓度的过氧化氢或过氧乙酸与磷硫酰化DNA反应，发现在0.14mM PAA作用下就有正常的二核苷dG~OA生成，而利用MS的高精度特性可以在10μM PAA存在下检测到dG~OA生成。暗示生理氧化压力条件下，磷硫酰化的DNA可以作为抗氧化剂消耗过氧化氢而减小氧化压力对生物体的影响。过氧化氢处理含有和缺失磷硫酰化DNA的沙门氏菌株，生长曲线显示含有磷硫酰化修饰DNA的野生型、dptＢ缺失突变株能够在较高浓度的过氧化氢环境下生长，而缺失了磷硫酰化修饰DNA的dptＣ、Ｄ、Ｅ突变菌株则不能够在较高浓度的过氧化氢环境下生长。这就证明磷硫酰化修饰的DNA赋予了微生物抵抗一定量的过氧化氢的能力。用不同浓度的过氧化氢处理含有或缺失磷硫酰化DNA的沙门氏菌株，提取总基因组DNA电泳检测，磷硫酰化DNA的菌株在一定浓度的过氧化氢处理后其DNA保存的比较完整，但缺失磷硫酰化DNA的菌株其DNA发生了明显的双链断裂现象。表明磷硫酰化DNA在体内要比非磷硫酰化DNA更加耐受氧化压力造成的氧化损伤。用Dnd现象检测DNA磷硫酰化修饰丰度变化表明，磷硫酰化修饰丰度在一定浓度的过氧化氢处理后明显地降低。但同时在一定浓度条件下检测不到明显的变化，可能是因为活性氧分子将磷硫酰化DNA转化为正常的磷酸酯化DNA，然后在宿主dpt相关基因编码蛋白的作用下重新进行了磷硫酰化修饰。自然界的沙门氏菌含有磷硫酰化修饰DNA，能够作为抗氧化剂抵抗一定的氧化压力。当将编码沙门氏菌的整个dpt基因簇质粒转化到大肠杆菌DH10B中，赋予新宿主菌以磷硫酰化修饰DNA的特性，增加了宿主菌对抗过氧化氢的能力。证明磷硫酰化DNA可以给细菌带来抗氧化压力的能力，也可以解释为什么编码磷硫酰化修饰DNA的基因处于一个基因组岛上，使其能够在微生物间进行水平转移然后赋予新宿主以抵抗氧化压力的能力。综上所述，磷硫酰化DNA在电泳过程中降解主要是因为被过氧化物氧化生成氢膦酸酯化DNA，然后发生水解而断裂；磷硫酰化DNA能够作为抗氧化剂保护DNA免受氧化损伤，并消除一部分的氧化压力，从而提高宿主菌在氧化压力下的生存能力。
张姗姗[10]2013年在《青黄散治疗骨髓增生异常综合征DNA磷硫酰化初探》文中研究说明本论文从以下三方面阐述：一、西苑医院血液科室青黄散治疗MDS疗效及疗效机理研究。西苑医院血液科70年代开始以青黄散治疗各类恶性血液病,取得了良好疗效。尤其近十余年对骨髓增生异常综合征的治疗取得了显著成就。2000年以来青黄散+健脾补肾汤药为主治疗MDS病例共306例,总有效率79.5-82.3%,缓解率24.3%-26.5%；60%-70%病人外周血三系恢复正常,对各型MDS均有效,但疗效与FAB分型、IPSS危度及染色体异常有明显相关性。总体疗效优于现有的西医西药疗法。治疗过程中未出现阿扎胞苷、地西他宾治疗过程中常见的骨髓抑制、出血、感染等并发症,患者生活质量明显提高,生存期明显延长；而且患者花费极低(不及西医药治疗的1/10)。疗效机制研究方面,深入研究了含砷中药治疗MDS的疗效机理。采用Affymetrix USA的GeneChip Human Promoter1.0Array基因芯片检测了MDS患者治疗前后的全基因甲基化状况。结果发现：未检出染色体核型异常的MDS患者发生甲基化的基因数量最多,三体8异常核型次之,其他异常核型患者发生甲基化的基因数量最少。结果表明：含砷中药治疗不能改变MDS患者已有的染色体异常,但异常增高的甲基化显著减低,含砷中药治疗的主要作用机理是去甲基化。治疗后去甲基化的基因主要包括多细胞生命发育生物学途径、转录调控生物学途径、细胞凋亡生物学途径、信号转导生物学途径。二、MDS治疗及疗效机制研究展望既往研究中问题及展望：1.虽然我们已证实含砷中药治疗MDS的主要作用机理是去甲基化,但其去甲基化机理仍需进一步研究。研究证明砷剂解毒代谢过程中竞争甲基,从而使MDS过度甲基化基因去甲基化而发挥治疗作用。我们推测砷剂去甲基化机理极可能是竞争甲基而表现去甲基化作用。但中药砷剂去甲基化有无靶点特异性?还是无靶点特异性的泛去甲基化?需要进一步研究阐明。还有甲基化表现为具有一定的可逆性,甲基化做为生物体生理性保护机制,药物干预后经过一定时间去甲基化基因重新恢复甲基化状态,青黄散治疗有无这种现象,也需要进一步阐明。2.血砷浓度差异性问题。我们前期研究中也发现血砷浓度个体差异性大,砷的吸收和代谢存在个体差异性。研究中发现病人服用同样剂量的青黄散而全血砷浓度不同,说明砷剂的胃肠吸收存在明显的个体差异性。因此有必要开展个体化血砷浓度检测和疗效关系的研究,减少因胃肠吸收少血砷浓度不能达到有效浓度的病人,提高MDS临床疗效。另外其他研究机构正在开展纳米雄黄研究,结果表明纳米雄黄的吸收效率,峰浓度明显高于水飞雄黄组,值得进一步探讨纳米雄黄应用。降低胃肠道副作用,以及有效利用中药材等方面具有积极意义。3.展望：既往的MDS疗效机理研究中已证明青黄散治疗MDS疗效机制为雄黄在体内代谢过程中产生的去甲基化效应。我们已筛选出含砷中药治疗前MDS病人呈现高甲基化而治疗后去甲基化的13个基因。探索研究这些基因甲基化成因,提出预防、干预措施,从根源上减低和预防MDS的发生。此次磷硫酰化机制研究也是在前期表观遗传学研究基础上的进一步探索,是一项为阐明青黄散疗效机制的又一次尝试。三、青黄散治疗后MDS患者骨髓细胞磷硫酰化初探。研究背景：组成DNA的元素碳(C)、氢(H)、氧(O)、氮(N)、磷(P)被称为生命必需元素。DNA只含CHONP五种元素吗?科学家在研究生物体DNA分子过程中发现除了碳、氢、氧、氮、磷五种元素外另一种组成元素,即为硫元素。该发现源于磷硫酰化研究中,磷硫酰化修饰就是DNA的磷酸二酯键发生了构象变化,即磷酸二酯键羟基上的氧原子被硫原子替代形成RP构象的硫代磷酸二酯键。这是首次在DNA骨架上发现的新的修饰。2005年,美国科学院院刊(PNAS)发表了一篇以上海交通大学王连荣教授为第一作者,陈实教授和彼得·帝丹教授为共同通讯作者的论文：“DNA磷硫酰化修饰在细菌基因组中广泛分布且量化存在”,这对于DNA硫修饰研究来说是一次重大突破,从基因层面阐述了硫酰化机制。DNA降解表型(DNA degradation, Dnd)最早发现于变铅青链霉菌研究中,电泳过程中发现变铅青链霉菌的染色体出现降解现象,不再是清晰的DNA条带。研究证实,这是因为DNA上出现了复制后修饰,这种修饰使在凝胶中电泳时的DNA容易受到阳极的Tris过酸衍生物位点特异性攻击而导致双链切割反应。这种异常的修饰是一种DNA的硫修饰,是与dnd基因簇有关的。通过喂养放射性物质35S,在具有dnd同源基因簇/Dnd表型的变铅青链霉菌66,阿维链霉菌NRRL8165和荧光假单胞菌Pfo-1的DNA上检测到了具有放射性的硫信号,显示出除碳、氮、氢、磷和氧五种元素之外,DNA的组成中存在第六种元素--硫。研究目的：众所周知自然界多种药物如博莱霉素等抗生素会对DNA造成损伤断裂；而磷酸二甲酯、肼也会对DNA进行特异性切割；含铁离子的EDTA作为寡聚核苷酸配基也对DNA有位点特异性切割。青黄散作为硫化砷制剂,对血液恶性肿瘤细胞表现出抑制,诱导凋亡和去甲基化作用。那么对DNA双链结构有无影响?硫元素可否掺入DNA骨架?有无存在DNA结构的硫酰化修饰?这就是本课题研究的目的。研究方法：抽取符合纳入标准的MDS患者骨髓2ml。首先分离、纯化DNA,制备琼脂糖包埋的DNA样品。利用BIO-RAD CHEF-DRⅢ System脉冲场电泳检测DNA降解表型。研究结果：将10例琼脂糖包埋的骨髓细胞DNA利用BIO-RAD CHEF-DR Ⅲ System脉冲电泳进行分析,结果发见标本DNA完好,在Tris缓冲液下未出现DNA降解现象。研究结论：利用BIO-RAD CHEF-DRⅢ System脉冲电泳对琼脂糖包埋的骨髓单个核细胞DNA进行分析,结果未发现DNA降解现象。说明青黄散治疗有效患者骨髓细胞DNA骨架中并没有存在磷硫酰化修饰现象。从另一角度也说明青黄散疗效机制不通过硫修饰系统。本文的创新点在于：哺乳动物DNA磷硫酰化研究国内外未见报道,本课题探索性的研究长期硫化砷干预后人类DNA磷硫酰化修饰。
参考文献：
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[4]. 天蓝色链霉菌中Ⅳ型限制酶ScoMcrA的功能研究[D]. 刘光. 上海交通大学. 2015
[5]. 细菌DNA磷硫酰化修饰与限制[D]. 徐铁刚. 上海交通大学. 2008
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[7]. DNA磷硫酰化修饰体系中dndE基因的功能分析及相关蛋白纯化体系的建立[D]. 赖崇德. 武汉大学. 2014
[8]. 变铅青链霉菌DNA磷硫酰化优先修饰区的功能研究[D]. 王贤哲. 上海交通大学. 2010
[9]. 磷硫酰化DNA在细菌中作为抗氧化剂的机制研究[D]. 谢新强. 上海交通大学. 2012
[10]. 青黄散治疗骨髓增生异常综合征DNA磷硫酰化初探[D]. 张姗姗. 中国中医科学院. 2013
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