张艺军[1]2001年在《AT_(1a)mRNA在大鼠肝脏星状细胞中的表达及对肝脏纤维化作用机制的研究》文中研究指明一、背景与目的 肝脏纤维化是慢性肝病共有的病理改变。不同病因引起的慢性肝损伤，均可导致以胶原为主的细胞外基质各成分合成增多、降解相对不足及其过多沉积在肝内而引起纤维化。肝脏合成细胞外基质的细胞，主要是被激活的肝脏星状细胞（Hepatic stellate cells HSCs），在正常肝组织中其主要功能是参与维生素A的储存和代谢。但在肝组织发生炎症或坏死时，则被激活转化为成纤维细胞样细胞，并迅速增殖，合成大量的Ⅰ、Ⅲ型胶原和其它细胞外基质，形成结缔组织间隔，导致肝脏纤维化。 在肝纤维化的发生、发展过程中，有大量细胞因子参与其调节作用。血管紧张素Ⅱ是一种强烈的有丝分裂原，体内有两种受体：AT_1和AT_2；AT_1又可以分为AT_(1a)和AT_(1b)两种亚型。大量研究资料表明AT_(1a)在心肌、肾脏及肺组织等组织器官的纤维化发展过程中发挥重要作用。但是，血管紧张素Ⅱ及其AT_(1a)受体在肝脏纤维化发生过程中的作用机制研究，国内外还未见报道。本研究从大鼠肝脏星状细胞入手，率先检测AT_(1a)mRNA在肝脏星状细胞的表达情况，并进一步探讨血管紧张素Ⅱ及其AT_(1a)拮抗剂对肝脏星状细胞体外增殖和细胞功能的影响，旨在阐明血管紧张素Ⅱ及其AT_(1a)受体在肝脏纤维化发生、发展过程中的作用。 二、材料与方法 1．大鼠肝脏星状细胞的分离、培养及鉴定 采用胶原酶和链霉蛋白 酶消化及密度梯度离心法从大鼠肝脏中分离提取肝脏星状细胞，将 细胞悬浮于含 10％小牛血清的 DMEM培养液中培养。应用常规苔 盼蓝染色、荧光显微镜及免疫细胞化学染色等分别进行肝脏星状细 胞活力及性质鉴定。 2．ATI。工RNA在肝星状细胞中的表达研究 应用异硫氰酸腑法提 取大鼠肝星状细胞的总RNA，设计AT；。特异引物，利用RT－PCR 技术进行PCR扩增；采用冻溶法从凝胶中回收和纯化目的DNA 条带，用 ABI PRISM’”310测序仪进行狈序鉴定；然后将测出的 序列与 Gene Bank数据库资料进行比较分析。 3．Allgl！及ATI：受体抬抗剂对肝脏星状细胞细胞生长、增殖及生成 胶原的影响研究 在不同浓度的Aflgll及ATI。特异的桔抗剂 一！。sartan作用下绘制肝星状细胞的生长曲线；同时，采用MTT 法和’H1DR掺入法检测细胞的主长、增殖情况；h－脯氨酸掺入 法检测肝星状细胞的胶原生成量。 叁、结果 大鼠肝星状细胞得率为门－3）X 10＼大鼠，活力 95％以上，并经 荧光显微镜观察计数和小鼠抗大鼠desmin抗体鉴定，纯度超过 90％。RT－PCR检测发现大鼠肝星状细胞有ATlainRNA表达，其PCR 产物经测序后与GCfl6B8nk数掘库中ATI。。DNA序列相比较，其同源 性达98石％。通过绘制肝星状细胞生长曲线、MTT法和’H丁DR 掺入法检测到，Angll浓度高于 10刁 mow时，促使细胞生长增殖。 ，·其 AT；／抗剂 Losartan浓度高于 10寸 mol／L时，抑制细胞的生长 和增殖；高于 105 mol／L时，则可以阻断 Angll的作用。通过 3H－ ．3－ 脯氨酸掺入法检测到，Angll的浓度在10亿mol／L～10“mol／L时， 肝星状细胞生成胶原增多（P＜0刀5），且与浓度呈正相关；而 Losartan·的浓度在 10J moyL～10一 mol几时，胶原生成量减少（P＜0．05L 且与浓度呈负相关。四、结论 大鼠肝星状细胞中有 ATI。IRNA表达；血管紧张素＊通过与ATI。结合促使肝星状细胞迅速增殖并产生大量的胶原；阻断AT；。后细胞增殖受到抑制，胶原合成明显减少。本研究提示，血管紧张素＊在促使肝脏纤维化的发展过程中起着重要的作用，ATI．的桔抗剂有望为阻止肝脏纤维化的发展提供新的策略。
吴繁荣[2]2013年在《酸敏感离子通道1a在肝纤维化星状细胞中的表达、作用及机制研究》文中指出酸敏感离子通道(acid-sensing ion channels, ASICs)是一类由胞外酸激活的阳离子通道,开放的通道对Na+、Ca2+有通透性,进而引起细胞一系列生理病理变化。目前为止,已发现4个基因编码的7个ASICs亚基(ASIC1a、ASIC1b、ASIC1b2、ASIC2a、 ASIC2b、ASIC3、ASIC4),均属于DEG/ENaC家族成员。近年来ASICs研究备受关注,其不仅在神经系统中存在表达并发挥疼痛、感觉、神经传递等调节作用,还在非神经系统如肿瘤、炎症、缺血性损伤、胃肠道疾病中发挥作用,这些病理反应中共同的特点是局部组织环境酸化、pH值下降,诱发ASICs激活导致Na+、Ca2+内流,进而引起各种病理生理效应。本课题组前期研究发现SD大鼠关节软骨中存在ASIC1a、ASIC2、和ASIC3的表达,在佐剂性关节炎(Adjuvant Arthritis, AA)大鼠关节软骨中ASIC1a、 ASIC2a和ASIC3的表达均明显高于正常组,ASICs非特异性阻滞剂Amiloride、非甾体类抗炎药阿司匹林能明显抑制。ASICs表达,并对AA大鼠关节软骨具有保护作用。进一步考察ASICs在关节炎中作用机制发现,当大鼠关节炎症发生时,可造成局部关节酸化,ASICs表达增加和通道开放,Ca2+流入关节软骨细胞内,导致关节软骨细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)代谢失衡引起关节软骨损伤。肝纤维化(hepatic fibrosis, HF)是慢性肝病的共同病理过程,是形成肝硬化的中间阶段。目前研究认为,病毒感染和酒精的过量摄入导致肝脏炎症是肝纤维化形成的主因。当炎症刺激时,肝脏产生氧化应激和脂质过氧化损伤,酸性代谢产物增加,肝星状细胞(Hepatic stellate cells, HSCs)活化增殖,转化为肌样成纤维细胞,表达α-SMA,合成和分泌细胞外基质(extracellular matrix, ECM)增加,导致ECM的合成与降解失衡,致使过多的ECM在肝组织沉积形成纤维化。该病理进程与关节炎症类似,即同样存在炎症导致的局部酸化,同样引起ECM代谢的失衡,那么,肝脏是否存在ASICs的表达?当肝纤维化时肝组织的酸性代谢会否导致ASICs的表达增加和通道激活,进而发挥其病理生理学作用?为此,我们研究以下内容：LASICla在大鼠肝组织、肝星状细胞的表达分离大鼠肝组织,RT-PCR检测.ASIC1a mRNA表达,发现大鼠肝组织中存在ASIC1a的表达,CC14诱导的肝纤维化模型大鼠ASIC1amRNA表达增加；采用ASIC1a, α-SMA免疫荧光双标染色模型组大鼠肝组织,发现大鼠肝组织ASIC1a与α-SMA染色区域高度重迭,提示ASIC1a主要表达与活化肝星状细胞。肝灌注分离正常组、模型组大鼠HSC细胞进行RT-PCR, Western blot发现,正常组HSCs存在ASIC1amRNA及其蛋白表达,模型组表达高于正常组。选择HSC-T6表型活化细胞株,用酸诱导HSC-T6体外模型(pH6.0),考察不同pH值环境下ASIC1a在HSC-T6的动态表达,研究发现,与pH7.4组相比,pH6.0酸诱导HSC-T6组ASIC1a表达增加。2. ASIC1a阻滞剂Amiloride对CCI4诱导大鼠肝纤维化的保护作用建立CC14实验性肝纤维化大鼠模型,灌胃给予不同剂量ASIC1a阻滞剂阿米洛利(Amiloride,10,5,2.5mg/kg),观察Amiloride对大鼠肝纤维化的影响,验证ASIC1a在肝纤维化进程中的作用。结果发现,Amiloride能显着抑制肝纤维化大鼠肝、脾指数增加；降低血清中升高的ALT、AST、HA、LN、PCⅢ、CIⅣ;病理组织学显示Amiloride组肝脏组织结构明显改善,肝纤维化增生程度减轻,提示Amiloride对CC14所致大鼠肝纤维化有明显的保护作用。进一步研究发现,Amiloride可以显着抑制肝组织中ASIC1a的表达,降低肝纤维化大鼠血清中IL-1、IL-6的等炎性因子的含量；抑制肝组织中α-SMA、TGF-β1、NFκB和Collagen I的蛋白表达。研究提示,ASICla参与肝纤维化疾病进程,Amiloride对实验性肝纤维化的保护作用可能与其抑制ASIC1a,进而调节HSCs功能有关。3.ASICla对酸诱导HSC-T6细胞内Ca2+浓度、细胞增殖和基质代谢的影响建立酸诱导HSC-T6体外模型,采用Amiloride、ASIC1a特异性阻滞剂PcTX1干预,考察抑制ASICla对HSC-T6细胞胞内Ca2+浓度、细胞增殖及基质代谢的影响。激光共聚焦显微镜、Ca2+成像研究HSC-T6胞内Ca2+的变化发现,pH6.0能明显促进Ca2+流入HSC-T6胞内,Amiloride、PcTX1干预后,Ca2+内流明显减少；MTT法观察ASIC1a阻滞剂对酸诱导HSC-T6的细胞增殖的影响,与pH6.0组相比,Amiloride (200、100、50μM)、PcTX1干预后,HSC-T6细胞生长明显被抑制,且呈剂量效应关系；研究HSC-T6功能的影响,发现与pH7.4组相比,酸处理至pH6.0HSC-T6细胞中α-SMA、TGF-β1、collagen Ⅰ表达增加,Amiloride、PcTXl干预后α-SMA、TGF-β1collagen I表达降低。进一步观察发现,pH6.0HSC-T6细胞中MMP-13明显降低,TIMP-1明显上调,Amiloride、PcTX1能抑制酸性环境下TIMP-1的增加,升高被降低的MMP-13含量,MMP-9、TIMP-2在酸诱导HSC-T6含量变化不明显。研究提示,ASIC1a参与HSCs功能和代谢过程,当酸刺激下,ASIC1a激活和通道开放,使HSC-T6细胞Ca2+内流增加,进而调节HSC-T6细胞生长和胶原分泌,其调节胶原代谢的过程还与MMP-13、TIMP-1的变化有关。4. MAPK信号通路在ASIC1a调节HSC功能中的作用建立酸诱导HSC-T6体外模型,采用ASIC1a非特异性阻滞剂Amiloride、ASIC1a特异性阻滞剂PcTX1、p38MAPK阻断剂SB203580、ERK1/2阻断剂PD98059干预,考察MAPK信号通路在ASIC1a调节HSC功能中的作用。研究结果显示,ASIC1a激活可影响大鼠HSC-T6细胞磷酸化p38MAPK和磷酸化ERK1/2蛋白表达;Amiloride、 PcTX1、p38MAPK阻断剂SB203580、ERK1/2阻断剂PD98059不同程度抑制p38MAPK和磷酸化ERKl/2蛋白表达；进一步研究发现,p38MAPK阻断剂、ERK1/2阻断剂不影响酸诱导HSC-T6细胞中Ca2+的流入,但p38MAPK阻断剂、ERK1/2阻断剂均能降低collagen I mRNA的表达,其调控机制与p38MAPK调控MMP-13、ERK调控TIMP-1的表达水平有关。结果提示胞外酸化激活ASIC1a通过激活Ca2+依赖的ERK调控TIMP-1的代谢和Ca2+依赖的p38MAPK调控MMP-13的代谢发挥HSC-T6胶原代谢的调节作用。小结：肝组织、HSC细胞中存在ASICla表达,模型组大鼠肝组织、HSC细胞ASICla表达升高；阻滞ASICla对肝纤维化有保护作用；ASICla参与HSCs功能和胶原代谢过程,当ASICla激活时,可增加HSC的Ca2+内流,进而促进HSC细胞因子TGB-∞1生成和胶原分泌,同时TIMP-1上调,MMP-13下降,抑制胶原降解；MAPK信号通路参与ASICla调节HSC胶原代谢的过程。
佚名[3]2002年在《中华医学杂志2002第82卷主题词索引》文中认为以汉语拼音为序 )Ａ阿尔茨海默病 阿尔茨海默病患者神经细丝ｍＲＮＡ含量及突变的检测 (汪义朋 ,王群 ,王建枝 ) (8) :5 19 5 2 2 石杉碱甲治疗阿尔茨海默病的有效性和安全性的多中心双盲随机对照试验 (张振馨 ,王新德 ,陈清棠等 ) (1
参考文献：
[1]. AT_(1a)mRNA在大鼠肝脏星状细胞中的表达及对肝脏纤维化作用机制的研究[D]. 张艺军. 第一军医大学. 2001
[2]. 酸敏感离子通道1a在肝纤维化星状细胞中的表达、作用及机制研究[D]. 吴繁荣. 安徽医科大学. 2013
[3]. 中华医学杂志2002第82卷主题词索引[J]. 佚名. 中华医学杂志. 2002