司端运[1]2001年在《藤黄灰链霉菌发酵液中次生代谢产物的研究》文中研究说明藤黄灰链霉菌（Streptomyces luteogriseus）是从土壤中分离出来的放线菌，其WC670号菌株的发酵液具有糖苷酶抑制活性。将发酵液经过提取和初步分离，得到次生代谢产物的有效部位称为WC670。WC670对甜菜等糖料作物显示出了良好的增糖效果；酶动力学实验发现对蔗糖转化酶和α-淀粉酶具有抑制作用；初步化学研究表明为一非常复杂的氨基寡糖类混合物，其中可能含有已知的α-淀粉酶抑制剂异戊他定类化合物。预计在农业和治疗糖尿病和肥胖症等方面具有开发潜力。 本论文的主要目标是利用现代高通量化学筛选技术，结合传统的化学结构研究方式，阐明WC670的化学组成；通过生物转化研究，丰富有关氨基寡糖类化学成分药物代谢方面的资料，也为简化氨基寡糖类复杂混合物的化学组成、促进WC670的深入开发提供思路和策略。 一、异戊他定系列化合物化学结构的深入研究 采用LC/MS技术研究WC670的化学组成，确认含有6个已知的异戊他定系列化合物。但在仔细分析它们的结构研究资料时，发现文献所建立起来的化学结构尚存在明显问题。以Spherisorb C_8柱（300×8.0mm，10μm）为固定相，不同比例的乙腈-1.5mmol/L氨水为流动相，206nm下检测，对收集到的色谱峰流分进行冷冻干燥，首次分离纯化出全部6个异戊他定已知化合物的单体。通过质谱分析和葡萄糖淀粉酶催化的水解反应特点，确定了结构的组成单元及其连接顺序；通过核磁共振光谱分析以及理化性质测试，分别修正了结构中的异戊酸应该与D单元葡萄糖的6位羟基连接成酯、存在还原性的葡萄糖末端、结构中的苷键全部呈α-（1→4）连接形式等，最终建立起了它们的准确结构，并重新命名为异戊他定M03、M13、M23、D03、D13、D23。 在结构修正工作的基础上，初步总结出了异戊他定类化合物的结构与色谱行为、电喷雾离子化质谱行为以及核磁共振光谱特征之间的规律，为进一步进行WC670的化学组成研究奠定了基础。 二、藤黄灰链霉菌发酵液中次生代谢产物的化学组成研究 采用LC/MS技术分析WC670样品时，发现除了已知的6个异戊他定化合物外，还存在葡萄糖个数、葡萄糖单元的连接顺序、伪叁糖个数以及酯侧链形式等发生变化的成分。将几种变化因素进行组合，计算出可能存在组分的分子量和质谱检测时准分子离子及碎片离子的质荷比数值。以Spherisorb C_8柱（200×4.6mm，5μm）为固定相，乙腈-1.5mmol/L氨水（15∶85，v/v, 0.5ml/min）为流动相，n 藤黄灰链霉菌发酵液中次生代谢产物的研究设定质谱参数，对预测组分逐一检测。分析各色谱峰的保留时间和相应Cio质谱图的特征碎片离子，发现WC670中至少含有异戊酸酯、丁酸酯、异己酸酯和异己烯酸酯侧链的4大系列138种服绒类成分，其中132种是首次鉴定出的新化合物，推测出它们的可能结构，并分别命名为异戊他定类osovalertatins＊丁他定类比 人异己他定类＊sohex…s）和异己烯他定类Osohex聊－tatins）。通过Cio质谱图的离子强度数值，初步评价WC670中以 sed碳酯侧链、l《个伪叁糖、伪叁糖左侧为0—3个葡萄糖以躺叁糖右侧3个葡萄糖时组合出的化合物为主要成分。 为了验证化学筛选结果的准确性，l从 WC670中制备出 ＊ 个新化合物的单体，通过核触振光谱分析等手段确认了它们的结构分别为异戊他定M33、异戊他定D33、异戊他定D43、异戊他定T03、异戊他定T13、丁他定M03、T他定M13、异己他定M33、异己他定M43、异己他定D23和异己他定D43，均与LCMS分析所提示的化学结构相一致。 分析比较 13 8种眼黝类成分在 CS反才柱上的色飘为，与化学结构之间存在如下的规律：O酯侧链对色渐为的影响最大。侧链中每增加 1个CHZ，化合物的保留能力大大增强，保留时间延长。②伪叁糖和葡萄糖的数目增加，分子的极性加大，保留时间缩短。③位置异构体能得到较好的分离。当葡萄糖由连接于伪叁糖右侧改变到左侧时，保留时间缩短。 氨基寡糖化合物以色谱流动相溶解后进行ESI－MS分析，主要得到准分子离子峰［M＋H 椭二个以上仲胺结构的化合物，还可以出现叭2切 峰。对仰卜田”和仰刊m”断CID分析，所得到的碎片离子都能够用于结构解析。分析比较138种撼髓类成分的Cio质谱图，总结出质谱断裂规律：①主要存在由于一个糖苦键或伪糖苦键断裂，产生包含有仲胺基团的碎片离子。②对阶二田h赫 cro分析时，可以产生带二个正电荷的碎片离子。＠鸡纳糖苦键易发生断裂，伪糖普键次之，葡萄糖旮键再次。鸡纳糖苦键断裂形成的碎片离子往往构咸Cio质谱图中的最强峰，容易识别，是解析各组成单元之间连接顺序的主要依据。④碎片离子o刁 厂说明结构中存在非还原性六碳糖末端，［M们I 厂说明存在还原性的六碳糖末端，阶H上 厂和 d 304说明伪叁糖连接于分子的最左侧。⑤母离子及丰蹦大的碎片离子容易脱水，产生减少18 U的碎片离子。 寡糖类化合物分子大，碳氢数目多，且多数为连接一个氧的脂肪碳氢结构，N’－－?
司端运, 钟大放[2]2006年在《藤黄灰链霉菌发酵液中寡糖类成分的微生物转化研究》文中指出藤黄灰链霉菌(Streptomyces luteogriseus)是从土壤中分离出来的放线菌,其WC670号菌株的发酵液具有糖苷酶抑制活性。将发酵液经过提取和初步分离,得到次生代谢产物的有效部位称为WC670。通过化学组成研究,发现WC670为一非常复杂的寡糖类混合物,采用液相色谱-质谱联用技术(LC／MS)检测到其中至少含有100多种组成成分。由于WC670中的化学组成过于复杂,这给制订质量标准、药效学研究、体内过程研究等进一步的新药开发工作带来障碍。本文采用微生物转化手段,研究WC670中已知寡糖类成分的生物转化方式。通过筛选实验,发现从土壤中分离出的菌株2829等对寡糖类化合物结构中非还原
牛晋阳[3]2003年在《新型抗生素AGPM高产菌株的选育及其蛋白质组学的研究》文中研究说明目前，抗肿瘤抗生素是世界药物研制与开发的热点。我实验室成功地从土壤中筛选到一能够分泌新型抗生素AGPM的菌株。对AGPM的抗肿瘤活性研究表明，它对小鼠白血病细胞L1210，非小细胞肺癌细胞PG-49的细胞毒性IC50值分别小于10-11 mol/L、10-12 mol/L，比目前临床上广泛使用的抗肿瘤药物紫杉醇和紫杉替尔的活性高出10～100倍；具有显着抗肿瘤活性。因此，AGPM作为抗肿瘤药物或先导化合物进行深入的研究和开发具有重要意义。然而，目前由土壤中得到的原始出发菌株其合成AGPM能力极其有限，只有7.8mg/L，无法得到足够的数量进行新药申报所必须进行的各项科学研究，所以采取各种方法来提高抗生素AGPM的产量是当前非常紧迫的任务。本文根据育种理论，对新型抗肿瘤抗生素AGPM生产菌种的选育、发酵法生产抗生素AGPM进行了系统的研究。主要研究内容和结果如下：首先以筛选得到的藤黄灰链霉菌099为出发菌株，经硫酸二乙酯（DES）和紫外线（UV）反复诱变处理，最终选育出了一株高产抗生素AGPM的突变株TD0551，该菌株在未优化条件下其抗生素AGPM产量可达到17.29mg/L，比出发菌株提高了122%。经验证，菌株TD0551的遗传性能十分稳定。研究了菌株TD0551的摇瓶分批发酵条件。应用正交设计理论确定了最佳种子培养基和培养条件以及最佳的发酵培养基和发酵条件。在最适发酵条件下，菌株TD0551摇瓶分批发酵的抗生素AGPM产量可达到23.16mg/L，比初始条件（17.29mg/L）提高了33.9%。利用30L发酵罐进行了抗生素AGPM的发酵放大研究，在优化条件下，发酵罐中的AGPM产量可达到27.18mg/L。以30L发酵罐分批发酵试验数据为依据，对抗生素AGPM分批发酵动力学进行了研究，建立了形态学结构模型。该模型能较好地反映抗生素AGPM分批发酵过程。以分批发酵最优条件为依据，对菌株TD0551进行了补料分批发酵研究。在采用了最佳初糖浓度和进行葡萄糖和培养基全组分流加后，发酵液中抗生素AGPM产量达到30.94mg/L，比初始条件（17.29mg/L）提高了33.6%。在摇瓶和2L发酵罐中分别进行了添加氧载体和乳化氧载体对抗生素AGPM生产的影响。试验表明：加入适量氧载体或乳化氧载体大大改善了发酵液中的氧传递情况，使得菌体生长良好，而且发酵液中抗生素AGPM产量明显高于对照组。最高比对照组增加27.3%。并在发酵过程中考察了菌丝体形态和抗生素AGPM生产的关系。<WP=3>研究了向培养基中添加树脂对菌体生长和抗生素AGPM生产的影响，并确定了最佳的工艺条件，在最优工艺条件下，抗生素AGPM产量得到了最大幅度的提高，抗生素AGPM产量为35.82mg/L，比对照组产量增加了55%。首次运用蛋白质双向电泳研究了原始出发菌株与诱变高产菌株以及高产菌株在抗生素AGPM生产前期与生产旺盛期的蛋白质表达差异的研究，找到部分与抗生素AGPM合成可能相关的蛋白酶，并利用链霉菌2-D数据库初步鉴定出了一些与抗生素AGPM合成密切相关的蛋白酶。为了解抗生素AGPM的代谢途径和进一步提高抗生素产量提供了理论基础。
王志平[4]2004年在《抗HIV PR，CVB6麦拓莱霉素的分离、鉴定、活性及生物合成研究》文中指出本论文从本实验室具有抗枯草芽胞杆菌的藤黄灰链霉菌 099 出发,围绕其发酵液中抗菌活性成分麦拓莱霉素的分离纯化、结构鉴定、生理活性筛选、急性毒性、生物合成途径、计算机辅助药物设计 SYBYL 软件的模拟计算等进行了研究。 在抗枯草芽孢杆菌活性指导下,建立针对 099 发酵液中未知活性成分的分离手段,利用制备高效液相层析、大孔吸附树脂层析等方法成功分离到具有抗菌活性、结构新颖的先导化合物-麦拓莱霉素。采用高分辨快原子轰击质谱、多维高分辨核磁共振等现代波谱结构鉴定方法,鉴定出麦拓莱霉素为全新大环内酯结构。分子式为C32H44O9N2,分子量为 600.3,含有 1,4-二氧螺杂[2, 5]辛-6-烯结构单元和 2-氧杂-5-酰胺氮杂双环[3, 2, 2]壬烷结构单元。 对麦拓莱霉素的活性筛选表明:(1)对变异链球菌、枯草芽孢杆菌具有显着活性,MIC分别为 1.25μg/ml和 0.25μg/ml。(2)抗HIV蛋白酶(HIV PR)活性IC50为39.8μg/ml。(3)抗Coxsackievirus B6 病毒(CVB6)活性IC50为 231.1μg/ml,安全指数为 2.88;优于阳性对照病毒唑(IC50为 569μg/ml,安全指数为 1.75)。小鼠急性毒性LD50显示麦拓莱霉素为低毒性成分,1707mg/kg (ip.); 进行了13C稳定同位素(CH3-13COONa、13CH3-COONa、13CH3-13COONa)饲喂实验,判断出了麦拓莱霉素分子中碳骨架来源。标记后C-1、C-3、C-5、C-7、C-9、C-12、C-14、C-19、C-22、C-28 的13C-NMR自然丰度增加,ESI-MS同时加以分析佐证,说明它们来自标记的乙酸钠,确定麦拓莱霉素的碳骨架主要由 6分子乙酸以及 4 分子的丙酸活性单位构成,其余碳原子可能来自甲硫氨酸和葡萄糖衍生物。在已知麦拓莱霉素的生物合成途径基础上,对代表性的初级代谢产物-脂肪酸酯进行了有目的的分离,证明了该菌株中存在脂肪酸的代谢途径。 利用计算机辅助药物设计 CADD 加以研究中,利用 SYBYL 软件对其结构进行分子力学模拟和计算:14 元内酯环发生了高度扭曲折迭,其中的六元杂环为椅式构象,另一六元环为船式构象;麦拓莱霉素的最低分子能量为 128KJ/mol。 建立了麦拓莱霉素的多种分析检测方法,其中 HPLC 分析方法为:流动相:乙腈:水:异丙醇(65: 35:2);0.3 ml/min 流速,254nm 检测波长,麦拓莱霉素峰经质谱和二极管阵列(PDAD)检测,证明为单一峰组分。检测方法在 0.3-500μg/ml范围具有良好的线性、精确性、准确性和回收率。
车建美[5]2011年在《短短芽胞杆菌（Brevibacillus brevis）对龙眼保鲜机理的研究》文中提出本研究通过分析龙眼果实采后腐烂过程相关酶系的变化规律,探讨龙眼褐变和腐烂的机理,并筛选了龙眼保鲜微生物,研究了该保鲜微生物的生物学特性和保鲜机理,制备了龙眼微生物保鲜菌剂。主要研究结果如下:1龙眼保鲜微生物的筛选及相关生物学特性分析从本实验室已有菌种库中筛选到6株对龙眼腐生真菌和细菌均具有较好拮抗作用的菌株,其中短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX(Brevibacillus breivs FJAT-0809-GLX)对龙眼腐生细菌和真菌的抑菌效果最好,抑菌圈直径为15.87 mm,抑菌带为6.27 mm。对短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX培养条件的研究表明,该菌株培养的最适条件为:转速180 rpm、pH值7.0的培养基、250 mL叁角瓶装瓶量20-40 mL、培养48 h。对短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX的全基因组测序初步分析表明,该菌株的基因组规模为6 Mb,预测得到5666个基因,平均长度为933 bp,基因密度达到87.83%,基因组的GC含量为47.30%,具有177个菌株特异基因,这些基因的功能如何还有待于进一步的分析。2龙眼果实致腐机理的分析从细胞形态上看,龙眼外果皮结构未发生明显的变化,但内果皮细胞结构变化比较明显,从2级果实开始,内果皮开始发生破裂,4级和5级果实的内果皮细胞骨架完全发生瓦解,内果皮完全腐烂,有的部位还可以看到菌丝。综合龙眼果肉和果皮的腐烂特征,将龙眼果实划分为6个腐烂等级。随着腐烂程度的加深,龙眼果实的呼吸速率加快,0级龙眼果实呼吸速率为61.17 mg/kg·hr,4级的龙眼果实呼吸速率达到最大为382.71 mg/kg·hr。龙眼果实过氧化物酶(Peroxidase,POD)和多酚氧化酶(Polphenol oxidase,PPO)活性随腐烂程度加深也增高,腐烂程度达到5级的果皮POD酶活性最高,为15625 U/min·g,腐烂程度达到4级的龙眼果皮PPO酶活性最高,为687.5 U/min·g。而可溶性固形物(Total soluble solids,TSS)含量随腐烂程度加深却呈现降低的趋势。龙眼果实腐生细菌和真菌的分离和鉴定结果表明,烂果的真菌和细菌数量和种类均多于好果。腐生细菌主要包括藤黄微球菌(Micrococcus lutens)、科氏葡萄球菌(Staphylococus cohnii)、短芽胞杆菌(Brevibacillus choshinensis)和多粘类芽胞杆菌(Paenibacillus polymyxa);腐生真菌主要包括粉红聚端孢菌(Trichothecium roseum)和Neofusicoccum parvum。从龙眼果实腐生细菌和真菌的鉴定结果看,未分离到龙眼果实采后病原菌,说明采后病原菌的侵染不是龙眼果实腐烂的主要因素。3短短芽胞杆菌主要功能成分分析对短短芽孢杆菌FJAT-0809-GLX活性物质提取方法优化的结果表明,采用大孔树脂法和氯仿萃取法这2种方法提取的短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX活性物质的得率和抑菌效果有所不同,大孔树脂法提取的物质得率较高,为1.593 g/L,抑菌效果也最好,抑菌圈直径为27.33 mm。进一步对大孔树脂提取法各因素的优化表明,短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX活性物质收集的最佳方案为:将短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX发酵液常温3600 rpm离心30 min,取上清液,按比例与40 g/L大孔树脂AmberliteXAD16混合,28℃,160 rpm振荡4 h后,填柱,并用水洗柱后,采用3倍洗脱体积的丙酮洗脱,收集丙酮洗脱液,40℃旋转蒸发进行浓缩,所得物质即为短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX活性物质。短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX活性物质溶于二甲基亚砜、超纯水,不溶于石油醚。随着处理温度的升高,短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX活性物质的抑菌圈直径逐渐减小,在100℃条件下,抑菌圈直径最小,为18.17 mm。在100℃条件下处理0 h、2 h、4 h和6 h后,其抑菌效果逐渐降低,抑菌圈直径分别为20.47 mm、16.67 mm、15.42 mm和13.39 mm。随着pH值的增大,活性物质的抑菌活性有所降低,当pH=7.0时,抑菌圈直径为20.52 mm,当pH=11.0时,抑菌圈直径为18.46 mm。短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX活性物质对青枯雷尔氏菌、尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、茄形镰孢菌、苹果树腐烂病菌和苹果轮纹病菌等6种植物病原真菌都具有较强的抑制作用,对大肠杆菌K88和沙门氏菌ATCC14028这2种动物病原菌也具有一定的抑制作用,对大肠杆菌K88的抑菌效价为29.22 U/mL。短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX活性物质在叁氯甲烷、丙酮、乙醇和甲醇这4种不同有机溶剂中的共有功能成分包括10种,分别为邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯、双氢麦角胺、羟苯乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、绵马次酸、3-异丁基-六氢吡咯[1,2-a]吡嗪-1, 4-二酮、二乙基二硫代磷酸、3-苯甲基-六氢吡咯[1,2-a]吡嗪-1, 4-二酮、4-(乙酰苯基)苯甲烷和尼泊金丙酯。其中,羟苯乙酯和邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯的相对含量较高,对大肠杆菌K88都具有抑菌效果。羟苯乙酯的抑菌效果最好,与硫酸链霉素(5 U/mL)的抑菌效果相差不大(P﹤0.05),抑菌圈直径为17.81±0.28 mm,最低抑菌浓度为1.57 mg/mL,推测羟苯乙酯是其主要的抑菌功能成分。4短短芽胞杆菌保鲜机理的分析短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX活性物质对龙眼果实、鲜切苹果和台湾大青枣都具有很好的保鲜效果,对龙眼果实的保鲜率为87.50%,并且可以防止腐生菌的侵染,保持果实色泽,维持可溶性固形物的含量,保持果实的风味。短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX功能成分对龙眼果实腐生真菌和细菌抑菌能力有所不同。羟苯乙酯对腐生真菌和细菌的抑菌能力最大,抑菌圈直径在18.41 mm-31.06 mm之间。短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX活性物质对龙眼果皮POD酶活性具有一定的抑制作用,当其浓度为150 mg/mL时,抑制率最高,为9.57%。对其功能成分的抑制作用分析表明,在其中起主要作用的为羟苯乙酯,当其为50 mg/mL时,对龙眼果皮POD酶活力抑制率为25.69%,其次为麦芽酚和苯酚。不同浓度短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX活性物质对二苯代苦昧酰基自由基(DPPH·)均具有一定的清除作用,且在一定范围内短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX活性物质清除自由基的能力与其浓度呈明显的量效关系,当其浓度为100 mg/mL时,对DPPH·的清除能力最强,清除率最高为61.35%。在其中起主要清除作用的功能成分为麦芽酚,当其浓度为200 mg/mL时,清除率最高为68.35%。不同浓度短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX活性物质对羟基自由基(·OH)的清除率也有所不同,其中以7.5 mg/mL时的清除率最高,达到98.20%,在其中起主要清除作用的成分为羟苯乙酯,当其浓度为150 mg/mL时的清除率最高,达到68.38%。5龙眼保鲜菌剂的研究将2‰琼脂和2-5%的NaCl添加到龙眼保鲜菌发酵液中制备成龙眼保鲜菌剂,其活菌含量较高,胶悬剂效果最好,质地均匀,无上下分层。龙眼保鲜菌剂对龙眼果实具有较好的保鲜效果,常温条件下(温度28-32℃,湿度50-70%)贮藏5 d,龙眼保鲜菌剂处理的腐烂率低于对照,仅为32.67±1.20%,对“早钟六号”和“解放钟”枇杷果实也具有较好的保鲜作用,保鲜率在80%-90%之间。此外,该保鲜菌剂还可以降低龙眼和枇杷果实的失重率,防止腐生菌侵染,维持可溶性固形物含量,保持果实风味。在高温高湿条件下,该保鲜菌剂还对不同鲜切水果(西瓜、皇冠梨、苹果、草莓和台湾大青枣)也具有较好的保鲜效果,防止腐生菌的滋生,保持果实色泽和口味。
参考文献：
[1]. 藤黄灰链霉菌发酵液中次生代谢产物的研究[D]. 司端运. 沈阳药科大学. 2001
[2]. 藤黄灰链霉菌发酵液中寡糖类成分的微生物转化研究[C]. 司端运, 钟大放. 第八次全国药物与化学异物代谢学术会议论文摘要. 2006
[3]. 新型抗生素AGPM高产菌株的选育及其蛋白质组学的研究[D]. 牛晋阳. 天津大学. 2003
[4]. 抗HIV PR，CVB6麦拓莱霉素的分离、鉴定、活性及生物合成研究[D]. 王志平. 天津大学. 2004
[5]. 短短芽胞杆菌（Brevibacillus brevis）对龙眼保鲜机理的研究[D]. 车建美. 福建农林大学. 2011