湖南中医药大学附属宁乡医院神经外科 湖南宁乡 410600
【摘 要】目的：探讨在海人酸诱导的小鼠癫痫模型中，姜黄素对癫痫相关的炎症反应和海马神经细胞凋亡的影响。方法：ICR雄性小鼠36只，随机分为对照组、海人酸处理组（癫痫组）、海人酸处理+姜黄素治疗组。分别对3组小鼠海马组织中谷胱甘肽（GSH）含量、超氧化物歧化酶（SOD）含量、脂质氧化量（MDA）进行检测，并分析区域内GFAP阳性胶质细胞数量以及神经细胞的凋亡（TUNEL染色）程度。结果：与对照组相比，海人酸处理组小鼠海马组织内GSH和SOD含量显著下降，脂质氧化量（MDA）增加，胶质细胞过度活化，神经元凋亡增加。姜黄素治疗可显著逆转海人酸诱导的海马区GSH和SOD含量的下降，抑制MDA增加，并可减少神经细胞的凋亡。结论：姜黄素可能通过抑制神经炎症反应而抑制海马因海人酸诱导的癫痫相关性神经细胞凋亡。
【关键词】姜黄素 海人酸 癫痫 炎症反应 神经细胞凋亡
Curcumin prevents hippocampus neuronal apoptosis by inhibiting neuroinflammation in Kainic Acid induced epilepsy model
Abstract：Objective：to study the function of curcumin in anti- neuroinflammation and neuronal apoptosis in Kainic Acid induced epilepsy mouse model. Method：36 ICR male mice were randomly divided into three groups（control group，Kainic Acid group and Kainic Acid+curcumin group. The expression of gonadotropin stimulating hormone（GSH）and the superoxide dismutase（SOD）activity in hippocampus were detected by spectrophotometry. The content of Malondialdehyde（MDA）was measured by thiobarbituric acid reactive substances（TBARS）. GFAP immunostaining and TUNEL staining were applied to detect astrocyte and neuronal apoptosis. Result：Kainic Acid caused an increase in MDA content，neuronal cell death and?astrocyte number，while a decrease in GSH expression and SOD activity in mice hippocampus. Curcumin treatment rescued the increase in MDA content and the decrease of GSH expression and SOD activity in Kainic Acid injected mice. Curcumin also show neuronal protective function by preventing neuronal death in Kainic Acid induced epilepsy mice model. Conclusion：curcumin could prevent hippocampus neuronal death by inhibiting neuroinflammation in Kainic Acid induced epilepsy model
Key words：curcumin，Kainic Acid，epilepsy，neuroinflammation，neuronal apoptosis
根据世界卫生组织的统计数据，癫痫是神经系统最常见的疾病之一，其中以颞叶癫痫最为常见，表现为颞叶神经高兴奋性以及正常神经环路的破坏1。针对临床手术标本的研究发现颞叶病理改变多以海马硬化为主，并伴随椎体神经元数目的减少2。虽然动物癫痫模型广泛应用于疾病的机制研究，并证实了这一癫痫导致神经细胞凋亡的异常改变，然而具体分子机制仍不明确3。
本实验使用海人酸诱导的小鼠颞叶癫痫模型，研究癫痫的发生与神经细胞凋亡之间的关系，在初步探讨其分子生物学机制的基础上，证明了姜黄素可有效的抑制神经细胞的调亡。海人酸，又称红藻氨酸或海藻氨酸，是从一种天然海藻中提取的兴奋性氨基酸-谷氨酸的结构类似物（其神经兴奋作用比谷氨酸强30～100倍）。小鼠侧脑室内海人酸注射可引起典型的癫痫发作以及海马CA1，CA3区神经细胞的变性和凋亡4,5。而于此同时，海人酸可通过于作用于海人酸受体结合，诱导细胞产生大量活性氧物质和活性氮物质（ROS和RNS）6，提示海人酸所诱导的海马区神经细胞损伤可能与异常的氧化应激反应密切相关。据此，在海人酸诱导的小鼠颞叶癫痫模型中，我们检测了颞叶海马组织中一系列炎性应激指标，如谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）以及脂质氧化量（MDA）等，并进一步分析了海马区胶质细胞的增生程度（GFAP染色）以及神经细胞的凋亡程度（TUNEL染色），实验结果发现癫痫导致的局部神经细胞的变性与凋亡可能为过度的炎性应激反应所致。针对这一机制，此外，我们还发现姜黄素可以有效的减低炎性应激反应，从而对癫痫所导致的神经细胞凋亡及胶质细胞异常增生具有显著的治疗作用。姜黄素是一种具有抗炎及神经保护作用的天然植物提取物7，其机构如图一所示。有研究显示姜黄素可以有效的抑制炎性因子（如肿瘤坏死因子TNFa）和前列腺素的释放8,9，并进一步抑制下游的NF-κB型号通路的激活，避免炎性级联反应的发生10，从而抑制胶质细胞和小胶质细胞的增生11,12。
1 材料与方法
1.1 材料
ICR健康雄性小鼠36只（体重22-28g），购于上海斯莱克实验动物中心，随机分为对照组、海人酸处理组（癫痫组）、海人酸处理+姜黄素治疗组。每组12只。海人酸购于美国sigma公司，TBARS试剂盒购自Cayman公司，GSH含量和SOD活力测定试剂盒购自南京建成生物公司，GFAP抗体购自美国Abcam公司。
1.2 方法
1.2.1 制模与给药
小鼠以氯氨酮+安定（氯氨酮：8mg/kg；安定：2mg/kg）麻醉，固定于脑立体定仪上，用10ul微量注射器于前囟位点刺入颅骨下2.4mm，注入海人酸（10mg/kg；浓度：0.02mg/ml生理盐水），速度为0.5ul/min。注射海人酸后留针2分钟后退出微量注射。对照组注射生理盐水。小鼠癫痫模型制备完成24小时后，对照组和海人酸处理组（Kainic Acid组，以下简称KA组）予以生理盐水腹腔注射。海人酸处理+姜黄素治疗组（KA+curcumin组）予以姜黄素腹腔注射治疗（200mg/kg），连续三天。
1.2.2 取材
生理盐水或姜黄素腹腔注射三天后，各组取6只小鼠用于TUNEL染色和GFAP染色。小鼠以水合氯醛麻醉，依次用生理盐水和4%多聚甲醛经心脏灌注，解剖去除小鼠大脑并置于4%多聚甲醛中过夜。经30%蔗糖脱水至沉底后，取前囟后1-2.5mm行冰冻切片，切片厚10μm。各组剩余6只小鼠，于冰上解剖出双侧海马组织放入-80oC冰箱保存，用于GSH含量、SOD含量和MDA的检测。
1.2.3 TUNEL染色 切片经PBS和Coplin jars 洗涤三次。加入50 μl的TUNEL cocktail和40μl的标记溶液（对照测放入40ul PBS），于37oC避光孵育60 min。经PBS和Coplin jars洗涤三次后封片，荧光显微镜下记数海马CA3区调亡神经元数量。
1.2.4 GFAP染色 用1% BSA、22.52 mg/mL甘氨酸的PBST（PBS + 0.1% Tween 20）孵育30分钟。用稀释GFAP抗体（1：1000，溶于1%BSA的PBST中）在湿盒中4℃过夜孵育。次日倒出溶液，用PBS洗涤切片3次。室温下，用二抗（溶于1%BSA中）避光孵育细胞1小时。弃二抗溶液，用PBS避光洗涤3次后封片，荧光显微镜下观察。
1.2.4 海马组织GSH、SOD和MDA量的测定（1）组织均浆的制备：取海马组织组织块重量9倍体积的匀浆介质（pH 7.4，0.01mol/L Tris-HCl，0.0001mol/L EDTA-2Na，0.01mol/L蔗糖，0.8%的氯化钠溶液）加入海马组织，用眼科小剪尽快剪碎组织块（置于冰水浴中），然后用匀浆器充分研碎。将制备好的10%的匀浆用低温离心机2000r/min离心12分钟，取上清。（2）严格按试剂盒说明书测上清液中GSH、SOD和MDA的含量。
1.3 统计学方法
用SPSS 17.0软件对TUNEL凋亡细胞数，海马GSH、SOD和MDA的含量行方差分析和SNK-q检验。
2 结果
2.1 海人酸可诱导小鼠海马组织内炎症应激反应
对小鼠海马GSH、SOD和MDA的含量的测定显示，与对照组相比，KA组海马SOD和GSH含量显著下降，而MDA含量显著上升（P<0.05），见图（2）。该结果显示海人酸可诱导小鼠海马组织内炎症反应的异常激活。与此同时，GFAP染色显示KA组小鼠海马CA3区GFAP阳性细胞计数显著增加（P<0.05），见图（3）。结果提示胶质细胞过度增生，进一步证明了海人酸对小鼠海马组织内炎症反应的直接诱导作用。
图4：姜黄素可有效的抑制海人酸诱导的小鼠海马组织内的神经元凋亡
3.讨论
癫痫作为最常见的神经系统疾病，全球患病人数约为3900万，其中发展中国家约占80%的病例数13。癫痫的病因多样，如脑创伤，脑卒中，脑肿瘤以及中枢神经系统的感染14。然而，约60%的癫痫起病无明确病因15。作为发病率最高的一种中枢神经系统疾病，约70%的患者可以使用药物加以控制癫痫，其余顽固性癫痫的患者或将接受外科手术治疗16。值得注意的是，除癫痫自身可以导致严重的神经认知或精神活动障碍外，长期癫痫反复发作还可导致局部胶质细胞增生和神经元凋亡，其中以颞叶癫痫表现最为显著17。虽然目前对这一现象的研究较少，具体机制仍然不完全明确，担有证据显示，抑制胶质细胞增生和神经元的凋亡，对控制癫痫相关的神经精神活动异常具有显著作用18。
本研究利用海人酸成功的建立了小鼠颞叶癫痫模型，并通过对GSH、SOD和MDA的含量的测定，证实了颞叶海马区域组织内炎症应激反应显著活化，并通过GFAP染色发现，海马CA3区的胶质细胞显著增生。通过对癫痫小鼠脑组织的TUNEL染色发现，局部神经元凋亡数量显著上升，可能导致进一步的神经认知功能的障碍。既往有研究显示姜黄素作用为一种从姜黄根茎中提取的小分子物质，具有抗炎症反应（主要通过抑制TNFa和前列腺素的释放）8,9和神经保护的作用11,12，因此我们在本研究中进一步探索，姜黄素是否对癫痫相关的炎症反应和神经元凋亡具有治疗作用，结果显示姜黄素可以有效的抑制小鼠海马区的应激性炎症反应，表现为姜黄素干预的癫痫小鼠海马区MDA值较未干预癫痫小鼠显著增加，而GSH和SOD值显著降低，通过对海马区GFAP的染色发现癫痫相关的胶质细胞增生水平显著下降，且TUNEL染色结果显示，姜黄素对癫痫小鼠海马CA3区的神经元凋亡具有显著的抑制作用。以上研究结果具有重要意义，对于临床上癫痫的药物治疗策略提供了新的理论已经，即在抗癫痫药物应用的同时，辅以如姜黄素等炎症抑制剂和神经保护剂，将对癫痫的治疗起到积极的作用，对癫痫患者神经认识，高级精神活动的改善具有显著意义。
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基金项目：2014年，湖南中医药大学青年教师基金项目：编号：201403
第一作者及通讯作者：文帅，男，1984年8月出生，湖南中医药大学附属宁乡医院神经外科主治医师，主要从事脑血管病及神经保护方面研究。
论文作者:文帅,刘亮,王浩,阮福强,陈龙,张继辉,胡艺,
论文发表刊物:《兰大学报（医学版）》2018年8期
论文发表时间:2018/11/26
标签：癫痫论文; 小鼠论文; 姜黄论文; 神经细胞论文; 凋亡论文; 胶质论文; 诱导论文; 《兰大学报（医学版）》2018年8期论文;