吴旺泽[1]2004年在《马铃薯花粉原生质体分离与培养》文中研究说明实验采用6个优良四倍体栽培种和3个双单倍体不同发育时期的花粉为供试材料，研究花粉原生质体分离与培养的技术体系，取得如下结果：1.对不同发育时期的花粉经低温和甘露醇处理后，进行培养，其中单核期幼嫩花粉培养后脱分化频率达4.1%，具有孢子体发育的巨大潜力。四分体时期的花粉培养后不能启动分裂；成熟花粉培养后易趋向于配子体发育方向。2.四分体时期的花粉经低温处理5~7d后，在0.3mol/l的蔗糖做渗透压调节剂，1%蜗牛酶+0.5%崩溃酶+1.2%纤维素酶的混合酶液中，四分体原生质体分离率最高达74.2%，在K3改良培养基+1mg/l 2,4-D+0.2mg/l 6-BA+1mg/l NAA+800 mg/l谷氨酰胺+100mg/l丝氨酸+0.1%小牛血清的培养基中培养1d后再生细胞壁，2~3d后再生细胞壁的原生质体启动第一次分裂，分裂频率最高达14.2%，培养10~15d后，无组织生长的细胞最后增殖生成细胞团。3.单核期幼嫩花粉先经饥饿处理，再经低温水合、高温热激、渗激多步冲击的方法制备了马铃薯脱外壁花粉，Favorita最高脱壁率达34.5%；对脱外壁花粉进行了离体人工萌发，最高萌发率达38.3%。脱外壁花粉在0.6mol/l甘露醇+0.2mol/l山梨醇做渗透压的酶液中，花粉原生质体最高分离率达24.3%，质体培养１~2d后再生细胞壁，3d后再生细胞壁加厚，个别原生质体膨大后表现出孢子体发育迹象。4.马铃薯花粉离体萌发研究结果表明，在10%蔗糖+10%PEG（8000）+0.02%Ca(NO3)2+0.02%H3BO3+0.5mmol/l K+的培养基上马铃薯花粉萌发率最高达83.4%，添加低浓度的Na+,6-BA能促进花粉萌发和花粉管伸长。5.针对马铃薯成熟花粉的特点建立了“低温—萌发—酶解”的花粉原生质体分离方法。低温处理5~7d的材料，在萌发液中萌发30min后在0.8mol/l甘露醇+0.2mol/l山梨醇渗透压调节剂下，在添加有K3培养基大量和微量元素或13mol/l的CPW盐离子的酶液中，原生质体分离率达24.7%。6.当花粉管长到约2~3mm后，转入酶液后1~2h就可观察到花粉粒发生质壁分离，4~5h后花粉管亚原生质体被释放。花粉管亚原生质体大小差别较大，大的直径约50~60μm，小的约10μm，刚分离的亚原生质体易自发融合，培养1d后再生细胞壁。
张峰[2]2001年在《马铃薯花粉原生质体的分离与培养》文中提出花粉原生质体兼具单倍体与原生质体的双重优点，可直接作为产生单倍体植株和细胞融合的原始材料，省去降倍操作，在马铃薯细胞工程育种中具有重要意义。 本研究以6个优良四倍体栽培种和3个双单倍体的不同发育时期的花粉为供体材料，对花粉原生质体分离与培养的技术进行了研究。在蔗糖作为渗透压调节剂，蜗牛酶浓度为1.2％的混合酶液中，四分体原生质体的分离率最高达84.6％。低温处理7天后的花粉为材料，分离原生质体，在分别添加100mg/L的丝氨酸、800mg/L的谷氨酰胺和0.1％的小牛血清以及1mg/L 2，4-D，0.5mg/L KT，0.4mg/L 6-BA外源激素的K_3培养液中，培养24h后，原生质体再生细胞壁，48h右，再生细胞启动第一次分裂，分裂频率最高达15.4％。继续培养15d左右，部分细胞增殖生成细胞团。 用花药漂浮培养法作为酶解前的预处理，将从花药释放培养1d后的花粉酶解，在0.8mol/L的甘露醇作渗透压调节剂的混合酶液中，单核期幼嫩花粉原生质体的分离率达12.8％。 对马铃薯花粉离体萌发的影响因素进行了研究，萌发液中添加0.1mmol/L K~+，1.0mmol/LMg~(2+)对花粉萌发率有显着促进作用；添加0.15mmol/L的Na~+能加快萌发速度，但对提高萌发率无效。在10％蔗糖，0.02％ CaCl_2，0.02％H_3BO_3，0.02％MgSO_4·7H_2O，0.01％KNO_3的液体培养基上，花粉萌发率达70％以上。 建立了“低温-萌发-酶解”马铃薯成熟花粉原生质体分离技术路线。用低温处理7d的花粉，萌发30min时加入酶液，以1.2mol/L的甘露醇作渗透压调节剂，原生质体的分离率最高达21.04％。萌发时间大于120min，花粉原生质体的分离率下降为16.05％，而亚原生质体的分离率为5.35％。对花粉原生质体与花粉管亚原生质体的培养中发现成熟花粉诱导脱分化困难；花粉管亚原生质体有很强的细胞壁再生能力和自体融合倾向。 对超低温保存花粉的冻存、复苏方式以及复苏后花粉的生活力进行了研究，并分离花粉原生质体。在冷冻前，18h的干燥时间保存花粉的生活力优于干燥12h和6h的花粉；超低温保存的花粉在-20℃－4℃－25℃的水浴锅里逐步解冻效果最好，快速化冻方式对马铃薯花粉也适宜，35℃的解冻温度优于25℃；用ZF萌发液将花粉先萌发，再用分离新鲜花粉原生质体的酶液和技术将花粉酶解，保存90d的花粉，原生质体分离率为16.21％。尽管保存花粉的生活力较新鲜花粉生活力有所下降，但经解冻复苏后仍能作为原生质体分离的材料，与新鲜花粉原生质体的分离率差异不显着。 本研究对马铃薯花粉原生质体进行了较为详细的研究，建立了不同发育时期 甘肃农业大学硕士论文 马铃薯花涵原生质体的分离与培养 中文摘要 一 花粉原生质体分离的技术路线，并进行了培养研究，结果证实所建立的技术路线具 有普遍适应性。
王蒂, 司怀军, 王清[3]1999年在《马铃薯花粉原生质体分离的研究》文中研究说明以马铃薯减数分裂二分体和四分体时期的小孢子为材料， 对原生质体分离的主要影响因素进行了研究。结果表明， １ ％ 蜗牛酶和０ ．５ ％ 崩溃酶的混合酶液游离效果最好， 原生质体的最高得率达６５．４ ％ 。渗透压调解剂以蔗糖最好， 甘露醇次之， 最适浓度分别为１６％和１８％ 。０ ．１ ％ 荧光增白剂检测表明脱壁完全， ＦＤＡ 荧光检测表明花粉原生质体具有生活力。
张峰, 王蒂, 王玉萍[4]2004年在《马铃薯成熟花粉原生质体分离》文中研究说明初步研究了马铃薯成熟花粉原生质体的分离条件,首次采用“低温-萌发-酶解”叁步法从马铃薯成熟花粉中分离出原生质体。其分离途径是:经6℃低温处理的成熟花粉在萌发液中萌发出短花粉管时转入酶液。在酶液作用下,花粉发生质壁分离,花粉管脱落,随后原生质体缓慢地从花粉管断裂处挤出。在萌发30 min和1.0 molL-1甘露醇渗透压下,原生质体分离效果最佳,分离率最高达19.40%。用0.1%荧光增白剂检测脱壁完全,FDA荧光检测表明花粉原生质体具有生活力。
牛瑜菲[5]2010年在《枣及酸枣原生质体分离与花药培养的研究》文中认为枣是鼠李科枣属植物,是原产我国的重要果树资源。本研究以酸枣、赞皇大枣、苹果枣和骏枣的花药为试材,对影响花药培养的适宜时期、预处理、蔗糖浓度以及植物生长调节剂进行研究,获得花药的再生植株。以酸枣组培苗叶片、嫩茎、花药为试材,诱导愈伤组织,得到最佳植物生长调节剂组合;以酸枣花粉和悬浮细胞系为材料分离原生质体,找到适宜的酶解组合,酶解时间以及甘露醇浓度。为倍性育种奠定前期基础。主要研究结果如下:1.获得花药再生植株(1)通过形态学和细胞学观察,确定小孢子各发育时期与花器官外部形态特征的关系。花药培养的最佳时期为单核靠边期,此期花蕾为黄绿色,花药为淡黄色。(2)低温处理不同时间对酸枣、苹果枣和赞皇大枣花药有明显影响,处理之间存在显着差异(P<0.05)。酸枣低温处理7 d,诱导率和分化率最大,而处理3 d有利于再生;苹果枣低温处理3 d,诱导率最大,而处理5 d和7 d有利于愈伤组织的分化和再生;赞皇大枣花药处理3 d,诱导率和分化率均达到最大。低温处理对骏枣花药无影响。(3)甘露醇处理对酸枣、苹果枣和赞皇大枣花药有影响,处理之间存在显着差异(P<0.05)。酸枣和苹果枣花药在甘露醇中处理3 d,诱导率达到最大;赞皇大枣花药在甘露醇中处理4 d,诱导率最大。骏枣花药对甘露醇处理作用不明显。(4)酸枣和赞皇大枣在蔗糖浓度为6%时,有利于愈伤组织的诱导;骏枣在蔗糖浓度为9%时,有利于愈伤组织的诱导。(5)适于诱导花药愈伤组织的基本培养基为MS+TDZ+NAA+30 g/L蔗糖+6 g/L琼脂,不同基因型TDZ和NAA的浓度不同,TDZ 0.5 mg/L和NAA 0.5 mg/L适于骏枣和赞皇大枣花药培养,TDZ 0.5 mg/L和NAA 1.0 mg/L适于酸枣花药培养,TDZ 1.5 mg/L和NAA 0.5 mg/L适于苹果枣花药培养。试验得到酸枣再生苗25株,赞皇大枣5株,苹果枣2株,骏枣2株。2.愈伤组织的诱导和调控酸枣花药诱导愈伤组织效果较好。适于酸枣叶片诱导愈伤组织的培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+30 g/L蔗糖+6 g/L琼脂。适于愈伤组织继代的培养基为MS+TDZ 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L+CH(600 mg/L)+Gln(300 mg/L)+ME(500 mg/L)+30 g/L蔗糖+6 g/L琼脂,悬浮培养基为不加琼脂的继代愈伤的培养基。3.原生质体的分离(1)酸枣花粉四分体原生质体分离酶液为,蜗牛酶(1.0%)+纤维素酶(0.5%)+甘露醇0.3 mol/L+0.1% MES,酶解4 h效果最佳。(2)酸枣叶片愈伤组织悬浮细胞系原生质体分离酶液为,纤维素酶(10 g/L)+离析酶(5 g/L)+甘露醇0.7 mol/L+0.1% MES,酶解时间16 h效果最佳。
张宁, 李威, 顾钊宇, 陈秋菊, 段续伟[6]2015年在《‘富士’苹果花粉原生质体分离初探》文中提出以‘富士’苹果(Malus×domestica Borkh.‘Fuji’)成熟花粉为试材,采用"萌发—酶解二步法",初步探讨了影响原生质体分离的关键因子,获得了花粉原生质体分离的最佳条件:用萌发后45 min的花粉,转入含1%纤维素酶和1%离析酶的混合酶液中,以18%甘露醇调节渗透压,静置酶解6 h,花粉原生质体分离效率可达6.83%,用0.1%荧光增白剂检测表明脱壁完全,用0.01%FDA检测表明其具有生活力,可以作为后续细胞融合等的材料。
王玉萍[7]2000年在《马铃薯小孢子原生质体游离与培养的研究》文中研究表明小孢子原生质体兼具单倍体和原生质体的双重忧点，是植物细胞工程中一种特殊的实验体系，并可作为马铃薯“分解-综合育种”方案中的一个重要组成部分。本实验以3个优良四倍体栽培种甘农薯1号、甘农薯2号、甘农薯3号以及1个双单倍体81-15的不同发育时期的小孢子（四分体、单核花粉、成熟花粉粒）为供体材料，初步研究了小孢子原生质体游离与培养的基本条件及影响因素。结果表明：（1）用1％蜗牛酶+1.2％纤维素酶+0.8％半纤维素酶的酶类组合能高频率地游离出“甘农薯1号”，“甘农薯2号”，“甘农薯3号”以及“81-15”的四分体原生质体，最高游离率分别达75.17％，71.43％，78.05％以及54.19％；（2）单核期的幼嫩花粉不能游离出原生质体；（3）用“低温-萌发-酶解”叁步法游离出“甘农薯1号”，“甘农着2号”以及“甘农着3号”的成熟花粉原生质体，最高游离率为10.12％，9.70％和17.71％；（4）在四分体原生质体游离过程中用蔗糖作渗透压调节剂，最适浓度10.3％，而从成熟花粉中游离原生质体则用甘露醇做渗透压调节剂效果较好，最适浓度为18.2％；（5）30min的萌发时间最适于游离成熟花粉原生质体；（6）适当降低酶浓度，有利于减少原生质体的破碎及后期培养过程中多核现象发生，有利于提高原生质体的活力；（7）酶液中添加各种保护剂（MES，PDS，PVP）对减少原生质体的破碎和褐化现象，提高其活力具有一定效果。 对小孢子原生质体培养的研究结果表明：（1）在原生质体培养液中加2，4-D1.0mg/L，KT 0.5mg/L，6-BA 0.4mg/L；去除NH_4~+，NAA能提高四分体原生质体的稳定性，降低后期培养过程中的出芽率，提高分裂频率；（2）高Ca~(2+)和高H_2PO_4~-浓度的K_3培养基和“药壁因子”的加入显着提高 了低密度（IX10’个／ml）四分什原生质体的分裂频率；（3）花蕾低温预 处理对于四分体原生质体的脱分化以及诱导其分裂起了重要作用，在液体 浅层培养中，使植板密度为 IX！0‘个／mL培养细胞的分裂频率达到’ 12石％：（4）在蔗糖密度梯度离心中，位于20％蔗糖液面的四分体原生质 体较位于25％蔗糖液面的启动分裂所需的时问短，原生质体持续分裂能力 强；（5）成熟花粉原生质体在培养中不能诱导分裂；（6）在原生质体的 培养过程中，对四分体原生质体用固液双层培养法和液体浅层培养法效果 好，细胞持续分裂能力强：（）花药愈伤组织与四分体原生质体基因型差 异较小的的看护作用明显，反之效果较差。
王蒂, 张宁, 司怀军[8]2004年在《马铃薯原生质体培养和体细胞杂交的研究》文中认为简述了近10几年来我们在马铃薯原生质体培养和体细胞杂交方面所取得的一些研究结果,着重介绍了一些关键性的技术问题,并对今后的发展方向进行了讨论。
王蒂, 司怀军, 王清[9]1999年在《马铃薯花粉四分体原生质体的分离》文中进行了进一步梳理花粉原生质体具有单倍体与原生质体的双重优点，是植物性细胞工程中的重要实验体系。７０年代初期，有些学者就开始了花粉原生质体的研究，但由于受到支术上的限制，直到８０年代中后期才有所突破。目前，已从烟草、棉花、百合科、石蒜科、芸薹属等数十种植物的花粉分离得到了
姜丽静[10]2008年在《马铃薯花药培养影响因素的研究》文中认为试验对34个不同的马铃薯品种(系)进行花药培养,研究马铃薯基因型、激素种类、花粉发育时期、以及培养基附加物硝酸银、活性炭、马铃薯提取液等因素对马铃薯花药愈伤组织诱导率及褐化率的影响;同时对马铃薯花药培养获得的再生植株进行细胞学鉴定;并对获得的双单倍体进行了农艺性状鉴定。试验结果如下:1小孢子处于单核靠边期时,花蕾大小6.0～7.5 mm左右,颜色为浅绿色,此时适于马铃薯花药培养。2马铃薯花药培养对基因型有很大的依赖性。克新13的愈伤组织的诱导率高是7.4%,大地叁号和尤金的愈伤组织的诱导率为0。3低温预处理和热激处理均能明显地提高马铃薯愈伤组织的诱导率。克新16在4℃条件下处理4d效果好,诱导率可达13.18%。接种后的马铃薯花药在32℃热激处理,处理时间为48h效果好,讷16诱导率达14.93%。当热激与低温处理配合使用效果好,克13诱导率可达14.93%。4甘露醇预处理讷16和克新13,随着处理的天数增加,愈伤诱导率均呈现了先升后降的趋势,不同的材料,达到诱导率最高值的预处理天数基本相同。预处理时间为4d愈伤组织诱导率达到最大值。甘露醇浓度40g/L效果好。5激素对花药培养起关键性的作用。MS+NAA 0.5mg/L+2,4-D 1.0 mg/L+KT 1.0mg/L适合愈伤组织的诱导。6蔗糖浓度为6%时,马铃薯愈伤组织的诱导率高。马铃薯提取液能够促进愈伤组织的发生,浓度为50g/L效果较好。当蔗糖和麦芽糖浓度都为6%时,麦芽糖对愈伤组织的诱导率要好于蔗糖。7适量添加硝酸银和活性炭可以减轻一些作物花药培养时的褐化程度,培养基中加入20mg/L硝酸银效果最佳,活性炭的浓度1.5g/L效果最佳。8利用气孔保卫细胞叶绿体计数法可鉴定植株染色体倍性。本试验结果表明:克新16双单倍体气孔保卫细胞叶绿体数在10~20个范围内,四倍体在20~30个范围内,叶绿体数少于20个的为双单倍体,多于20个而少于30个的为四倍体。9移栽的双单倍体植株在生长势、叶色、薯型等性状与其对照相比存在差异。
参考文献：
[1]. 马铃薯花粉原生质体分离与培养[D]. 吴旺泽. 甘肃农业大学. 2004
[2]. 马铃薯花粉原生质体的分离与培养[D]. 张峰. 甘肃农业大学. 2001
[3]. 马铃薯花粉原生质体分离的研究[J]. 王蒂, 司怀军, 王清. 园艺学报. 1999
[4]. 马铃薯成熟花粉原生质体分离[J]. 张峰, 王蒂, 王玉萍. 中国农业科学. 2004
[5]. 枣及酸枣原生质体分离与花药培养的研究[D]. 牛瑜菲. 河北农业大学. 2010
[6]. ‘富士’苹果花粉原生质体分离初探[J]. 张宁, 李威, 顾钊宇, 陈秋菊, 段续伟. 园艺学报. 2015
[7]. 马铃薯小孢子原生质体游离与培养的研究[D]. 王玉萍. 甘肃农业大学. 2000
[8]. 马铃薯原生质体培养和体细胞杂交的研究[C]. 王蒂, 张宁, 司怀军. 中国作物学会马铃薯专业委员会2004年年会论文集. 2004
[9]. 马铃薯花粉四分体原生质体的分离[J]. 王蒂, 司怀军, 王清. 云南大学学报(自然科学版). 1999
[10]. 马铃薯花药培养影响因素的研究[D]. 姜丽静. 东北农业大学. 2008