段开来[1]2004年在《动作电位编码对神经细胞分泌的调控》文中研究表明动作电位是神经元的重要生理活动之一,它的主要生理功能之一是使神经元分泌神经递质,将信息传递到下一级细胞。不同神经元或同种神经元在不同状态下的动作电位发放都可以不同。人们已经用去极化方波等刺激对细胞的“刺激(分泌”耦联进行了大量的研究,并观察到突触前刺激模式的改变会引起突触后响应的不同。为了研究动作电位编码对分泌的影响,本学位论文用真实动作电位作为刺激模板,使得刺激方式进一步接近生理条件,并定义了4个参数n、m、f和d来描述动作电位的复杂发放模式F(n,m,f,d):设一串动作电位为“Burst”,在单个Burst内的动作电位数目为“n”,频率为“f”,在一次刺激中的Burst数目为“m”,两个相邻Burst之间的时间间隔为“d”。在大鼠的肾上腺嗜铬细胞和脊髓背根神经节(DRG)神经元上,我们用不同编码的动作电位刺激细胞,通过电容检测方法实时观察了动作电位编码变化对分泌的影响。我们的结果显示:(1)细胞分泌具有频率依赖性。对一定数目的动作电位,当动作电位频率较低时,分泌量会随着频率“f”的增加而增加。但当频率高于一定水平时(嗜铬细胞上,为“f” ( 7 Hz;DRG神经元上,为“f” ( 10 Hz),进一步提高动作电位频率,分泌不再增加。(2)在高频动作电位刺激下,细胞分泌量与动作电位个数“n”成非线形关系。(3)当Burst间隔“d”大于1s时,“d”的变化对分泌量无影响。(4)当动作电位总数一定时,Burst个数即分组方式“m”对总分泌量影响比较大。将40个动作电位分作4组(“m”= 4)和并作一组(“m”= 1)刺激细胞,在嗜铬细胞上前者是后者分泌量的2.2(0.1倍,而在DRG神经元上后者是前者分泌量的1.5 (0.2倍。我们的工作证明:除动作电位的频率和个数以外,编码参数“m”也能调控细胞分泌。在不同类型细胞上,编码参数对细胞分泌的调控可以不同。这可能与不同类型细胞在分泌动力学的差别有关。
高春蕾[2]2003年在《中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）视神经节神经内分泌系统结构和电生理特征研究》文中研究表明眼柄X器官－窦腺复合体（XO-SG complex）类似于哺乳动物的下丘脑-垂体系统，是甲壳动物重要的神经内分泌器官。它分泌甲壳动物高血糖激素（CHH）、蜕皮抑制激素（MIH）性腺发育抑制激素（GIH）等多种神经肽类激素，调控甲壳动物血糖水平、生长蜕皮和性腺发育等多种重要的生理活动。中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）是我国重要经济甲壳动物，由于缺乏对中国对虾这一系统的了解，至今仍采用切除眼柄的促进性腺发育、成熟。我们首先对中国对虾XO-SG复合体显微和超微结构进行了全面的观察，并开展了神经内分泌细胞离体培养研究；由于膜上的电活动是细胞分泌的基础，我们采用了膜片钳技术进行了中国对虾神经内分泌细胞表达离子通道种类和电生理特征研究，为进一步研究细胞分泌调控机制和在生产上控制中国对虾的繁殖和生长打下基础。本研究的主要结果如下：1、组织学、细胞学和免疫组织化学的研究结果表明：中国对虾视神经节XO-SG复合体结构较低等。根据细胞的形状、胞体和胞核的大小，中国对虾眼柄神经内分泌结构中共有5种细胞。甲壳动物高血糖激素（CHH-A）和蜕皮抑制激素（MIH）的功能定位发现，CHH和MIH既具有特异性表达又具有一定程度的共表达。窦腺的超微结构研究发现至少有6种神经分泌末梢。神经分泌颗粒以胞吐作用释放，也可能还有其他释放方式。2、首次建立起中国对虾视神经节神经细胞分离和体外培养的实用方法。根据细胞的大小、形状和生长方式，体外培养的细胞可分为6种。中国对虾视神经节神经细胞体外生长不需要外加生长因子，培养条件和培养基对细胞的再生生长有影响。免疫荧光化学染色发现，成膜生长细胞为CHH-A免疫阳性细胞，分枝生长细胞为MIH免疫阳性细胞。3、作者首次利用膜片钳技术对体外培养24～48小时中国对虾眼柄端髓成膜生长细胞和分枝生长细胞进行了电生理特征研究。电流钳的结果表明成膜生长细胞具有自发和诱发放电活动；分枝生长细胞没有记录到明显放电活动。在电压钳模式下，中国对虾眼柄神经内分泌细胞表达TTX敏感Na＋通道、高电压激活L型Ca通道、TEA敏感钾通道、瞬时钾通道。Ca2+通道电流在－40～－30mV被激活，在－10～0mV时达到峰值；Ca电流受钳制电压的影响，钳制电压越负，Ca电流
段开来, 汪世溶, 熊巍, 周专[3]2002年在《动作电位编码对神经元和内分泌细胞的调控作用》文中研究说明生物电活动与神经细胞的功能运作密切相关,动作电位更是起了信号传递的载体作用,动作电位的编码在其中的作用更是引起了极大关注。在大鼠脊髓背根神经节(DRG)神经元和肾上腺髓质嗜铬细胞(RACC)上,我们用电流钳方法记录了单个动作电位,并在计算机中以它为模板,组成一组动作电位F(n,m,f,d)。这组动作电位编码模式(pattern)由四个参数确
万群芳[4]2005年在《大鼠胰腺β细胞分泌调控机制的研究》文中认为胰岛素在维持血糖稳定中起着重要作用,胰岛素分泌不足将直接导致非胰岛素依赖的Ⅱ型糖尿病的产生。胰腺β细胞通过调控致密大囊泡的胞吐过程来调节胰岛素的分泌。因此,研究β细胞分泌及其调控机制,对早日克服这一危害人类健康的重要疾病具有重要的理论和指导意义。本课题以大鼠胰腺β细胞为研究对象,联合运用全细胞膜片钳膜电容检测、荧光蛋白、光学成像(Confocal、TIRFM、FRET 等)、荧光测钙、钙离子光解释放,以及分子生物学技术等现代生物学方法,研究了单个β细胞在不同的刺激条件和不同钙离子浓度时分泌的动力学特性,并且系统地探讨了蛋白激酶(PK)A 和C 对大鼠胰腺β细胞胰岛素分泌的调控作用; 研究了分泌调控蛋白Stx1A和Munc18a 对胰岛素分泌调控的作用机制。(1)在大鼠胰腺β细胞上观察到连续去极化刺激可以引起单个β细胞中与电压依赖钙通道耦联的囊泡的分泌,是钙离子依赖性的过程。利用钙斜坡测量,发现β细胞上LTX 引起的钙不依赖性分泌实际上是由于它降低了刺激分泌的钙阈值,从而使分泌在低钙或静息时就能发生,仍然是钙离子依赖的过程。大鼠胰腺β细胞的分泌也可分为三个动力学明显不同的成份,结合叁指数拟合和线性拟合能对其进行合理的动力学分析。单个大鼠β细胞胰岛素分泌表现为不同的类型和特性。根据紫外闪光刺激触发C_m变化的特性,可以分成胞吐型、胞吐-胞吞型和过度胞吞型。胞吞发生的几率要比其它分泌细胞高得多。(2)采用光解钙离子释放技术以控制细胞内游离钙离子浓度,并综合运用全细胞膜电容检测技术,测量了在不同的刺激条件和不同钙离子浓度时分泌的动力学特性。首次在β细胞上发现了一种新型囊泡库,即钙离子高度敏感的囊泡库(HCSP)。HCSP 是一个比较小的约10 个囊泡(19.3±3.2fF)的囊泡库(Kd～1μM),其对钙离子的敏感性要比以前发现的立即可释放囊泡库(Kd～20μM)要高得多。因此,在大鼠胰腺β细胞上至少存在三类动力学特性不同的囊泡库:钙离子高度敏感的囊泡库(HCSP),准备释放囊泡库(RRP),和囊泡储备库(DP)。首次发现PKA 和PKC 是通过钙敏感性调控机制促进胰岛素分泌的。在加入PKC的激动剂PMA 或者PKA 的激动剂forskolin 的刺激条件下HCSP 的大小会显着增加。
吴政星[5]2005年在《Snapin对神经分泌的调节作用》文中研究表明细胞分泌功能通过囊泡胞吐过程来完成。囊泡胞吐过程是一个涉及许多蛋白质、脂质分子等物质并有多个细胞器参与的复杂过程,由囊泡的生成、成熟、募集、拴系和锚定、囊泡的激活、最后囊泡与细胞膜融合及其内含物通过融合孔释放至胞外等步聚组成。SNARE 蛋白核心复合体是膜融合的分子基础,为膜融合提供能量。Ca~(2+)是调节性分泌的触发信号,synaptotagmin 是囊泡膜融合过程的Ca~(2+)感受蛋白,它与SNARE 蛋白一起组成膜融合的最小分子构件。细胞胞吐活动受到一些调节蛋白,如α-SNAP、NSF、Munc18/nSec1、Munc13、Rab 蛋白及效应物(rabphilin、Rim 和Noc2 等) 和钙结合蛋白(如calmodulin 和CAPS) 等的调控。囊泡的“激活”是囊泡获得(与靶膜) 融合能力的过程。它是低浓度钙(数百纳摩尔) 和磷脂酰肌醇代谢产物依赖性的耗能过程,需要ATP 水解提供自由能。囊泡激活过程受到Ca2+、二酰甘油、Munc13、蛋白激酶A 和蛋白激酶C、SV2A、NSF 以及Snapin 等信号分子和蛋白质的调控。在Ca2+依赖的调节性分泌活动中,囊泡的激活过程是限速性步骤。激活囊泡的数目代表可释放囊泡库的大小。可释放囊泡库的大小取决于未激活囊泡库的大小以及激活、去激活和消耗(即囊泡融合) 的速率。囊泡激活的分子机制目前还不是十分清楚,可能是SNARE 蛋白聚合形成的trans (异位)-SNARE 复合体或trans (同位)-SNARE 蛋白复合体与钙离子感受蛋白synaptotagmin 相互作用形成的复合物赋予了囊泡与靶膜融合的能力。Snapin 是新近发现的与SNAP-25 结合的小分子(15 kD) 蛋白,为普遍表达的胞浆蛋白。Snapin 与SNAP-25 结合并促进syanaptotagmin 与SNARE 复合体的结合。Snapin 通过超螺旋与SNAP-25、SNAP-23 和非神经元性的SNAP-25 同功型结合。也可能与RGS7、腺苷酸环化酶Ⅵ、EBAG9 产物和受体酪氨酸激酶MET 相互作用。在背根神经节细胞,Snapin 和synaptotagmin Ⅸ均与vanilloid 受体-1 (vanilloid receptor-1, TRPV1) 发生相互作用,调节PKA 介导的TRPV1 通道向细胞膜的募集过程,其调节作用可能通过调节SNARE 蛋白复合体依赖的胞吐过程来实现。Snapin也是溶酶体相关细胞器生物发生蛋白复合物(Biogenesis of Lysosome-related Organelles Comlex-1, BLOC-1) 的亚单位,因而也可能参与对细胞胞吞活动的调节。
熊加祥[6]2006年在《炎性因子活化星形胶质细胞对T细胞调节机制研究》文中进行了进一步梳理紧密的血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)和免疫抑制微环境的存在使中枢神经系统(central nervous system, CNS)一直被认为是免疫特赦区。但在脑外伤、炎症等情况下,白细胞可通过破坏的BBB进入脑内。大量研究显示,CNS内存在特异性的T细胞免疫应答,在抗微生物感染、多发性硬化症、自身免疫性脑炎以及脑血管病等多种疾病中发挥重要作用。然而,由于脑实质内缺乏淋巴管引流和对启动免疫应答起重要作用的专职抗原提呈细胞(antigen-presenting cell,APC),初始T细胞被抗原活化的启动过程可能主要在外周淋巴器官中完成,而活化的T细胞或致敏的T细胞穿过BBB后,被CNS内的APC再次激活,从而发挥免疫效应。此外,在CNS内的特殊微环境中,由于T细胞活化后存活期短、增殖能力弱以及接受再刺激时的快速凋亡,使得活化后T细胞的效应维持机制显得尤为重要。目前,CNS内的胶质细胞如何参与T细胞免疫应答过程及其作用地位已成为神经免疫领域倍受关注的问题之一。星形胶质细胞(Astrocytes,Ast)作为大脑内最多的细胞群,发挥着维持大脑微环境稳态的重要生理功能,而其神经免疫功能往往被忽视,一般认为小胶质细胞才是脑内行使免疫呈递和免疫调控功能的细胞。但是最近的研究证实,星形胶质细胞可以表达免疫膜分子,分泌炎性因子和释放补体等,参与脑内炎性疾病的发生发展,从而逐渐受到神经免疫学者的关注和重视。星形胶质细胞能够维持大脑的免疫稳态,除通过血脑屏障中丰富的足突结构形成机械屏障以外,可能还存在有生物学屏障,如免疫抑制性分子的存在和分泌抑制性细胞介质发挥免疫保护效应。提示星形胶质细胞有可能成为CNS内免疫效应细胞,参与脑内炎性调控作用。研究证实,星形胶质细胞对内环境改变如炎性刺激、缺血、缺氧以及脑外伤等有高度敏感性,将出现反应性的改变,通常称为“活化”或“胶质化”,即星形胶质细胞在炎性病变中的可塑性变化。已有研究报道证实星形胶质细胞在受到炎性介质的刺激后,血脑屏障的通透性增加,易于T细胞浸润,参与疾病进程。在体通过EAE模型证实活化后的星形胶质细胞具有抗原处理、提呈功能,可以再次活化T淋巴细胞,加剧疾病的发展。因此,星形胶质细胞在CNS内T细胞活化后效应以及对T细胞功能的调控显得极为重要,但这一过程中涉及到CNS内的细胞和T淋巴细胞作用的分子机制目前尚不确切。
孙佳琦[7]2014年在《sFRP3和乙酰胆碱对成体海马神经发生的活动依赖性调控》文中指出在成年哺乳动物大脑中,活跃的神经发生(neurogenesis)存在于海马齿状回。在齿状回颗粒下区(the subgranular zone,SGZ),放射状胶质样细胞(radial glia-like precursor,RGL)是主要的神经干细胞,这些细胞不断地产生齿状颗粒神经元和星形胶质细胞。成体海马神经发生与持续的神经回路活性同时进行,并受到各种生理和病理刺激的调控,但这种活性依赖调控背后的微环境(niche)机制仍是一个未知数。采用RNA-sequencing分析,本研究发现了一种在成体齿状回颗粒神经元中高表达并天然分泌的Wnt信号通路抑制剂——分泌型卷曲相关蛋白3(secreted frizzled-related protein 3,sFRP3),电休克刺激、运动和通过光遗传学方法直接刺激颗粒细胞都可以有效地降低该蛋白的表达。通过shRNA慢病毒注射,研究发现sFRP3低表达可以提高神经祖细胞增殖,并且导致经典Wnt信号通路增强。为进一步研究sFRP3对海马神经发生的作用,我们采用sFRP3基因敲除小鼠,研究显示在成年小鼠海马中,sFRP3敲除可激活静止的放射状胶质样神经干细胞,促进新生神经元的成熟。并且,在成年小鼠海马中,sFRP3敲除导致电休克刺激和运动诱发的增加的神经祖细胞增殖显着减弱。这些研究表明s FRP3参与调节成体海马神经发生的多个阶段,而且在一定程度上介导了活化诱发的神经发生。此外,我们研究了来自远距离内侧隔核和斜角带垂直支的胆碱能投射对神经干细胞调节。我们发现在成年大脑齿状回胆碱能投射末端与PV+中间神经元末端紧密联系。功能上,钙成像分析表明乙酰胆碱可以调节PV+中间神经元的钙含量。我们正在研究光遗传抑制胆碱能神经纤维的活动是否导致静止的放射状胶质样神经干细胞的激活受到抑制。基于这些初步结果,我们提出了一个模型——长距离的胆碱能神经元活动可能通过抑制海马PV+中间神经元的活动产生一种间接调控成年神经发生的作用。需要进一步实验验证此模型。本论文重点研究了介导活动依赖性成体海马神经发生调控的两个主要类型分子介质:一个是在海马局部神经网络中产生的分泌蛋白——分泌型卷曲相关蛋白3(s FRP3),另一个是从远距离投射到海马的胆碱能纤维。这些研究对了解成体海马神经发生的功能作用具有重要意义。
肖峰[8]2013年在《离子通道Markov建模及分析》文中进行了进一步梳理细胞电活动是生命现象的基本特征之一，而离子通道是其物理基础。许多重要的生理过程，如细胞的兴奋性、细胞体积和内环境的稳定、神经信号的产生和传导、细胞分裂、生殖发育、肌肉运动、激素和神经递质分泌等都跟离子通道密切相关。因此，研究细胞活动背后的离子通道机制具有十分重要的理论意义和实际应用价值。BK通道（大电导Ca~(2+)激活K+通道）是众多离子通道中的一种，同时受Ca~(2+)和电压两种信号调控，广泛地表达于大量的兴奋和非兴奋细胞中。它参与了许多重要的生理过程，如动作电位的形成及肌肉的活动等，其Ca~(2+)敏感性和β1亚基对神经信号传导以及血管张力的保持至关重要，具有很高的研究价值和意义。在研究离子通道工作机制的各种方法中，离子通道Markov模型是反映通道在特定的生理条件作用下各状态之间转移动态关系的数学模型，可定量刻画离子通道的工作机制，解释离子通道蛋白质的结构和生理功能，揭示离子通道相关疾病的致病机理。然而，在Markov建模过程中常遇到模型结构过于复杂，参数过多，建模数据量太大等问题，传统方法求解通常很难得到一个满意的结果，甚至无法求解。同时，BK通道的Ca~(2+)敏感性测定以及β1亚基的功能分析不仅需要进行Markov建模，还涉及到复杂逆问题的求解，现有分析工具和方法无法有效进行。进化计算是一种基于自然进化的随机搜索方法。它使用概率搜索技术，擅长解决全局优化问题，搜索过程不依赖于初始值、梯度信息或其它辅助知识，对问题的种类有很强的鲁棒性，为本论文中所研究的建模优化问题和逆问题提供了有效手段。本论文研究采用电生理实验技术结合计算机仿真模拟手段，利用进化算法对大量离子通道进行了Markov建模，并针对BK通道的钙敏感性及其β1亚基的功能进行了定量的分析：首先，通过对电生理实验技术和数据进行分析，开发了一套离子通道Markov自动建模软件CeL。该软件基于本论文设计的一种进化计算方法——PSO+GSS（粒子群+黄金分割法）算法，此外，为了使CeL软件可快速有效地进行，论文中还提出一套参数初值预估方法。将其应用到各个模型的参数优化中，取得了更好的优化效果。CeL软件的性能已大大超越目前已有的同类型软件（QuB，Neuron等），处于国际领先水平。另外，论文分析了大量电生理实验数据，并建立了大量通道的Markov模型，如BK通道，KV通道，Ca通道和NaV通道等。然后，分析了激光闪光光解快速释放钙离子后激发的电流（flash电流），发现了BK电流双相激活、快相比例常数Rf的电压依赖性等一些不寻常特性，并以flash电流为媒介，进化算法为基础，在世界上首次精确地计算出细胞局部内Ca~(2+)浓度的变化过程，在此基础上还提出了一种Ca~(2+)结合速率常数的计算方法并计算了BK通道四种变异体的Ca~(2+)结合速率常数。考虑到Ca~(2+)在BK通道中的第二信使功能，此项工作对于研究神经信号的产生和传导机制具有十分重要的意义。最后，分析了BK（α亚基）和BK（α+β1亚基）电流数据，建立了对应的BK50态模型，此模型为世界上第一个成功建立的完整的50态BK模型。接下来，利用建立的50态BK模型，对平滑肌细胞的动作电位进行了建模并模拟了其动作电位。对比研究结果表明：β1亚基会增强细胞的极化以及降低细胞内钙浓度，最终导致动脉松弛。本研究为理解潜在的血压调节机制奠定了基础。此外，由于细胞内[Ca~(2+)]的变化与动脉直径的变化一致，所以我们预测：β1亚基基因为人类高血压的一个候选遗传基因位点。综上所述，本论文揭示了BK通道及其不同变异体的钙和电压敏感性关系以及β1亚基的调控机制，为潜在的神经活动机制以及血压调节机制研究奠定了基础。同时，CeL软件及其衍生出来的基于进化计算的分析方法作为一种创新的研究思路，扩展了当今生物物理的研究方法，并提高了研究效率。
汪世溶[9]2006年在《刺激模式对大鼠在体（in vivo）多巴胺分泌的调制》文中指出多巴胺在维持脑的基本功能(精神、情绪、意识等),控制人对外界环境的反应(运动、知觉、呼吸)等方面具有特殊的重要性,因此一直是神经科学领域的研究热点。多巴胺在各种机体活动中能有如此广泛、复杂的作用依赖于它与神经活性的协同作用。这包括两方面的问题:神经兴奋性对于多巴胺分泌的调控;和多巴胺分泌对神经兴奋性的功能。为了阐述这两方面的问题,我们选择了两个体内多巴胺含量最丰富的组织:黑质-纹状体和颈动脉体作为研究对象。首先,我们试图揭示中枢神经系统中刺激编码如何调控多巴胺的分泌。在麻醉大鼠中,通过刺激多巴胺能神经元的投射纤维——前脑内侧束(medial forebrain bundle, MFB),在纹状体中用电化学测量——安培法对多巴胺的分泌进行量化,以研究在黑质-纹状体通路中刺激模式对分泌的调控作用。我们发现,在纹状体中多巴胺的分泌除了受刺激频率和脉冲数目调控外,还受到刺激的分配分组的影响(“m”效应)。此外,我们发现这个“m”效应还受到其他叁个参数:刺激频率、个数和刺激串间间隔的影响。而多巴胺转运体的抑制剂:可卡因和诺米芬新,可以进一步增加“m”效应。因此,我们认为“m”效应反映了中枢系统中递质分泌效率,可能在神经网络的信息传递中起到重要的作用。然后,我们建立了在体定量测量颈动脉体中单胺类物质释放的实验系统,以研究缺氧诱导的窦神经兴奋性与多巴胺释放的关系,并且结合免疫组织化学、FM成像来研究多巴胺在缺氧诱导的呼吸反射中的作用。意想不到的是,我们发现颈动脉体在机体缺氧情况下儿茶酚胺(catecholamine,CA)含量下降。而以往在离体颈动脉体组织和单细胞的实验结果认为缺氧诱导颈动脉体中CA含量增加。当我们剪断其感觉传入神经——窦神经后,CA含量在同样的缺氧条件下也增加了。这就暗示以往离体实验切断了颈动脉体的神经联系,可能造成了和我们目前在体实验的不同结果。因此,我们进一步研究了在体条件下多巴胺对窦神经兴奋性的作用,发现多巴胺可以抑制缺氧诱导的窦神经兴奋性增加,而多巴胺受体的抑制剂则可以兴奋窦神经,部分模拟缺氧的信号。因此,我们认为颈动脉体中的多巴胺在PaO2正常的情况下对窦神经起抑制作用,缺氧时,多巴胺含量下降,使得这种抑制被减弱,从而使得窦神经兴奋,触发机体的呼吸反射。综上所述,多巴胺与神经活性的协同作用对于大脑的功能有重要作用,而且在体实验系统对于正确认识递质在生理状态下的功能十分有意义。
李英博[10]2010年在《人参皂苷诱导人神经干细胞增殖、分化的机制研究以及在缺血缺氧和蛛网膜下腔出血诱导的脑损伤中的应用》文中认为目的神经干细胞因具有自我更新和多向分化的生物学特征,已成为组织细胞工程研究的基础模型和移植治疗神经系统多种疾病的种子细胞,也为以往认为不可能治愈的神经系统退行性疾病的治疗带来了新的希望。神经干细胞的研究已成为当今生物学领域最热门、最前沿、最具活力的课题之一。各国政府都在投入更大的人力、物力和财力,希望在此领域中获得突破,掌握先机,为全球社会的经济发展和人民的健康做出巨大贡献。迄今为止,增殖和定向诱导分化仍然是神经干细胞研究的核心内容之一。而国内外的研究大多集中于细胞因子对NSCs的影响上,利用传统中药诱导NSCs的增殖分化研究甚少。人参是我国传统名贵中药,具有“补气生血”的强大功效,人参皂苷Rgl是人参的主要药效成分。药理学研究表明,人参皂苷Rgl具有抗衰老、减少神经细胞损伤、促进脑功能恢复、促进脑内蛋白质的合成、增加突触数目、增强记忆等功效,但对NSCs诱导分化的研究较少,特别是利用基因芯片技术筛选出人参皂苷Rg1促进NSCs分化的主要分子靶点,通过分化细胞的电生理特性,研究其功能分化水平,更是未见报道。我们研究NSCs就是利用它结构与功能的可塑性去治疗神经系统损伤及疾病。新生儿缺氧缺血性脑病患病率高达4‰,是导致脑永久性损伤,脑性瘫痪的重要原因,是临床上难治性疾病。我们将人参皂苷Rg1诱导的NSCs应用在缺血缺氧性新生模型鼠中,以进一步从体内实验证明人参皂苷Rg1诱导的NSCs功能分化的效果以及应用潜力。人参皂苷Rb1是人参另一重要活性成分。现已证实Rb1在心脑血管系统的疾病治疗中有重要的作用。例如阻滞心肌细胞的钙超载,减轻缺血和/或缺氧诱导的神经细胞死亡,增加神经元的可塑性等。蛛网膜下腔出血是一种老年人常见疾病,常伴有脑组织广泛严重损伤和高死亡率、高致残率,虽然全世界进行了广泛的研发,以寻找新的药物和治疗手段,但疗效仍然远远不如人意。因此,我们也探讨了人参皂苷Rb1对出血性脑损伤的治疗作用,期望在更大程度上挖掘人参这一“百草之王”的重大药用价值,为临床治疗新生儿缺氧缺血性脑病和蛛网膜下腔出血提供新的理论与实验资料。方法:1.从7～12w流产人胚胎大脑皮层中分离NSCs,采用悬浮细胞培养方法反复传代培养,纯化NSCs;经光学显微镜观察形态和免疫细胞化学对其鉴定;并观察不同浓度的Rgl对NSCs增殖、分化的影响。2.通过基因芯片技术,观察Rg1诱导人NSCs向神经元分化7d时靶基因表达情况,通过图形比对分析、Pathway分析、数据演算最终筛选出Rg1促进NSCs分化的最主要的目的基因和信号转导途径,再采用western blot和免疫组化的方法对筛选出的ERK靶基因进行验证。3.采用全细胞膜片钳技术分析人参皂苷Rg1诱导人胚胎神经干细胞分化7d时,神经元样细胞的膜特性以及钠、钾离子通道的功能表达,通过电生理特性证实检测细胞的功能成熟水平,以证实人参皂苷Rg1能促进NSCs功能分化成熟。4.将人参皂苷Rg1诱导的神经干细胞移植入缺血缺氧的新生鼠模型侧脑室,采用TTC染色和行为学观察对模型进行评价。通过水迷宫、体感诱发电位观测其脑功能的恢复情况,免疫组化检测移植的神经干细胞生长、分化状况。5.将人参皂苷GRb1应用到蛛网膜下腔出血的大鼠模型中,通过统计死亡率,检测脑水含量、大脑基底动脉的血管壁厚度和管腔面积,血脑屏障通透性,电镜检测血管壁的损伤情况,以及神经功能学评分来客观评价Rb1的治疗效果。通过检测脑神经元凋亡情况和p53、caspase-3、Bax以及Bcl-2等关键性凋亡通路相关蛋白的表达来探讨GRb1作用的可能机理。结果:1.体外一定浓度的Rg1有明显的促进NSCs增殖和分化的功效。Rg1浓度为120μg/ml时,MTT的OD值最大,促增殖效果最好。Rg1浓度为10μg/ml时,NSE、GFAP和Gal-c的细胞阳性率开始升高,20μg/ml时,分化的细胞达到高峰,并比IL-1组效果略好。但继续再增加Rg1的浓度对提高分化细胞的阳性率没有帮助。2.基因芯片检测和数据分析可以筛选出人参皂苷Rg1促进NSCs增殖分化的主要靶基因和信号转导通路。基因芯片共检测到Rg1诱导NSCs分化过程中差异表达基因675个,其中显着上调的基因有255个,显着下调的基因有420个。基因种类主要有与细胞生物合成、细胞代谢、转录正向调控、中枢神经系统发育、细胞分化、离子通道活性等相关基因。分别占差异基因总数的21.6%、11.7%、6.4%、5.1%、3.4%和1.5%。其中与NSCs分化相关最主要的上调基因有:syntaxin 1基因,α-tubulin基因,下调基因有Wnt抑制因子-1。与调控离子通道相关的基因有:编码受体门控性阳离子通道(ROC)蛋白的基因,编码4型内向整流K+通道的基因和编码TRPm2通道蛋白的基因。通过Pathway分析发现, MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)通路中的ERK(细胞外信号调节蛋白激酶)在Rg1诱导NSCs分化过程中扮演重要角色。而CAMP(环磷酸腺苷)-PKA(蛋白激酶A)和PI3K(磷脂酰肌醇-3激酶)-AKT信号传导通路在Rg1促增殖过程中发挥重要作用。经western blot和免疫组化检测,Rg1诱导NSCs分化过程中,ERK1/2蛋白明显上调,并且其磷酸化可以被Rg1激活,30min时达到高峰,60min时消失。在使用ERK阻断剂PD98059后,NSCs的分化率明显下降。得到与基因芯片相同的结果。3.全细胞膜片钳检测证实,人参皂苷Rg1能促进NSCs电生理特性的表达和功能分化成熟。人参皂苷Rg1(20μg/ml)诱导NSCs分化7天时神经元样细胞的膜静息电位:45.70±2.63 mv;膜电容:26.89±1.91 pf;膜输入阻抗:877.51±20.44 M?;均较对照组有明显差异(P<0.05)。显示了更为成熟的神经元细胞膜特性。记录到电压依赖性的快速激活、快速失活的内向Na+电流,并可被TTX阻断,其平均峰值为711.48±158.03 pA,检出率50%,对照组267.24±71.15 pA,检出率22%,均有统计学意义。记录到电压依赖性的外向K +电流(经鉴定为快速激活的瞬时外向型K+电流和延迟整流型的外向K +电流),平均峰值1070.42±177.18 pA,对照组:798.11±100.02 pA,(P<0.05)。4.移植Rg1诱导后的NSCs,可以在治疗新生大鼠缺血缺氧性脑损伤中发挥较好的作用。移植Rg1诱导的人NSCs到的缺血缺氧模型大鼠体内1月后:水迷宫实验潜伏期:60.38±13.5 s,游泳路程:686.52±142.75 cm,较对照组明显缩短;目标象限探索时间:40.72±6.14 s,较对照组明显延长(P<0.05)。体感诱发电位实验潜伏期18.42±1.79 ms,较对照组明显缩短;振幅:227.28±19.38μv,较对照组明显增大(P<0.05)。抗人NSE抗体免疫组化染色显示:移植组的脑切片中,分化的神经元样细胞在皮层呈散在表达,而在海马区域呈集中表达并围绕缺血损伤区域生长。5.人参皂苷Rb1对蛛网膜下腔出血(SAH)的脑损伤有积极的治疗和保护作用。20mg/kg Rb1治疗SAH模型大鼠后:死亡率15.15%;假手术组6.67%,生理盐水组24.32%。自发活动评分提高;脑水肿明显降低;血脑屏障通透降低;血管内皮细胞电镜及光镜组织病理学明显改善;大脑基底动脉管腔面积明显增大而管壁厚度明显降低;神经元凋亡指数明显减少。促凋亡蛋白p53,以及由p53激活的Bax蛋白和caspase-3蛋白的表达明显下调,抗凋亡蛋白Bcl-2明显上调。结论:1.一定浓度的Rg1有明显的促进NSCs增殖和分化的功效。2.通过基因芯片检测可以筛选出Rg1促NSCs增殖、分化过程中的重要靶基因。其中与分化相关的主要基因是:syntaxin 1基因,α-tubulin基因,WIF-1基因等;与离子通道调控相关的靶基因主要是:ROC基因,TRPm2基因,4型内向整流K+通道基因等。而数据分析得出人参皂苷Rg1促进NSCs增殖、分化的机制与CAMP-PKA、PI3K-AKT、ERK信号通路的激活有关。3.人参皂苷Rg1能促进NSCs电生理特性的表达和功能分化成熟。4.移植Rg1诱导后的NSCs,可以在治疗新生大鼠缺血缺氧性脑损伤中发挥较好的作用。5.人参皂苷Rb1对蛛网膜下腔出血(SAH)诱发的脑损伤有积极的治疗和保护作用。
参考文献：
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[2]. 中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）视神经节神经内分泌系统结构和电生理特征研究[D]. 高春蕾. 中国科学院研究生院（海洋研究所）. 2003
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[4]. 大鼠胰腺β细胞分泌调控机制的研究[D]. 万群芳. 华中科技大学. 2005
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[7]. sFRP3和乙酰胆碱对成体海马神经发生的活动依赖性调控[D]. 孙佳琦. 清华大学. 2014
[8]. 离子通道Markov建模及分析[D]. 肖峰. 华中科技大学. 2013
[9]. 刺激模式对大鼠在体（in vivo）多巴胺分泌的调制[D]. 汪世溶. 中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）. 2006
[10]. 人参皂苷诱导人神经干细胞增殖、分化的机制研究以及在缺血缺氧和蛛网膜下腔出血诱导的脑损伤中的应用[D]. 李英博. 重庆医科大学. 2010
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