樊丽琳[1]2004年在《线粒体损伤在NAFL大鼠肝细胞凋亡中的作用》文中指出目的:通过研究线粒体损伤在大鼠NAFL肝细胞凋亡中的作用,探讨NAFL的发病机理。方法:(1)30只Wistar雄性大鼠随机分为基础饲料组(正常对照组,C组)、高脂饲料组( 脂肪肝组,F组),其中每组各含4周、8周、12周3个时相点,每时相点5只动物。(2)动态观察各组:①体重变化;②HE染色光镜观察肝脏组织病理改变;③电镜观察肝细胞超微结构变化;④Clark氧电极检测肝脏线粒体呼吸功能,荧光分光光度计测定线粒体膜电位;⑤硫代巴比妥酸法测定肝脏组织丙二醛(MDA)的含量变化;⑥流式细胞仪检测肝细胞凋亡百分数;⑦免疫组织化学法及Western blot检测Cyt C、Caspase-3、Bcl-2、Bax在肝脏中的表达。结果:①体重情况: F组4周、8周、12周,体重分别为355.5±28.3g、406.2±14.5g、469.7±28.9g,而C组为244.9±16.9g、282.5±20.1g、300.7±15.8g,F组体重均高于同一时相点的对照组,差异具有显着性(P<0.01);②HE染色结果显示:C组大鼠肝脏无异常发现;F组肝脏在4周时出现脂肪变, 8周出现轻度脂肪肝,12周出现中、重度脂肪肝;电镜下观察高脂12周肝组织,肝细胞线粒体肿胀,嵴变短、减少甚至消失,并发现染色质浓染,边集于核膜;③F组大鼠肝脏线粒体RCR(呼吸控制率)、P/O(磷/氧比值)比值随饲养时间的延长逐渐下降,高脂4、8、12周RCR分别为:4. 84±0.18、3.87±0.44、3.51±0.18,C组4、8、12周RCR分别是:4.74±0.38、4.93±0.79、4.85±0.47,F组4周与C组4周无显着差异,而F组8、12周与相应时相C组比较,RCR显着降低(P<0.05或P<0.01), F组4、8、12周P/O比值3.61±0.39、3.56±0.34、3.37±0.25较C组相应时相点(4.22±0.63、4.11±0.29、4.13±0.39)均降低,具有显着性意义(P<0.05或P<0.01); ④C组4、8、12周线粒体膜电位相对荧光强度分别为951.2±64.6、977.2±78.3、958.6±70.4,组间无明显差异,而高脂4、8、12周线粒体膜电位相对荧光强度分别833.1±53.5、772.2±73.4、587.2±63.1,呈逐渐下降趋势,与相应时相C组比较明显降低,差异显着(P<0.05或P<0.01);⑤第4周后肝脏内MDA含量在F组明显高于对照组(P<0.05),随时间延长,F组MDA逐渐增
康敏, 钟德君, 李鹏, 刘翼, 李昌平[2]2010年在《线粒体损伤对NAFL大鼠肝细胞凋亡的影响》文中研究指明目的研究肝细胞凋亡及线粒体损伤在大鼠非酒精性脂肪肝(NAFL)形成中的作用,探讨NAFL的发病机理。方法 将30只雄性SD大鼠随机分为正常对照组和高脂组;HE染色观察肝组织光镜下的病理改变;电镜观察肝细胞超微结构变化;流式细胞仪检测肝细胞凋亡及线粒体膜电位;实时荧光定量PCR法检查caspase-3的mR-NA表达;免疫组化法检查细胞色素C(CytC)含量及caspase-3的蛋白表达。结果 HE染色结果显示,正常对照组大鼠肝脏无异常发现,高脂组肝脏在4周时出现脂肪变,8周出现轻度脂肪肝,12周出现中、重度脂肪肝;电镜下观察高脂组肝组织中肝细胞线粒体肿胀,嵴变短、减少甚至消失,粗面内质网减少,核型欠规则;与正常对照组比较,高脂组4～12周肝细胞凋亡指数增加,线粒体膜电位明显下降(P<0.05);高脂组caspase-3的mRNA表达随着时间延长逐渐增高;与正常对照组比较,高脂组CytC、caspase-3的蛋白表达随着时间延长逐渐增高,以12周增加明显(P<0.05)。结论大鼠NAFL引起的肝细胞损伤与肝细胞凋亡密切相关,线粒体膜电位下降启动了CytC由线粒体向胞质释放,激活caspase家族的级联反应,最终导致肝细胞凋亡,线粒体功能损伤在NAFL发病机制中起关键作用。
甘惠中[3]2006年在《褪黑素对大鼠非酒精性脂肪肝及肝内CYP2E1、HO-1表达的影响》文中认为目的 建立非酒精性脂肪肝模型，观察褪黑素(MT)对非酒精性脂肪肝大鼠血清转氨酶，体内脂质，SOD，GSH-PX，MDA以及肝脏形态学、CYP2E1和HO-1表达的影响。 方法 雄性Wistar大鼠50只，随机分成5组每组10只，正常对照组予普通饲料，模型组、MT低剂量组、MT中剂量组、MT高剂量组予高脂饮食12周。各MT干预组依次给予MT(含≤1％无水乙醇)2.5mg·kg~(-1)·d~(-1)、5.0mg·kg~(-1)·d~(-1)和10.0 mg·kg~(-1)·d~(-1)腹腔注射，正常对照组、模型组予等量生理盐水(含1％无水乙醇)腹腔注射，12周末处死称体重及肝湿重并计算肝指数，进行肝脏病理学检查，生化法测定血清丙氨酸转氨(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-Px)、甘油叁酯(TG)、总胆固醇(TC)；肝匀浆TG，TC，SOD，MDA，GSH-Px。免疫组织化学法测定肝脏细胞色素P4502E1(CYP2E1)和血红素加氧酶-1(HO-1)的表达。 结果 12周高脂饮食成功复制大鼠NAFL／NASH模型。与正常对照组比较，模型组大鼠肝湿重及肝指数明显增高(P＜0.01)；肝细胞呈中—重脂肪变性，肝小叶内见灶性炎细胞浸润和点状坏死；血清ALT(P＜0.05)，AST，TC，MDA值(P＜0.01)以及肝匀浆TG，TC，MDA值明显升高(P＜0.05)；血清及肝匀浆SOD，GSH-Px水平明显减低(P＜0.01，P＜0.05)；肝脏CYP2E1及HO-1的表达明显增加(P＜0.01)。药物干预组中以MT中、MT高剂量组作用明显。与模型组比较，MT中、高剂量组肝湿重及肝指数明显减低(P＜0.01，P＜0.05)；肝脏病理变化改善明显，多呈轻—中度脂肪变性，炎症活动度积分明显减低(P＜0.05)；血清及肝匀浆SOD(P＜0.05，
董柳[4]2007年在《消膏转浊法逆转肥胖型非酒精性脂肪肝模型大鼠肝脏脂肪变性的实验研究》文中研究表明目的:非酒精性脂肪肝是一种无过量饮酒史,以肝实质细胞脂肪变性和脂肪贮积为特征的临床病理综合征。随着人民生活水平的提高,非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)发病逐渐增多。其中,病因与肥胖密切相关,且有年轻化的趋势,在肥胖症患者中发病率则高达60%～90%;肥胖儿童可达80.49%。目前普遍认为NASH不再是良性病变,约25%可以发展为肝纤维化、8%可进展为肝硬化而导致一系列严重并发症,不少学者认为NASH是隐源性肝硬化或非活动性小结节性肝硬化的前期病变。因此已成为全球普遍关注的医学问题和社会问题。NASH尚无理想的防治药物。中医在防治NASH方面具有一定的优势。导师仝小林教授认为:肥胖是非酒精性脂肪肝、2型糖尿病、血脂异常、高血压、冠心病等诸多疾病的“共同土壤”,乃一因多病。从“膏”、“浊”论治肥胖及其相关疾病可使防治重心大大前移,体现了从源头控制,“未病先防、既病防变”的思想。肥胖型非酒精性脂肪肝前期主要病因是肥胖。多与饮食不节、久坐少动、情志失和、先天禀赋异常及脏腑功能失调有关。病机多为肝郁脾滞,中焦大气不转,气机升降受阻,木郁土壅,致津液失调,精微物质不归正化,酿脂为膏,异位沉积于肝内,阻滞肝络,而成脂肪肝。膏浊与气滞并见,气血运行不畅,而瘀血内生,浊瘀交阻,积结肝内,久而化毒。治疗上,则应治其根本,从消膏转浊立法;病程已久,膏浊未尽,瘀滞之象渐露,则应加强化瘀方药的应用,故立法为消膏、转浊、祛瘀、排毒。临床使用消膏转浊方治疗肥胖型非酒精性脂肪肝取得较好疗效。本课题采用国内外公认的研究模型,结合NASH的现代研究成果,用病理学、生物化学、免疫组化、分子生物学等技术,观察非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝脏组织学特点、肝功、血脂、血糖、胰岛素及肝匀浆中FFA、MDA、SOD、TNF-α和Leptin的变化情况,以及CYP2E1、InsR和IRS-2 mRNA表达情况,阐明消膏转浊方的作用机制,为中医药治疗本病提供理论依据。方法:实验分两部分进行:第一部分:消膏转浊方的疗效性研究(实验Ⅰ)Wister雄性SPF级大鼠40只,体重180-220克。适应性喂养1周后。随机分为5组。正常组(n=8)、模型组(n=8)、消膏转浊组(n=8)和罗格列酮对照组(n=8),以及饮食控制组(n=8)。同时自实验开始起,正常组以标准饲料喂养;其余组的大鼠每天饲以高脂饲料(即标准饲料的基础上加14%猪油、1%胆固醇),其蛋白质、脂肪、碳水化合物提供能量分别为18%、45%、37%。每天测定大鼠的摄食量,每周测定大鼠体重。造模8周后,正常组饮食同前;模型组继续高脂喂养;消膏转浊治疗组以及罗格列酮组改为普通饲料喂养,同时给予药物治疗。消膏转浊方剂量为成人剂量10倍量(浓度为1.8生药/ml,灌胃量为6.44ml/kg);罗格列酮3mg/kg?d(浓度0.75mg/ml,灌胃量为4ml/kg)灌胃治疗4周;饮食控制组改为普通饲料喂养,不用药物治疗,共为4周。给药4周后(即实验12周),大鼠清醒状态下固定于鼠板上,进行颈静脉抽血2ml,3000rpm离心10min,取血清-20℃储存,统一进行相关指标检测。大鼠恢复2天后,进行正常血糖—高胰岛素钳夹实验(简称钳夹实验),钳夹实验结束后,从颈动脉取血,按常规制备血清,-20℃中冻存待相关检测指标分析用。颈动脉采血后处死动物,迅速取出肝脏,用滤纸吸干液体并称重,并立即从肝脏的同一部位切取1块肝组织,取一小块切成约1cm3大小,用10%磷酸缓冲甲醛液固定,送电镜观察,余下部分切成1.0cm×1.0cm×1.0cm在10%中性甲醛固定后制备石蜡切片。HE染色,光学显微镜下观察,评估脂肪变性和炎症活动程度。肝脏其余部分根据测定指标的要求,用锡箔纸分块包裹,液氮保存。同时切取肠周围、双肾及附睾脂肪垫并称重。于模型建立及给药期间观察记录动物体重、食欲、行为、状态、毛发及死亡情况。计算肝指数。用全自动生化分析仪检测血清中的ALT、AST、CHO、TG、HDL-C、LDL-C,用普通分光光度计检测FFA。第二部分:消膏转浊方的机制研究(实验Ⅱ—Ⅳ)动物造模、分组、用药情况同实验Ⅰ。钳夹实验结束后,取材同上。用快速葡萄糖分析仪检测空腹及稳态血糖;用放免法检测胰岛素;用半自动分光光度计检测肝匀浆MDA、SOD;用双抗体夹心ABC-ELISA法检测肝匀浆中的TNF-α和Leptin;用免疫组化法检测CYP2E1的蛋白表达;用实时荧光定量PCR检测CYP2E1、InsR及IRS-2 mRNA的表达。结果:第一部分:消膏转浊方的疗效学研究(实验Ⅰ)根据模型组大鼠肝组织病理及肝功能状态,成功复制大鼠NASH动物模型。与空白模型组相比,消膏转浊组大鼠体重明显降低(P﹤0.01);肝指数明显降低(P﹤0.01),腹脂明显减少(P﹤0.01);肝脏病理显示:消膏转浊组大鼠肝细胞脂肪沉积,炎症活动程度皆明显改善(P﹤0.01);消膏转浊方可以降低血清ALT、AST (P<0.05),CHO、TG及LDL-C(P﹤0.01);并可以显着地降低大鼠肝组织匀浆中的FFA的含量(P<0.01)。疗效优于单纯饮食组。第二部分:消膏转浊方的机制学研究(实验Ⅱ—Ⅳ)⑴消膏转浊法对非酒精性脂肪肝大鼠肝组织肿瘤坏死因子α及瘦素影响的实验研究:与模型组相比,消膏转浊方能够显着地降低肝组织中的TNF-α(P <0.01),降低肝组织中的瘦素(P<0.05);⑵消膏转浊法对非酒精性脂肪肝大鼠脂质过氧化反应影响的实验研究:消膏转浊方可以显着降低大鼠肝组织匀浆中的MDA含量,提高SOD的活性(P <0.01)。免疫组化结果显示:消膏转浊组肝细胞内CYP2E1的表达局限在腺泡III区中央静脉边缘周围的肝细胞内。定量分析结果显示:与模型组相比,消膏转浊组肝细胞中CYP2E1染色阳性的细胞面积和MOD值显着低于模型组(P<0.01);优于单纯饮食组。实时荧光定量结果:与模型组相比,消膏转浊组肝细胞中CYP2E1mRNA显着低于模型组(P<0.01)。⑶消膏转浊法对非酒精性脂肪肝大鼠胰岛素抵抗影响的实验研究:钳夹实验结果显示:与模型组相比,消膏转浊方能够显着提高肥胖型非酒精性脂肪肝大鼠的葡萄糖输注率(P﹤0.01);空腹胰岛素比较结果:与模型组相比,消膏转浊组血清空腹胰岛素含量显着降低(P﹤0.01);实时荧光定量结果显示:消膏转浊组InsR mRNA与IRS-2 mRNA的表达均显着高于模型组(P<0.01)。结论:1消膏转浊方能明显降低NAFL大鼠体重、肝指数,并且可以显着减少大鼠肠周围脂肪组织重量。显示消膏转浊方对大鼠内脏肥胖有一定减肥作用,减轻内脏肥胖可能是消膏转浊方治疗大鼠非酒精性脂肪肝病变的作用机制之一。2消膏转浊方可以降低肝细胞内脂肪的沉积,从而减轻脂肪对肝细胞造成的水肿、缺氧以及炎症等损害,具有逆转肝脏脂肪沉积的功能。3消膏转浊方可改善非酒精性脂肪肝大鼠肝功能,具有一定的保肝作用,并且可显着降低肥胖型非酒精性脂肪肝大鼠的血脂及肝匀浆中的FFA,具有保肝降酶改善脂代谢的作用。4消膏转浊方可能够通过降低肝组织中TNF-α的含量,间接减轻脂质过氧化反应,从而减轻肝细胞的炎症反应;降低瘦素的含量,改善瘦素抵抗,减轻胰岛素抵抗。5消膏转浊方可以显着地降低大鼠肝组织匀浆中的MDA,提高SOD的活性,抑制肝细胞内CYP2E1的蛋白及基因的表达;提示:消膏转浊方抑制肝CYP2El的表达,提高肝组织抗氧化能力,缓解氧化应激,减少脂质过氧化反应的发生是其治疗脂肪肝的机制之一。6消膏转浊方可以提高葡萄糖输注率,降低血清中的胰岛素含量,改善胰岛素抵抗的状态。在胰岛素信号传导通路上,消膏转浊方通过增强肝细胞胰岛素受体和胰岛素受体底物2基因的表达,作用于受体及受体后两方面,改善胰岛素抵抗。
参考文献：
[1]. 线粒体损伤在NAFL大鼠肝细胞凋亡中的作用[D]. 樊丽琳. 第叁军医大学. 2004
[2]. 线粒体损伤对NAFL大鼠肝细胞凋亡的影响[J]. 康敏, 钟德君, 李鹏, 刘翼, 李昌平. 山东医药. 2010
[3]. 褪黑素对大鼠非酒精性脂肪肝及肝内CYP2E1、HO-1表达的影响[D]. 甘惠中. 安徽医科大学. 2006
[4]. 消膏转浊法逆转肥胖型非酒精性脂肪肝模型大鼠肝脏脂肪变性的实验研究[D]. 董柳. 北京中医药大学. 2007
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