于艳军[1]2003年在《酪蛋白酶促水解过程集总动力学研究》文中研究说明蛋白酶促水解反应是在酶的催化作用下使蛋白水解生成胨、肽等低分子量产物的生化过程。本文利用集总方法对酪蛋白－胰蛋白酶（Casein-trypsin）水解体系进行了动力学及过程模拟研究，建立了该体系的四集总动力学模型，并对模型进行了参数估算和实验验证，主要内容包括以下几方面：首先，考察了操作条件对酪蛋白水解速度的影响，确定酶解反应初态pH值为8.0，采用直接加入酶粉法；低浓度下胰蛋白酶以热失活为主，水解反应存在最适温度、pH值以及底物和酶浓度比。其次，确定反应灭酶方式为沸水灭酶，色谱检测波长为214nm，水解过程不需要加入胰蛋白酶保护剂；进一步采用高效体积排阻色谱法定性分析胰蛋白酶水解酪蛋白的反应全过程，发现水解产物主要集中于九个色谱峰中，初始反应速度较快，分子量大的多肽不断水解生成分子量较小的多肽，随反应时间的延长，产物分布趋于稳定。最后，以分子量作为标准将反应体系分为四个集总，其中包括一个不溶性组分和叁个可溶性组分。通过色谱分析，建立了可溶性组分质量浓度与吸收峰面积之间的线性关系，进而得出随时间变化的水解物浓度分布。在合理假设的基础上，建立了四集总动力学模型。通过测定各集总组分的本征动力学常数，估算出集总模型的反应速率常数。并通过改变实验条件对模型进行了拟合验证，实验值与模型计算值的平均误差为11.6%，说明该模型可实现对蛋白质复杂酶解反应过程的模拟，但参数拟合方法及过程的假设上仍有待进一步完善与改进。全文研究表明，对于蛋白酶促水解复杂反应体系，集总是一种有效的动力学研究方法，并可望用于其它生化复杂反应体系，但其不足之处亦需进一步研究解决。
史德青[2]2003年在《蛋白质酶促水解过程集总动力学研究》文中研究说明蛋白酶促水解是在酶的催化作用下使蛋白水解生成胨、肽等低分子量产物的生化过程。因过程具有产物多样性和反应复杂性的特点，而使其动力学研究较为困难。本文将石化中研究复杂反应体系动力学的集总方法引入生化工程领域，建立蛋白酶促水解通用集总动力学模型，并以牛血清白蛋白－胰蛋白酶（BSA-trypsin）反应体系为研究对象，进行了模型的参数估算与实验验证。具体研究内容如下：水解工艺研究：考察操作条件对水解速度的影响，表现为：温度升高水解速度加快，但水解速度下降趋势更明显；pH8－pH9范围内水解速度较快；高底物浓度下表现出底物抑制；底物浓度一定时，提高酶浓度可增加水解速度。水解过程液相色谱分析：用体积排阻液相色谱定量分析了蛋白酶促水解过程。分子量最大吸收峰所对应的多肽不断水解，而其它分子量范围的多肽生成速度大于水解速度，质量浓度不断上升。将理论肽的分子量与实验中得到各吸收峰对应肽的分子量对比，可推断出在胰蛋白酶作用下BSA的断裂位点。蛋白酶促水解通用集总动力学模型的建立：根据蛋白酶促水解机理，对水解过程做出合理假设，推导出描述微观反应的本征动力学方程。在确定集总划分的基本原则与依据后，构建出蛋白酶促水解过程的集总反应网络，并用本征动力学方程对基元反应进行数学描述，建立了通用集总动力学模型。牛血清白蛋白－胰蛋白酶四集总动力学模型：以BSA-trypsin体系为具体研究对象，根据水解产物的液相色谱数据将反应体系分为四个集总，建立了四集总动力学模型。测定各集总的本征动力学常数后，采用自下而上分层估算的方法，计算出反应网络的六个速率常数，并分析了影响速率常数的主要因素。为验证模型的可靠性，在不同的原料组成和反应条件下进行实验，实验值与模型计算值较为吻合。结果表明，该模型具有良好的拟合性和外推性。牛血清白蛋白－胰蛋白酶体系拟一级集总模型：将本征动力学方程简化为拟一级方程，得到拟一级集总动力学模型。模型实验验证中，计算值误差大小与机理模型相近。与机理模型相比，拟一级模型具有形式简单、实验工作量小等优点，但不能对水解机理做出反映，动力学常数不具有明确物理意义。结果表明，对蛋白酶促水解复杂反应体系，集总是一种有效的动力学研究方法，并可望用于其它生化复杂反应体系。但其不足之处亦需进一步研究解决。
史德青, 何志敏, 齐崴[3]2002年在《蛋白质酶促水解过程集总动力学研究》文中指出针对蛋白质酶促水解反应特点 ,根据水解反应机理 ,对水解过程进行合理的假设 ,将水解产物按分子量分段集总 ,构建出集总反应网络 ,用包含酶失活、产物抑制和底物抑制的本征动力学方程描述集总组分的反应行为。以牛血清白蛋白——胰蛋白酶反应体系为具体研究对象 ,建立了 4集总动力学模型。根据分层估算的原理 ,进行了动力学参数的测定 ,经不同原料组成和反应条件的实验验证 ,所建立的集总动力学模型具有良好的拟合性和外推性。
赵钟兴[4]2012年在《蚕蛹蛋白酶解制备抗氧化和降血压活性产物及其动力学研究》文中指出蚕蛹作为缫丝企业的主要副产品产量高,由于缺乏深加工技术,大量蚕蛹都作为饲料和肥料使用,资源利用率和附加值低。蚕蛹蛋白质量占干蚕蛹质量的45%-50%,经测定在蚕蛹蛋白中含有18种人体所需的氨基酸,是一种较为理想的优质纯天然全价蛋白质,而蚕蛹蛋白的酶解产物蚕蛹多肽也具有多种功能活性。虽然目前关于蚕蛹蛋白综合利用的研究已有很多,但还存在研究的广度和深度不够的问题,主要体现在蚕蛹蛋白酶解产物功能活性开发和酶解动力学过程研究不够深入等方面。本论文从蚕蛹蛋白的深加工应用研究和蛋白酶解过程基础研究出发,优化蚕蛹蛋白精制工艺,同时优化中性蛋白酶和碱性蛋白酶水解蚕蛹蛋白体系制备具有较高抗氧化和降血压活性酶解产物的工艺,推导两个酶反应体系的宏观动力学方程和集总动力学方程。主要取得以下几方面的研究成果：对制备得到的蚕蛹蛋白进行氨基酸含量和分子量分布分析,发现蚕蛹蛋白中8种必需氨基酸占总量的48.03%,疏水性氨基酸占总氨基酸含量的46.69%,具有进一步研究其抗氧化和和ACE抑制活性肽的潜力。蚕蛹蛋白水溶液分子量分布结果显示,蚕蛹蛋白中包含有多种蛋白和多肽,分子量范围从90kDa到500Da。用5种蛋白酶水解蚕蛹蛋白,以O2-·、DPPH-及·OH的抑制率和ACE的抑制率作为抗氧化和降血压活性的测检指标,发现中性蛋白酶和碱性蛋白酶的酶解产物同时具有较强的抗氧化和降血压活性。根据响应面试验设计方法,再以水解度作为响应面指标,得到中性蛋白酶最优条件为反应温度49℃,pH值7.00,加酶量0.70%,反应180min；碱性蛋白酶最优条件为反应温度51℃,pH值9.05,加酶量0.38%,反应180min,并通过实验验证其误差值小于5%,说明采用响应面试验设计方法对蚕蛹蛋白酶解体系进行优化具有较好的可靠性。结合酶解反应机理推导出中性蛋白酶和碱性蛋白酶水解蚕蛹蛋白体系宏观动力学模型,计算得到两个酶反应体系动力学常数分别为米氏常数4.0g-L-1、产物生成速率常数130.9min-1、底物抑制常数110.4g·L-1、酶失活速率常数24.6min-1(中性蛋白酶)和米氏常数3.5g·L-1、产物生成速率常数251.7min-1、底物抑制常数94.8g·L-1、酶失活速率常数41.4min-1(碱性蛋白酶),证明在两个体系内存在底物抑制现象,其最适底物浓度分别为32.7g·L-1和23.4g·L-1。根据实验验证两个酶反应体系反应模型,平均相对误差分别为3.80%和4.60%。再通过对两个体系不同反应条件下增溶度的分析,建立了增溶度与水解度经验方程。根据蚕蛹蛋白酶解机理,提出蚕蛹蛋白酶解集总动力学假设,再根据蛋白的溶解性和酶解产物分子量分布情况,建立两个酶反应体系蚕蛹蛋白叁集总反应数学模型。测定酶失活速率常数和各集总本征动力学常数后,拟合出集总反应网络动力学参数,建立各动力学常数与开氏温度的关系式,并分析影响速率常数的主要因素,得到相应的反应活化能分别为22.22kJ·mo1-1和9.52kJ·mol-1。为验证模型可靠性,在不同温度下进行实验,结果表明实验值与计算值较为吻合,说明该模型具有较好的推算性。再通过测定不同集总组分的抗氧化和ACE抑制活性发现主要活性都集中在分子量最小组分(集总组分C)中,并通过蚕蛹蛋白宏观动力学模型和集总动力学模型的关联,得到两个酶反应体系水解度、主要集总组分和反应时间关联方程组,为优化生物活性肽的生产工艺提供理论依据。
黄伟[5]2012年在《蓝圆鲹蛋白酶解动力学研究》文中认为酶解过程中动力学研究不仅在理论意义上加深对酶解过程的理解,而且能有效地指导生产实践,通过模型推算出获得目标水解产物所需的酶解条件。目前对于酶解蓝圆鲹蛋白的研究主要停留在工艺条件的优化以及酶的选择等方面,其酶解反应过程规律研究则相对较少。常规米氏方程以恒定动力学参量米氏常数来建模的传统方法很难真实地表征整个反应历程。本文分别用宏观动力学模型、3D图形以及集总动力学模型等叁种方法对碱性蛋白酶-蓝圆鲹蛋白酶解体系表征。基于米氏方程的反应机理,加入酶失活、底物抑制和产物抑制等影响因素,并引入水解度定义,建立了宏观动力学表征碱性蛋白酶-蓝圆鲹蛋白酶解体系的动力学模型。结果发现,在pH8.5,温度t为47.5℃的条件下,酶解体系中底物抑制和产物抑制的作用可以忽略。同时为了提高效率和减小工作量,提出用D-最优设计法对模型参数估算过程进行优化。通过验证比较得,D-最优设计能应用到酶解体系水解度动力学模型参数的估算,构建的水解度模型为DH=5.781n[(-0.107+55.584[E0]/[S0])×t+1],平均相对误差为6.67%,能较好的从宏观上表征体系的酶解过程,对其工艺条件优化有一定的指导意思和理论依据。在表征过程中引入酶解产物中多肽片段族的分子量和质量百分数两个因素,采用3D图形表征碱性蛋白酶-蓝圆鲹蛋白酶解体系,使其具备更明确的目的性。通过体积排阻色谱测定酶解体系中不同水解度下酶解产物的多肽片段族的分子量分布,对多肽片段族的质量百分含量与水解度、分子量的进行3D曲面函数拟合,得到表征酶解体系的数学表达式为：m=10.4194+1.1209DH-0.0329(DH)2-0.0006(DH)3+0.0999(DH)2·Mw+23.7492Mw-16A377(Mw)2+11.6233(Mw)3-0.8423DH·(Mw)2-2.2178DH·Mw,验证得其平均相对误差为12.75%,表明该3D模型能比较准确的反映酶解体系中质量百分数与水解度和分子量之间的关系,能较好表征酶解体系的反应历程。采用集总动力学表征碱性蛋白酶-蓝圆鲹蛋白酶解体系。依据蓝圆鲹蛋白溶解特性以及组分的动力学特性将酶解体系划为四个集总,并设计其集总动力学反应网络。分别测定了集总组分的米氏常数、产物抑制常数和底物抑制常数等本征动力学参数,并采用Marquardt法估算集总动力学反应网络的动力学参数,对集总动力学模型进行实验验证表明：集总动力学模型能较好的描述碱性蛋白酶-蓝圆鲹蛋白酶解体系中组分的变化规律以及动力学反应机理,对定向获取多肽片段族提供理论支持。
丁青芝[6]2008年在《脉冲超声辅助酶解法制备玉米黄粉ACEI活性肽的研究》文中提出高血压病是最常见的心血管疾病，常引起心、脑、肾等脏器的并发症，严重危害着人类的健康，因此关于高血压药物的研究越来越多。卡托普利等化学合成的血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)类降血压药能够快速降低血压，但是存在咳嗽、首剂低血压效应、皮疹等副作用，所以人们把眼光更多地转向了安全性更高的食源性ACEI活性肽。为开发具有降血压功能的ACEI活性肽，本研究以玉米黄粉(CGM)为原料，通过超声辅助蛋白酶水解的方法制备出天然的ACEI活性肽，然后用超滤的方法对酶解液进行分离纯化，并通过动物试验考察了体内降血压效果。本课题开展了以下研究：以FAPGG(N-[3一(2-furyl)acryloyl]-L-phenylalanylglycyl-glycine)作为底物，以酶标板替代比色皿，以酶标仪替代分光光度计，建立了一种体外快速检测血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)活性的方法--微量法(MA)。经验证，该方法的准确性及精密度良好，检测快速、操作简便、灵敏度高。既适合大规模的活性筛选工作，也能应用于实际生产中的质量控制。用超临界CO_2脱除玉米黄粉中的油脂，脱除率接近90％，且脱脂后，酶解效果较处理前有所提高。测定了脱脂玉米黄粉的主要成分，其蛋白质、脂肪、水分、纤维、淀粉和灰分的含量分别为60．45％、0．43％、8．96％、1．62％、14．23％和0．21％。为了得到高活性、低苦味、低盐的降血压肽，分备用7种商业蛋白酶水解玉米黄粉。以酶解液的IC_50值为指标，选定两种效果较优的蛋白酶(蛋白酶D和E)进一步优化酶解条件。分别对这两种蛋白酶进行单因素(酶解时间、底物浓度、加酶量、pH和反应温度)及响应面优化试验，确定了酶解效果最好的蛋白酶E。优化得到蛋白酶E酶解玉米黄粉的最优条件为：酶解时间40 min，温度50℃，pH 7．0，底物浓度1．75％，加酶量3％，该条件下酶解产物的IC_(50)为0．259mg／mL，产品得率为28．75％。研究了蛋白质酶促水解制备活性多肽的反应机理，通过试验方法结合理论推导，建立了恒定温度下玉米黄粉可控水解动力学模型：V=as_0exp(-bh)==(?)和DH=(?)。求得该体系的热力学和动力学常数为：k_2=9．2732／min，k_d=3．8758／min，K_m=2．7222 g／L，K_s=72．7234 g／L，E_a=17．7936 kJ／mol，E_d=17．9691kJ／mol。动力学常数与温度的关系能较好地符合阿累尼乌斯关系式。验证试验表明，根据动力学模型得到的水解度的理论值与实际试验值基本吻合。因此，所建立的动力学模型可用于蛋白质酶解反应过程的模拟、热动力学常数的计算和生物反应器的设计。分别考察了脉冲超声预处理蛋白酶耦合酶解(PUPPE)、脉冲超声预处理玉米黄粉原料耦合酶解(PUPCE)和酶解过程中施加脉冲超声(PUAE)等叁种超声处理方式对玉米黄粉酶解制备ACEI活性肽效果的影响。结果表明，叁种方式都能有效地促进玉米黄粉的酶解，提高产物的ACE抑制活性，其中UPCE方式效果最好。该方式的最佳参数为：料液体积200mL，超声时间15 min，超声功率1000 W，超声料液初始温度50℃，脉冲超声工作间歇时间比2 s／1 s。与未超声的对照组相比，超声预处理原料后酶解产物的抑制活性提高了74．08％，生产效率提高了55．11％，蛋白转化率提高了55．06％，米氏常数K_m降低了33．30％。这表明脉冲超声辅助酶解法是一种高效制各玉米黄粉ACEI肽的方法。对超声波强化玉米蛋白酶解反应的机理进行了初步的探讨。研究了不同参数超声波对蛋白酶活性以及玉米蛋白可降解性的作用效果。以荧光和紫外光谱为监测手段，研究玉米黄粉蛋白和中性蛋白酶经超声处理后的分子构象变化情况。结果表明，随着超声功率增高，荧光发射强度逐渐发生变化，但发射峰未发生明显变化；紫外吸收强度发生变化，但吸收峰也未发生明显变化。这说明酶和蛋白分子中的整体构象未发生明显变化，但生色基团残基的微环境发生了一定的变化。此时，蛋白酶活力和玉米蛋白的可降解性均发生了明显变化，这表明超声微扰了蛋白和酶的活性部位，活力的变化快于分子整体构象的变化，这是因为酶或蛋白的活性部位位于柔性较大的区域。超声处理没有破坏玉米蛋白和蛋白酶的分子结构和整体空间构象，可能通过改变分子活性部位的局部空间构象，提高了玉米蛋白的可降解性和蛋白酶的催化活性。酶解液依次通过截留分子量10kDa、8kDa、5kDa、3kDa和1kDa的超滤膜进行分离纯化。以IC_(50)和产品得率为指标，选择3kDa的超滤膜。选择喷雾干燥方式对玉米黄粉降血压肽进行干燥，主要工艺参数为进风温度170℃、出风温度75℃。对相对分子量<3 kDa的玉米黄粉水解物进行热稳定性、耐酸碱稳定性和抗肠道酶解能力等性能研究。结果表明，玉米黄粉水解物在不同温度、pH值条件下保存以及与肠道酶在体外作用后仍然保持较高活性。用相对分子量<3 kDa的玉米黄粉水解物分别以75、150和300 mg／kg·bw的剂量对原发性高血压大鼠(SHR)灌胃，SHR的血压明显下降。用玉米黄粉水解物对SHR大鼠进行21天连续灌胃，发现降血压效果稳定。灌胃试验结果证实，玉米黄粉水解物对高血压大鼠具有明显的降血压作用，对血压正常大鼠无降血压作用。
苏荣欣[7]2007年在《蛋白质酶解历程动态特性和多肽释放规律研究》文中提出本文组合应用色谱、质谱、光谱等测试技术,系统地研究了两个极具开发价值的水解体系:牛血红蛋白—胃蛋白酶(体系I)、牛乳酪蛋白—胰酶(体系II),并基于酶学性质和蛋白质结构知识,剖析酶解历程动态特性和多肽释放规律。1.比较体系I在两种不同水解机制下的反应行为。在pH为4.5时,牛血红蛋白保持天然结构,在胃蛋白酶作用下发生顺次水解,底物在反应过程中始终存在;在pH为2.0时,变性的牛血红蛋白在胃蛋白酶作用下发生拉链水解,底物在反应过程中快速转化为中间多肽。胃蛋白酶主要攻击α链全链和β链两端区域,而β链中部区域由于高亲水性而少有剪切。基于多肽释放动力学规律,确定活性多肽最佳制备工艺。进一步根据胃蛋白酶水解特性和牛血红蛋白结构剖析了反应行为。2.跟踪体系I活性多肽相互转化历程。在抗菌肽α107-136向血管舒缓激肽α110-125转化历程中,共涉及6个相关多肽;基于序列分析和多肽释放动力学,构建了反应网络,分析胃蛋白酶对各种肽键的亲和力;依据结构分析推断多肽生物学功能。3.利用反相色谱、离子交换色谱和体积排阻色谱对体系II酶解产物多肽进行分离。在酶解历程中,产物多肽整体上按疏水性向亲水性、多电荷向寡电荷、高分子量向低分子量转变。4.体系II的底物和产物分析。酪蛋白在胰酶作用下,胶束含量逐渐降低,但胶束尺寸和分子量却在水解10min内不断增加。反应24小时内,共释放297个多肽。胰酶攻击单体的速度从快到慢为:β-酪蛋白>αs1-酪蛋白>αs2-酪蛋白>κ-酪蛋白。5.体系II酶解历程的理论模拟和直观表征。利用2-30-30-1的BP模型对酪蛋白酶解历程分子量分布进行模拟;基于该模型完成叁维图形表征,可直观分析胶束区、单体区、巨肽区、长肽区和寡肽区的含量变化。6.酪蛋白磷酸肽的特殊鉴定和释放规律。采用液质联用技术结合中性丢失扫描(SALSA自定义检索模块)和数据库搜索(Sequest蛋白数据库匹对)对酪蛋白磷酸肽(CPPs)进行鉴定;CPPs在串联质谱过程均发生明显的中性丢失现象,利用中性丢失峰,可迅速判断其价态、分子量和磷酸化个数;跟踪了CPPs的释放规律,确定了其最佳制备工艺。7.多肽反相色谱保留行为模型构建及磷酸化影响规律研究。基于365个非磷酸肽,构建了色谱保留时间预测模型;单一和多重磷酸化分别导致多肽整体亲水性的降低和增强,因此分别比非磷酸化对应体较晚和较早洗脱。
刘瑞[8]2005年在《酶解多肽一级序列分析与反应过程建模及结构变化初探》文中认为蛋白质酶促水解反应是在酶的专一性催化作用下使蛋白质水解生成胨、肽等低分子量产物的过程。由于蛋白质高级结构复杂、酶作用位点众多,使得酶解过程具有产物多样性和反应复杂性等特点。本论文在课题组已有研究工作基础上,利用色谱/质谱联用技术以及动态光散射检测方法等多种先进的分析测试手段,从一级序列分析到动力学过程模拟以及高级结构解析等多层次,对蛋白质酶解过程进行了较为详细的研究。具体内容如下:酶解产物反相高效液相色谱(RP-HPLC)分析条件的确定:选取一级序列已知的牛血清白蛋白(BSA)和断裂位点高度专一的胰蛋白酶(Trypsin)组成模式酶解体系,确定了反相色谱的紫外检测波长为214nm,流动相为水-乙腈-叁氟乙酸(TFA)。通过研究流动相中水相-有机相的梯度条件、流动相中离子对试剂TFA含量及流动相流速等因素对分离效果的影响,确定了针对此体系复杂产物分析的适宜梯度洗脱条件,即流动相中TFA含量为0.08%,流动相流速为1.0mL/min。酶解产物液质分析及产物多肽一级序列的确定:采用已确定的反相色谱分析条件,利用RP-HPLC对BSA-trypsin体系酶解全过程中9个不同水解度下的酶解产物进行了色谱分析,并应用液质联用(LC-ESI-MS/MS)技术对产物多肽序列进行了解析。通过bioworks软件和人工检索比对的方法对所得质谱数据进行解析,最终确定出各水解度下不同酶解产物所含的33个多肽的一级序列。酶解多肽色谱保留行为预测模型的建立:运用最小二乘与岭回归两种算法,建立了BSA-Trypsin体系产物多肽的反相色谱保留时间预测模型,经相关分析与残差检验证明:对于酶解多肽,岭回归算法因消除了数据的多重共线性影响,而使所建模型较最小二乘法拟合效果更佳;且对于不同多肽体系,各种模型之间的通用性不强,本文所建模型尤其适于酶解所得多肽的保留时间预测。水解度值预测模型的建立:酶解过程中,水解条件(如底物浓度S、酶浓度E、酶解温度T、酶解pH值以及酶解时间t等)直接影响水解度(DH)值的大小,故其反应机理非常复杂。本文引入神经网络模型的概念,以S、E、T、pH和t作为输入,以DH作为输出,建立了一个由输入层(5个神经元)、两层隐含层(分别含4个神经元和5个神经元)和输出层(5个神经元)构成的神经网络模型。利用大量酶解条件-水解度值数据对模型进行训练和验证,最终建立了较理想的预测反应过程中水解度值的黑箱模型。多肽酶解释放动力学模型的建立:根据不同水解度时酶解产物的质谱总离子
董春华[9]2004年在《酪蛋白—胰酶水解动力学模型及反冲与膜表面改性提高酶膜反应器性能的研究》文中研究表明本文对酪蛋白-胰酶体系间歇和连续水解动力学进行了研究;并分别针对连续酶解过程中浓差极化和蛋白吸附两类主要膜污染现象,考察和优化了反冲技术和表面改性两种方法对膜性能的改善。具体研究内容如下:胰酶失活及其操作稳定性:通过检测不同浓度胰酶失活速率,获得了不同温度下胰酶热失活及自水解表观速率常数;无底物保护时,热失活和自水解将导致间歇操作和连续操作酶失活严重;但在底物酪蛋白的保护下,两种操作中胰酶在5个小时内都表现出较高活性,残余酶活始终接近初始酶活。酪蛋白的胰酶间歇水解动力学研究:研究证明胰酶间歇水解酪蛋白过程存在底物抑制和产物抑制现象,获得动力学常数Km=0.227g l-1,K+2=0.127min-1, Ks=64.1 g l-1和KP= 72.6g l-1,并建立间歇水解动力学方程;依此方程对水解过程进行模拟和优化,实验值和模拟值吻合较好,并得到最优初始底物浓度随水解度变化方程;根据此动力学研究,证明底物酪蛋白对胰酶存在着极强保护作用。酪蛋白连续酶解过程动力学模型:在对酶解机制作出合理假设的前提下,建立了酪蛋白连续酶解过程动力学模型,获得动力学常数Km=19.7g l-1、Vmax=0.284min-1;理论分析该模型可得:高初始底物浓度、高渗透通量是获得高水解效率(S0*J*X)的条件,该结果在恒压操作实验中得到验证。反冲技术的应用:设计了一套简单且易于操作的反冲装置应用于胰酶连续水解酪蛋白过程以降低浓差极化的影响;水被选择为合适的反冲介质;反冲操作条件优化为:反冲压力0.1MPa,反冲时间10s,反冲间隔时间10min;其中反冲压力是影响反冲效率的最主要因素。神经网络在反冲技术模拟中的应用:确定BP神经网络为模拟集反应-分离-反冲于一体的非线性系统的强有力工具;采用一个叁层BP网络模型,模拟了反冲时间和反冲间隔时间对反冲效果的影响,并证明反冲时间对反冲效果的影响程度高于反冲间隔时间;利用已训练网络,优化选择了反冲时间和反冲间隔时间;采用简单网络分别对最优反冲条件下的Je和Jb随时间变化趋势进行了模拟。亲水化改性聚砜超滤膜:确定了最优改性条件为:丙烯酸与磷酸体积比3:1,丙烯酸与四氯化锡摩尔比1:0.05,30oC,反应60min;对改性膜的红外检测表明羧基已被接枝到膜表面;扫描电镜分析证明膜骨架和膜面都未受到损坏,但膜孔有所减少;通过超滤不同浓度的BSA溶液,表明改性膜比未改性膜具有良好的抗蛋白吸附性能;应用改性膜分离酪蛋白酶解液过程中,其截留分子量和渗透通量都比未改性膜的略有降低。
王中斌[10]2010年在《酶解—膜分离耦合制备鱼鳞胶原蛋白抗氧化肽的研究》文中研究说明本课题旨在研究和探索酶解-膜分离耦合技术制备鱼鳞鱼鳞胶原蛋白抗氧化肽的制备工艺。为了探索鱼鳞胶原蛋白抗氧化肽的最佳酶解制备方法,在传统酶解反应的基础上对比性地研究了分步式酶解-膜分离法、不补料酶膜耦合法、梯度稀释补料酶膜耦合法叁种反应模式的酶解效果和动力学常数。以鱼鳞胶原蛋白为原料,进行7种商业蛋白酶进行选酶试验。以对DPPH自由基清除率为指标,确定后续试验水解蛋白酶为Alcalase 2.4 L,并进行响应面优化试验。以酶解液的对DPPH自由基清除率和蛋白转化率为指标,优化间歇酶解反应制备鱼鳞胶原蛋白抗氧化肽的反应条件。用截留分子量为10、8、5、3 kDa的超滤膜依次对间歇酶解液进行膜过滤。收集最终透过3 kDa超滤膜的组分,计算生成该组分的间歇酶解反应的酶解参数和动力学常数。间歇酶解反应制备鱼鳞胶原蛋白抗氧化肽肽的最优工艺条件为：底物浓度4%,加酶量1%,反应液pH 9.0,反应温度50℃,反应时间30 min。在最优工艺条件下,蛋白转化率95.31%,多肽得率71.47%,单位酶产肽量71.58 g肽·(g酶)-1,EC50为14.04 mg·mL-1,米氏常数Km为73.64 g·L-1,蛋白酶转换率Kcat为5.81 min-1。以酶解液的蛋白转化率为指标,优化不补料连续酶膜耦合反应制备鱼鳞胶原蛋白抗氧化肽的反应条件。收集最终透过3 kDa超滤膜的组分,计算生成该组分的不补料连续酶膜耦合反应的酶解参数和动力学常数。不补料连续酶膜耦合反应制备鱼鳞胶原蛋白抗氧化肽肽的最优工艺条件为：底物浓度4%(W/W)、加酶量1.5%、反应时间30 min、反应温度60℃、循环泵转速120 r·min-1和pH 9.5。该条件下蛋白转化率为97.70%,多肽得率为50.56%,单位酶产肽量为142.67 g肽·(g酶)-1,EC50为14.84 mg-mL-1米氏常数Km为35.74 g·L-1,蛋白酶转换率kcat为47.15 min-1。以酶解液的蛋白转化率为指标,在不补料连续酶膜耦合反应试验的基础上探讨了梯度稀释连续酶膜耦合制备鱼鳞胶原蛋白抗氧化肽的反应并计算生成该组分的酶解参数和动力学常数。在底物浓度4%、加酶量1.5%,循环泵转速120r-min"1,反应温度50℃,反应液pH9.0的操作条件下,进行未反应底物浓度为3.5%、3%、2.5%、2%、1.5%、1%、0.5%、0%原料的补料连续酶膜耦合反应。当膜污染问题比较严重时停止反应。酶解反应结果：共消耗蛋白液8000 mL,反应时间190 min蛋白转化率高达97.42%,多肽得率73.83%,单位酶产肽量258.65g肽·(g酶)-1,ECso为18.24 mg·mL-1,米氏常数Km为35.41 g·L-1,蛋白酶转换率kcat为1.27min-1。酶膜耦合反应通过消除产物抑制效应,强化了反应过程,提高了蛋白转化效率；通过产物在线分离,避免了多肽的过度降解,有助于产物活性的提高；通过酶的循环利用,显着提高了单位酶的产肽量。
参考文献：
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