SPE-UPLC测定血液中苯二氮卓类药物

张彪，敖沛尧，靳浩然，张岚

(锦州市公安司法鉴定中心，辽宁 锦州 121000)

摘要: 目的 以地西泮、阿普唑仑、三唑仑、艾司唑仑作为测定药物，建立固相萃取仪(SPE)提取和超高效液相色谱仪(UPLC)测定血液中苯二氮卓类药物的方法。方法 固相萃取以HLB为萃取柱，甲醇为洗脱液；液相色谱法以甲醇∶0.1%三乙胺-醋酸(pH=4.50)60∶40为流动相，流速1 mL/min，二极管阵列检测器(DAD)，检测波长230 nm。结果 采用内标-标准曲线法，地西泮、艾司唑仑、阿普唑仑、三唑仑在1～200 μg /mL 内线性关系良好，相关系数(r)均大于0.997；灵敏度高，液相最小检出限在0.15～0.47 μg/mL之间；回收率良好，液相色谱法回收率为78%～105%；精密度良好，相对标准偏差RSD均小于5%。结论 固相萃取仪结合HLB柱提取血液中苯二氮卓类药物，操作简便快速，回收率高。UPLC-DAD方法有更好的回收率和重现性，对血液中苯二氮卓类药物的检测更为适用。

关键词： 苯二氮卓类药物；血液；固相萃取仪；超高效液相色谱仪

苯二氮卓类药物是临床应用最为广泛的一类安眠药，在公安领域刑事案件检验中经常发生麻醉抢劫、麻醉强奸、药物中毒以及药物滥用案件，因此，有必要建立一种快速、简便、准确的检验鉴定分析方法。通过对血液中这类药物成分的分析检验，可为案件的侦破提供科学有力的证据。

教学实验时间从2017年2月起，至2018年1月结束。实验期间，每学期安排阶段测试2次，期中考试、期末考试各1次。每次考试时，实验班、对照班使用相同的试卷，试卷难度与题量均符合中专学校数学课程大纲的要求。考试采用闭卷形式，卷面满分为100分。考试时，4个班学生混编考场，随机安排考位。考后由任课教师批阅试卷，做到评分标准一致。

目前，文献报道的检测镇静催眠药的方法主要包括高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)^[1]和气相质谱联用检测方法(GC/MS)^[2-3]。GC/MS虽然在药物定性方面具有较大优势，但不能达到足够高的灵敏度和稳定性^[4]，而HPLC-MS/MS^[5-6]法具有灵敏度高、专属性好的特点，但是由于仪器价格昂贵，普及程度不够，推广性较差。SPE固相萃取实现了选择性的提取分离一体化，UPLC/DAD法可通过保留时间和紫外图谱双重定性，专属性较强，且仪器普及程度高，易于推广，是一种比较理想的技术手段。

1 材料与方法

1.1 实验仪器与试剂

主要仪器：超高效液相色谱仪(Thermo Fisher UltiMate3000)、全自动固相萃取仪(Gilson GX-271)。标准品：地西泮、三唑仑、阿普唑仑、艾司唑仑标准品(公安部物证鉴定中心，浓度依次为0.997、0.988、1.009、1.004 mg/mL)。内标物：普罗地芬SKF_525A(公安部物证鉴定中心，100%纯度)。固相萃取小柱：Waters Oasis HLB 3cc/60 mg,30 μm。

1.2 实验方法

精密吸取1 mL血液3份置于试管内，分别加入10、100、1000 μg/mL的混合标准溶液0.1 mL，pH=10.80的NaHCO₃-Na₂CO₃缓冲液0.2 mL，混匀，超声震荡5 min，1000 r/min离心10 min，取上清液于试管中。

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如图所示，图1是一张三维合成图谱，X轴是保留时间，Y轴是吸收值，Z轴是紫外波长，光标放在任意一点都是一张色谱图和一张紫外光谱图，颜色越鲜艳说明紫外吸收越强。因此可以通过保留时间不同和紫外光谱图不同来区分药物，做出定性。

1.3 仪器条件

结果表明，4种苯二氮卓类药物在1～200 μg/mL浓度范围内线性关系良好(见图3、图4、图5、图6)，液相色谱仪数据结果R在0.997以上。

2 结 果

2.1 定性结果

用UPLC测定四种标准品的混合溶液，得到液相色谱图和紫外光谱图。见图1、图2。

图 1 UPLC中 4种物质的 DAD图

图 2地西泮、阿普唑仑、艾司唑仑、三唑仑紫外光谱图

取用HLB固相萃取小柱，依次用5 mL甲醇、5 mL水和5 mL pH=10.80的NaHCO₃-Na₂CO₃缓冲液以1 mL/min的流速活化柱子，上清液以0.5 mL/min过柱，5 mL蒸馏水以1 mL/min洗去水溶杂质，通入空气120 mL，5 mL甲醇以流速0.5 mL/min洗脱药物，收集洗脱液于试管中。最后于40 ℃水浴上蒸发至干，1 mL甲醇定容。

以信噪比为3计算检出限，即D=3/(S/N)×浓度，以液相色谱检测1 μg/mL混合标准品时的信噪比，分别求得结果，见表1。

2.2 最小检出限

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表 1UPLC测定 4种苯二氮卓类药物的最小检出限

2.3 线性范围

用移液枪精密吸取已配好的浓度为1、10、100 μg/mL的混合标准溶液(含内标)各100 μL，分别加入1 mL血液中，按2.2前处理方法进行提取，经过固相萃取后40 ℃水浴挥干定容到100 μL，依次进入超高效液相色谱仪，每个样品重复进样5针。所得峰面积与相应的内标峰面积之比As/Ai为y，代入到相应标准曲线中，所得x 即测得的浓度。求算5个平行数据的RSD%值，用来表示精密度，见表3。

仪器：Thermo Fisher Ultimate3000 检测器：DAD 检测波长230 nm。色谱柱型号：DBS Hypersil C18，5 μm，250 mm×4.6 mm。流动相：甲醇：0.1%三乙胺-醋酸(pH=4.50)=60:40 流速：1 mL/min。

图 3 UPLC测定地西泮标准曲线 图 4 UPLC测定阿普唑仑标准曲线

图 5 UPLC测定艾司唑仑标准曲线 图 6 UPLC测定三唑仑标准曲线

表 2UPLC测定 4种药物的回归方程、线性范围 和相关系数

2.4 精密度与回收率

将混合标准溶液稀释成1、10、50、100、200 μg/mL一系列浓度梯度，内标物SKF_525A浓度为10 μg/mL，每种浓度的溶液重复进样5次，得到的色谱峰As与相应的内标峰Ai作比，以As/Ai为纵坐标，以浓度为横坐标作标准曲线，求得回归方程和相关系数，见表2。

表 3UPLC测得血液中 4种苯二氮卓类药物的 回收率和精密度

液相色谱仪测定结果回收率78%～105%，均可满足血液中4种药物的测定。

3 结 论

提取方面，Gilson全自动固相萃取仪结合HLB小柱，在常用活化步骤中加入缓冲液，洗脱一步中选用甲醇，可以达到很好的提取效果，此提取方法操作简便快速、溶剂消耗量小、能够达到微量样品的提取要求，且有较高的回收率。

检测方面，超高效液相色谱仪为血液中的4种苯二氮卓类药物定性，DAD检测器，既能通过保留时间准确区分不同药物，还能通过紫外光谱图的不同进行区分，因此定性可靠性高；定量检测中，超高效液相色谱仪有较高灵敏度，液相色谱法的最小检出限为0.15～0.47 μg/mL。测定地西泮、艾司唑仑、阿普唑仑、三唑仑在1～200 μg /mL 内有良好线性关系，相关系数(r)在 0.997以上。液相色谱仪的回收率为78%～105%，精密度良好，相对标准偏差RSD均小于5%。

与文献相比，SPE-UPLC-DAD检测结果的回收率和灵敏度明显高于现有的气相色谱-质谱联用方法和气相方法^[3]202-205，但低于HPLC-MS/MS方法^[1]46-49。

In Eq. (7) N = 2 × 1015 m−2[17], which is the electron density in the ith eigen-state at T = 0 K.

参考文献：

[1] 王朝虹，张琳，赵蒙，等. 超高效液相色谱-质谱定量测定全血中的13种苯二氮卓类安眠镇静药物[J].刑事技术，2016，41(1):46-49.

[2] 高丽娜，宋洋，祝娟，等. 固相萃微取结合气质联用测定血浆中敌草快[J].中国法医学杂志，2014，29(5):427-430.

[3] 王丹，孟品佳，龚舜. 中空纤维液相萃取-气质联用检测血液中的三唑仑[J]. 中国法医学杂志，2014，29(3):202-205.

[4] 严爱花，李贤良，郗存显，等. 固相萃取-液相色谱-串联质谱法同时检测猪肉中18种苯二氮卓类药物残留量[J].食品与发酵工业，2013，39(4):173-179.

[5] 孙会会，仲建军.LC-MS/MS同时分析血液8种苯二氮卓类药物[J].化学工程师，2016，5:30-32、45.

[6] 向丽君，张云峰，薛敏，等. UPLC-MS/MS法检测血痕中常见烟草、毒品和药物成分[J]. 中国法医学杂志，2014，29(3):206-213.

Determination of Benzodiazepine in Blood by SPE -UPLC

Zhang Biao，Ao Peiyao，Jin Haoran，Zhang Lan

(Forensic Center of Public Security of Jinzhou，Jinzhou 121000 China)

Abstract ：Objective To establish a model where four kinds of benzodiazepine in the blood，including diazepam，alprazolam，estazolam and triazolam，are extracted by solid phase extraction(SPE) and determined by ultra-performance liquid chromatography(UPLC). Methods HLB was used as column extractor，and methanol as extraction liquid for solid phase extraction. The mobile phase of UPLC was methanol∶0.1% triethylamine-acetic acid(pH=4.50) 60∶40 with a flow rate of 1mL/min. Diode array detector(DAD) was used and the determination wavelength was 230nm. Results The data was processed with the standard curves of internal standard. The calibration curves showed a linear determination range of 1～200 μg/mL，and a correlation coefficient of more than 0.997. The method boasted a high sensitivity with the minimum detection limit of UPLC of 0.15～0.47 μg/mL. The rate of recovery of liquid chromatograph turned to be high which was 78%～105%. The precision was found to be good with a relative standard deviation(RSD) of less than 5%. Conclusion SPE with HLB column is handy and rapid to extract benzodiazepine in the blood with a high recovery rate. UPLC-DAD features higher recovery rate and better reproducibility，which is more suitable for the determination of benzodiazepine in the blood.

Key words :benzodiazepine；blood；SPE；UPLC

中图分类号： R446. 11

文献标志码： A

文章编号： 2096-305X( 2019) 05-0015-03

作者简介： 张彪(1980)，男，辽宁锦州人，工程师，双学士学位，主要研究方向为毒物毒品检验。

收稿日期： 2019-03-18

标签：苯二氮卓类药物论文;  血液论文;  固相萃取仪论文;  超高效液相色谱仪论文;  锦州市公安司法鉴定中心论文;