杨妙芳[1]2004年在《核糖体S6激酶在大鼠肝纤维化发生中的作用》文中研究表明【研究背景及目的】 肝纤维化是慢性肝病发展为肝硬化的共同路径，其病理特征表现为细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的异常沉积。大量研究资料表明，活化的肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)是肝纤维化时ECM的主要来源。HSC的激活是肝纤维化发生、发展的中心环节。 目前研究表明，HSC的增殖和胶原合成与有丝分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)级链信号通路密切相关。MAPK通路是细胞内蛋白磷酸化信号传递系统的枢纽。真核细胞中存在叁条经典的MAPK通路：细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)通路，Jun激酶(Jun kinase，JNK)通路和p38 MAPK通路。其中，ERK通路主要被生长因子、多肽类激素以及神经递质激活，控制着细胞增殖、分化、生存和凋亡，与多种脏器，例如肝脏、肾脏、肺以及胰腺的纤维化密切相关。 核糖体S6激酶(ribosomal S6 kinase，RSK)，分子量约为90 kDa，隶属于生长因子活化的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶家族，位于ERK基因下游，在多种细胞的生理及病理过程中发挥调节基因转录、细胞周期及维持细胞生存等作用，与多种慢性疾病及肿瘤的发生关系密切，但目前国内外尚无RSK与肝纤维化的相关性研究报道。 本研究的目的旨在通过Northern印迹、免疫组化、免疫荧光双标记-激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope，LSCM)成像等技术，研究RSK在纤维化肝组织中的表达、定位，以及与胶原表达和ERK信号通路的相关性，探讨RSK在肝纤维化发生中的作用，进一步明确和完善ERK信号通路与肝纤维化发生的关系。 【实验方法】 1、大鼠肝纤维化模型的构建 雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠45只，体重250-300g，随机分为正常对照组(n=15只)和模型组(n=30只)。模型组腹腔注射二甲基亚硝胺第二军医大学硕士学位论文中文摘要(dimethylnitrosamine，DMN)生理盐水溶液10 mg/kg，对照组腹腔注射等体积生理盐水，每周连续注射3d，持续3周。分别于注射第1、2、3周末，取肝组织标本，部分制成石蜡切片，行HE和VG染色;部分行RNA抽提，一80℃贮存备用。 2、大鼠纤维化肝组织中RSK及I、IJI型胶原的表达 将抽提的大鼠肝组织RNA，按造模时段进行样本合并，行2%琼脂糖凝胶电泳及核酸定量检测，以Norihem印迹检测不同时期纤维化肝组织中RSK的mRNA变化;利用免疫组化SABC法检测相应的纤维化肝组织中RSK和I、m胶原的表达，图像扫描半定量结果进行统计学分析。 3、RSK与ERK信号通路相关性研究 以*平滑肌肌动蛋白(a--smooth musele aetin，。SMA)作为活化的HsC的定位标志，采用免疫荧光双标记一激光扫描共聚焦显微镜(l aser scanning confocalmicroscope，LsCM)成像技术，明确RSK在纤维化肝组织中的细胞定位，以及与ERK和I型胶原之间的表达定位关系。 本实验室前期构建了针对ERKI基因RNA干扰的真核表达载体(pAV‘ERKI 51洲A)，并转染Hse·T6(表型为活化的Hse株)，通过G4ls筛选后建立稳定表达细胞株(Hsc一pAv-EI引KI siRNA)。本实验进一步利用免疫印迹检测转染前后HSC一T6中ERK和RSK的表达变化。【实验结果】 1、大鼠肝纤维化模型的建立 HE和VG染色显示，随着DMN注射时间的延长，肝细胞坏死及组织内纤维沉积逐渐增加，至造模结束，肝组织中可见典型的假小叶形成。该模型病理改变典型，病程时段区分明确。 2、RSK在大鼠肝纤维化不同时期的表达及其与I、m胶原的相关性 Northem印迹结果表明，随着DMN注射时间的延长，RSK的mRNA表达较正常对照组进行性增加;图像灰度扫描半定量显示，DMN注射1、2、3周后，RSK的表达量分别较对照组增加了60%、80%和140%。 免疫组化染色结果显示，RSK在正常大鼠肝组织中仅有少量表达，分布在中央静脉周围的肝血窦;在肝纤维化进程中，其表达量进行性增加，与I型、m第二军医大学硕士学位论文中文摘要型胶原的变化趋势一致。图像扫描半定量数据进行统计学相关和回归分析结果证实，RSK与I型、nl型胶原的表达存在直线相关(p<0.05)。 3、RSK与ERK相关性研究 LSCM成像结果显示，在正常肝组织中，RSK、ERK和a一SMA几乎无表达;在纤维化肝组织中，叁者表达量均明显增加，分布区域完全一致，提示在纤维化肝组织中，RSK和ERK表达同步增高，且主要定位于活化的HSC中。 免疫印迹检测结果证实，RNA干扰后HSC一T6中ERK在蛋白水平表达较对照组下降了72%，RSK同时下降了89%。【结论】 1、在纤维化肝组织中，RSK与I、m胶原表达呈直线相关，提示RSK可能参与胶原的表达调控。 2、在活化的HSC中，RSK与ERK变化一致，表明RSK介导了HSC中ERK通路的信号传递。 3、ERK/RSK信号通路与肝纤维化的发生密切相关。 4、RSK可能成为治疗肝纤维化新的靶点。
杨妙芳, 张新, 强晖, 孙田美, 谢渭芬[2]2005年在《核糖体S6激酶与大鼠肝纤维化相关性研究》文中认为目的 探讨核糖体S6激酶(RSK)在大鼠肝纤维化发生中的作用。方法 采用腹腔注射二甲基亚硝胺的方法构建大鼠实验性肝纤维化模型。以免疫荧光双标记 激光扫描共聚焦显微镜成像技术检测RSK与α-平滑肌肌动蛋白(α- SMA)及Ⅰ型胶原。进一步利用免疫组化法检测 RSK与Ⅰ、Ⅲ型胶原在肝纤维化组织中的表达及其相关性。结果 在纤维化肝组织中,RSK的定位与α-SMA完全一致,Ⅰ型胶原伴随RSK周围分布。RSK与Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达量之间亦呈显着相关(P<0.05)。结论 肝纤维化发生中,RSK定位于活化的肝星状细胞内,并参与胶原的表达调控。RSK可能成为治疗肝纤维化的新靶点。
杨妙芳, 谢渭芬1, 张新, 强晖, 孙田美[3]2004年在《核糖体S6蛋白激酶在大鼠肝纤维化组织中的表达》文中提出目的 :探讨有丝分裂原活化的蛋白激酶级联信号通路的关键效应分子——核糖体 S6蛋白激酶 (ribosom al S6 ki-nase,RSK)与肝纤维化发生的关系。 方法 :采用皮下注射二甲基亚硝胺 (dimethylnitrosamine,DMN)的方法制备大鼠肝纤维化模型 ,根据注射时间的不同 ,获取组织标本 ,行 H- E和 VG染色。明确纤维化分期后 ,进一步利用 Northern印迹及免疫组化方法 ,观察 RSK在肝纤维化进程中的表达变化情况。 结果 :RSK在正常大鼠肝脏中 ,仅在中央静脉周围的肝血窦有少量表达 ,而随着纤维化的进展 ,其表达量进行性增加 ;在纤维化肝脏 ,RSK主要分布于汇管区间质中 ,肝细胞未见染色。结论 :RSK在肝纤维化进程中持续上调 ,可能在肝纤维化的发生中起重要作用
强晖[4]2003年在《肝纤维化相关基因的筛选及其功能初步研究》文中提出研究背景及目的 肝脏损伤与肝纤维化的关系密切，各种病因所致的肝脏损伤引起局部的炎症，继而成纤维样细胞增生并由此导致肝内细胞外基质成分(extracellular matrix,ECM)异常沉积形成肝纤维化。肝纤维化是慢性肝病共有的重要病理特征，也是进一步向肝硬化发展的主要中间环节，属可逆性病变。目前对肝硬化尚缺乏有效的治疗手段，因此对肝纤维化的研究成了近20年世界医学攻关的一个热点。有关肝纤维化发生机制的研究取得了长足的进展，但迄今为止肝纤维化发生的确切机制尚未明确，阐明肝纤维化发生机制并寻求有效的治疗方法具有重要临床意义。 肝纤维化发病机制的复杂性日趋明显，需要用更新的技术手段来阐明。cDNA微阵列技术(cDNA microarray technology)，又称基因芯片技术(gene chip technology)，可同时检测成百上千个基因的表达。自从九十年代初以美国Affymetrix公司Fodor等首先开展基因芯片技术以来，该技术已被成功地应用于基因功能研究的各个领域，进行的大规模基因表达已成为研究病理生理过程的卓有成效的研究方法。但有关cDNA微阵列技术研究肝纤维化发病机制的报道极少。应用该技术寻找急、慢性肝损伤时差异表达的基因，将有助于阐明肝纤维化的发病机制，并为诊断和治疗肝纤维化提供新的靶点。为此我们进行了以下研究筛选肝脏损伤相关基因，并利用RNA干扰技术初步研究其在肝纤维化中的作用。实验包括四部分：1)cDNA微阵列筛选急性肝损伤相关基因；2)cDNA微阵列筛选肝纤维化相关基因；3)有丝分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路相关基因在肝纤维化形成过程中的表达；4)细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinases,ERK)基因在大鼠肝星状细胞中的作用。 实验方法 一．cDNA微阵列筛选急性肝损伤相关基因 雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠30只，分别用95％肝切除术和皮下注射四第二军医大学博士论文中文摘要氯化碳(c arbon tetrachioride，Ccl4)两种方法制备急性肝损伤大鼠模型，随机分为手术造模组(n=10)、手术对照组(n=10)、CCI;造模组(n=5)和Ccl‘对照组 (n=5)。手术造模组大鼠行95%肝切除，手术对照组剖腹牵拉肝组织后缝合，术后48hr取肝组织;CCI;造模组大鼠皮下注射60%(v/v)cCI;，CC14对照组皮下注射等体积精制橄榄油，注射后48hr取肝组织。将上述4组大鼠肝组织的mRNA提取后，制备成cDNA探针，与含1 176条大鼠基因的微阵列进行杂交及扫描，计算机数据处理分析后两组数据比较。同时比较造模组和对照组大鼠血清丙氨酸氨基转移酶(Al丁)、天门冬酸氨基转移酶(AST)、凝血酶原时间(PT)和肝组织病理学的变化。采用半定量逆转录聚合酶链反应(reversetranscription pol卿erase ehain reaetion，盯一PeR)验证部分基因的表达。 二.cDNA微阵列筛选肝纤维化相关基因 雄性SD大鼠85只，随机分为二甲基亚硝胺(dimethylnitrosamine，nNIN)造模组(n=20)、DMN对照组(n=15)、CCI;造模组(n=30)和CC14对照组(n=20)，分别用DMN和cCI;诱导大鼠肝纤维化。DMN组于用药1周、2周、3周分别提取肝组织总RNA，CC14组于用药2周、4周、6周、8周分别提取肝组织总RNA，4组分别分离纯化mRNA，逆转录并用[a一33PldATp制备探针，与含1 176个基因的大鼠cDNA微阵列杂交及洗涤，信号检测，微阵列图像分析，计算机软件处理数据，将所得的数据进行比较。数据分析，总结与肝纤维化形成相关的信号通路。采用半定量RT一PCR验证部分基因的表达。 叁.MAPK信号通路相关基因在肝纤维化形成过程中的表达 采用Northem印迹法(Northem Blot)验证部分MAPK信号通路相关基因如ERK一、蛋白激酶C一eta(protein kinase C eta type，pKC一eta)和核糖体蛋白56激酶(rsbosomal protein 56 kinase，RSK)在转录水平的表达;采用免疫组织化学法检测信号通路关键基因一ERK在肝纤维化形成过程中蛋白水平的表达和定位及其与I、111型胶原表达的相关性。 四.ERK基因在大鼠肝星状细胞中的作用 免疫细胞化学法检测信号通路核心基因一ERK分别在原代培养的肝星状细胞(hepatie stellate eell，HsC)和活化的HsC株Hse一T6中的表达和定位。设计和合成针对ERKI mRNA靶序列的小干扰胭A(small inierfering RNA，51胭A)，第二军医大学博士论文中文摘要构建干扰RNA的真核表达载体，电穿孔转入HSC一T6，G418筛选建立稳定表达细胞株。对RNA干扰前后的HSC一T6，分别用RT一PCR、Westem blot及免疫细胞荧光染色法检测ERKI的表达变化;MTS检测加入血小板衍生生长因子(platelet一derived growth factor，pDGF)前后细胞增殖情况的变化;流式细胞仪检测细胞周期和凋亡指数的变化。 实验结果 一cDNA微阵列筛选急性肝损伤相关基因 急性肝损伤造模组与对照组外周血转氨酶有明显差异，造模组ALT和AST较对照组升高5倍以上(尸<0.05);大鼠肝大部切除前后PT有明显差异，手术前PT为8.42士1.43 se。，手术后PT为27.46士14.08 see，手术后PT较术前组延?
张坤[5]2013年在《CTGF/整合素/FAK信号通路在肝纤维化中的表达变化以及肝复康的调节作用》文中研究说明研究背景和目的：肝纤维化是慢性肝脏疾病发展为肝硬化甚至肝癌的渐进性病理过程，是肝脏在多种损伤因素作用下发生的慢性代偿性修复反应。肝纤维化的发生机制比较复杂，涉及到细胞与细胞、细胞与基质之间的相互作用，并且有多种细胞因子参与。因此，肝纤维化的分子生物学机制一直是研究的热点内容之一。结缔组织生长因子（connective tissue growth factor, CTGF）是一种多功能的分泌性多肽，可以调节细胞增殖、分化以及黏附等生物学活性，在组织损伤修复、细胞外基质合成等方面发挥重要作用。研究证实，CTGF在肝纤维化中发挥促进纤维化发生发展的正调节作用。整合素是存在于肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）等细胞表面的受体蛋白，近年研究发现CTGF可以通过与整合素受体结合调节细胞内信号通路的活性。黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）是整合素信号通路中重要的细胞因子，激活后可以进一步启动下游一系列细胞信号级联反应。目前，CTGF促进肝纤维化的分子生物学机制还未完全明了，CTGF/整合素/FAK信号通路与肝纤维化的关系也尚无明确报道。传统中药在慢性肝脏疾病治疗中取得了一定的疗效，复方中药肝复康在治疗肝纤维化等慢性肝脏疾病中能够发挥有效成分丰富、生物学靶点多样等优点。本课题组已有研究发现肝复康能够明显改善肝功能、抑制炎症反应和延缓纤维化的进展过程。然而肝纤维化的发生机制中有多种细胞因子以及多条细胞信号通路参与，因此，肝复康的治疗肝纤维化的分子机制仍需完善。本研究的目的在于：第一，观察CTGF/整合素/FAK信号通路中CTGF、整合素α5β1、纤连蛋白（fibronectin，FN）、FAK、蛋白激酶B（protein kinase B, PKB或Akt）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、核糖体S6蛋白激酶（ribosomal protein S6kinase，P70S6K）等关键蛋白分子在肝纤维化中的表达变化，探讨CTGF/整合素/FAK通路在肝纤维化中的作用；第二，观察肝复康对CTGF/整合素/FAK信号通路在肝纤维化中表达的影响，进一步研究肝复康治疗肝纤维化的分子生物学机制。方法：采用皮下注射CCl4法复制肝纤维化动物模型：将50只SD大鼠随机分为5组，分别为正常对照组、模型组、肝复康大、中、小剂量治疗组，每组10只。除正常对照组外，其余各组大鼠皮下注射以橄榄油稀释的10%CCl4（5ml/kg），每周2次，正常对照组只注射同等体积的橄榄油；在肝复康大、中、小剂量治疗组，从注射CC14后第9周开始，分别每天给予肝复康（3125mg/kg、312.5mg/kg和31.25mg/kg）灌胃，至第20周结束。乙醛刺激法激活体外培养的HSCs：将传代培养的HSCs随机分为叁组，分别为正常对照组：在含10％正常对照组血清的DMEM细胞培养基上常规培养；模型组（乙醛刺激）：在含10％正常对照组血清的DMEM细胞培养基中加入乙醛（终浓度200μmol/L）；肝复康治疗组（乙醛刺激+肝复康含药血清）：在含10%的肝复康药物血清DMEM细胞培养基中加入乙醛（终浓度200μmol/L）。应用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）、免疫组织化学（IHC）以及免疫蛋白印迹（Western-blot）方法，检测各组大鼠肝组织中以及各组HSCs中CTGF/整合素α5β1/FAK信号通路中关键细胞因子的表达情况。结果：1. CTGF、纤连蛋白和整合素α5β1在肝纤维化中的表达及肝复康的干预作用RT-PCR、Western-blot和免疫组化法观察大鼠肝组织中CTGF、整合素α5、整合素β1以及纤连蛋白的表达情况，结果显示，与正常对照组相比，肝纤维化模型组中各指标的表达在mRNA水平和蛋白水平均有明显提高（P﹤0.01）；而在肝复康治疗组中，CTGF、整合素α5、整合素β1以及纤连蛋白的表达量比模型组明显下降（P﹤0.01）。体外培养的HSCs中，乙醛刺激激活的HSCs模型组中，CTGF、整合素α5、整合素β1以及纤连蛋白的mRNA表达水平比正常对照组明显升高（P﹤0.01）；而经过肝复康含药血清作用后，与模型组相比，各指标的基因表达量明显下降（P﹤0.01）。2. FAK/Akt信号通路在肝纤维化中的作用以及肝复康的调节与正常对照组相比，肝纤维化模型组大鼠肝组织P-FAK和P-Akt的表达显着增多（P﹤0.01）；肝复康治疗组中二者的磷酸化程度与模型组相比，有明显下降（P﹤0.01）。RT-PCR结果显示，模型组的大鼠肝组织α-平滑肌肌动蛋白（α-smoothmuscle actin, α-SMA）mRNA表达水平与正常对照组相比明显增高（P﹤0.01）；肝复康治疗后大鼠肝组织α-SMA mRNA表达量较模型组明显减少（P﹤0.01）。正常对照组HSCs表达少量的FAK，Akt以及α-SMA mRNA；模型组HSCs上述基因表达水平比正常对照组明显升高（P＜0.01）；肝复康含药血清治疗组HSCs表达FAK，Akt以及α-SMA mRNA水平比模型组明显下降（P﹤0.01）。3. mTOR/P70S6K信号通路与肝纤维化的关系以及肝复康的抑制作用mTOR、P70S6K、I型胶原和III型胶原mRNA在正常对照组中表达量很少；而在模型组中，以上指标的表达水平明显上调，比正常对照组明显增多（P﹤0.01）；在肝复康治疗组中，肝复康明显下调了各指标的mRNA表达水平，与模型组相比，明显降低（P﹤0.01）。与正常对照组相比，模型组大鼠肝组织cyclinD1mRNA和蛋白的表达水平均有明显升高（P﹤0.01）；而肝复康治疗后，二者合成量较模型组明显减少（P﹤0.01）。正常对照组HSCs中，mTOR、 P70S6K、cyclinD1、I型胶原和III型胶原mRNA表达量极少；而乙醛刺激的HSCs模型组中，以上细胞因子的基因表达量比正常对照组明显增多（P﹤0.01）；肝复康含药血清作用后的HSCs与模型组相比，上述指标的表达水平显着下降（P﹤0.01）。结论：1. CTGF/整合素α5β1/FAK信号通路的激活促进了实验性大鼠肝纤维化的发生发展。2.体外培养HSCs的激活、增殖与CTGF/整合素α5β1/FAK信号通路的活化有关。3.肝复康通过抑制CTGF/整合素α5β1/FAK信号转导系统的表达和激活，在体内和体外实验两方面，干预肝纤维化的进展，从而起到治疗肝纤维化的作用。
赵利峰[6]2008年在《肝脏细胞生长相关基因在大鼠肝再生中表达模式和作用分析》文中研究表明肝脏有很强再生能力,部分肝切除(partial hepatectomy, PH)后,残肝细胞经过激活、增殖、再分化及组织结构重建等生理生化活动、持续约一周时间将丢失的肝组织补偿,这一过程称为肝再生(liver regeneration, LR)。各种肝脏细胞生长是肝再生中主要的生物学事件,因此,系统了解参与各种肝脏细胞生长的基因在肝再生中的表达谱及支配的生理生化活动对阐明肝再生分子机理有重要方面。以往相关报道多研究特定肝脏细胞生长中单个或几个基因在肝再生中的作用,但关于各种肝脏细胞生长涉及的众多基因在肝再生中综合作用,国内外尚未见报道。为此,本文通过检索NCBI、KEGG、RGD等网站资料和查阅相关文献,找出了参与肝脏干细胞、肝细胞、胆管上皮细胞、枯否氏细胞、肝内皮细胞、肝星形细胞、陷窝细胞、树突状细胞、平滑肌细胞等九种肝脏细胞生长的基因,用含28700个基因、占大鼠基因组90%基因的Rat Genome 230 2.0芯片检测了大鼠部分肝切除后恢复23个时点的大鼠再生肝基因表达谱,确定了鉴定肝再生相关基因标准,用生物信息学和系统生物学等方法分析了这些基因在大鼠肝再生中的表达模式和互作关系。同时,用荧光定量PCR检验了g6pc、lifr、cd68和npas2等四个基因在肝再生中的表达变化,以判断Rat Genome 230 2.0芯片检测结果的可靠性。研究结果表明,随机抽取的四个基因的荧光定量PCR检测结果与Rat Genome 230 2.0芯片检测结果基本一致。各种肝脏细胞生长相关基因主要在肝再生启动阶段起始表达,在不同时期发挥作用。53%基因表达增强,38%基因减弱,9%基因表达不显着,其中,参与肝脏干细胞、肝细胞、胆管上皮细胞、枯否氏细胞、肝内皮细胞、肝星形细胞、陷窝细胞、树突状细胞、平滑肌细胞生长的135、348、295、133、222、100、156、156、151个基因中42、96、88、51、62、33、52、38、54个与肝再生相关。上述肝脏细胞肝再生相关基因都呈现均上调、上调占优势、均下调、下调占优势、上调和下调相近等5种表达趋势和17、29、12、19、27、23、20、9、23类表达模式,除肝细胞外,参与胆管上皮细胞、枯否氏细胞、肝内皮细胞、肝星形细胞、树突状细胞和平滑肌细胞生长的肝再生相关基因均呈现4组时间相关性。上述基因各形成103、244、211、185、144、29、98、69和68条关联,其中,myc、fos、mapk8、akt1、igfbp1、crebbp等的关联较多。上述结果表明,Rat Genome 230 2.0表达谱芯片的分析结果基本可靠;本文的研究策略和方法是研究各种肝脏细胞生长相关基因在肝再生中作用的有效途径;肝脏干细胞、肝细胞和胆管上皮细胞的生长活动主要在肝再生启动和增殖阶段增强,枯否氏细胞、肝星形细胞和平滑肌细胞生长活动主要在肝再生启动和组织结构功能重建阶段增强,陷窝细胞生长活动主要在肝再生增殖阶段增强,窦内皮细胞生长活动则在整个肝再生中都增强。
王泽荣[7]2011年在《SiRNA下调Smad3基因后对大鼠HSC及大鼠四氯化碳肝纤维化模型的纤维化相关影响》文中指出(1)肝星状细胞的激活是肝纤维化进程的关键步骤,而TGF-β/Smads信号途径对肝星状细胞的激活尤为重要,Smad3是介导TGF-β信号向细胞内传递、活化肝星状细胞的直接承担者,在肝纤维化发展进程中起着关键作用。本文以大鼠Smad3基因为研究对象,第一步构建并筛选出有效沉默大鼠Smad3基因的干扰载体。(2)将有效沉默大鼠Smad3基因的干扰载体转染入大鼠星状细胞(hepatic setellate cells, HSC)HSC-T6中,下调表达Smad3基因,阻断TGF-β/Smads信号途径,通过体外试验观察对大鼠HSC的激活的影响,判断是否有抗纤维化。(3)将有效沉默大鼠Smad3基因的干扰载体通过转染入大鼠四氯化碳肝纤维化模型中,探讨下调表达Smad3基因对大鼠四氯化碳肝纤维化模型中肝纤维化指标的影响,从而探索肝纤维化治疗的新方法。(4)利用本实验室构建的ppGalNAc-T2的siRNA表达载体,观察ppGalNAc-T2下调后对大鼠肝星状细胞TGFβ1-Smad3激活途径相关基因表达的影响,从而初步探讨糖基转移酶ppGalNAc-T2对大鼠肝星状细胞的TGFβ1-Smad3信号激活影响。方法(1)利用互联网资源从基因库中获得Smad3基因序列,用ambion公司的siRNA设计工具,针对Smad3基因mRNA序列设计叁条可能的小干扰RNA(siRNA),将这叁条小干扰RNA插入到RNA干扰载体pRNAT-U6.1/Neo中构建成叁条干扰载体。将构建的3个带有荧光标记的Smad3干扰载体(pRNAT-siSmad3-1、pRNAT-siSmad3-2、pRNAT-siSmad3-3)并分别转染大鼠肝星状细胞株(HSC)中,通过RT-PCR,Western-Blot的方法筛选出最有效的Smad3基因的siRNA表达载体。(2)用脂质体2000转染试剂将最有效的Smad3 siRNA表达载体(pRNAT-siSmad3-2)转染入对数生长期的大鼠HSC(1.0μg plasmid/106 cells)中,48小时后,用trizol提取总RNA,用RT-PCR检测下调Smad3以后对HSC的Smad2,3,4及胶原I,III,IV mRNA表达的影响。(3)80只成年SD大鼠随机分成叁组,对照组(30)模型组(30)治疗组(20),模型组和治疗组每周两次皮下注射40%(v/v)四氯化碳橄榄油(3 ml/kg),共8周。从第四周起用阳性脂质体将siRNA表达载体质粒(150μg/kg)在全麻,经皮下注入模型组大鼠肝右叶中,每两周一次,而模型组注入相同体积的缓冲剂。于第6、8周末,取得肝组织及血清,观察用纤维化半定量评分系统对病理切片的肝纤维化分级,及血清相关指标的影响。(4)在大鼠肝星状细胞中转染ppGalNAc-T2的siRNA表达质粒,用RT-PCR检测TGFβ1- Smad3信号途径相关基因mRNA的表达变化,Western blot以及免疫荧光方法检测Smad3基因蛋白表达变化。结果(1)成功构建到叁个Smad3基因的有效siRNA干扰载体(pRNAT-siSmad3-1、pRNAT-siSmad3-2、pRNAT-siSmad3-3),并筛选出pRNAT-siSmad3-2为相对最佳的载体。(2)转染了pRNAT-siSmad3-2表达载体的肝星状细胞中Smad3和胶原I,III,IV mRNA表达都受到了明显抑制。(3)治疗组较模型组,病理切片用纤维化半定量评分系统观察到肝纤维化分级有明显减轻(P < 0.05),血清肝纤维化指标(III型前胶原,IV型胶原,层粘蛋白,透明质酸)亦有明显改善(P < 0.01)。(4)ppGalNAc-T2下调后肝星状细胞中Smad2,Smad3,Smad4,胶原3α1(collagen type III, alpha 1 ,Col3α1),转化生长因子β调节基因4(transforming growth factor beta regulated gene 4, Tbrg4 ),转化生长因子β1(transforming growthfactor beta, TGFβ1),转化生长因子β2(transforming growthfactor beta2, TGFβ2)及转化生长因子β受体3(transforming growth factor beta receptor3,Tgfβr3)的mRNA及Smad3的蛋白表达几乎没有变化(P﹥0.05),但转化生长因子β受体1(transforming growth factor, beta receptor 1,Tgfβr1)和转化生长因子β受体2(transforming growth factor beta receptor2,Tgfβr2)都有较大程度的降低(P<0.05)结论(1)转染pRNAT-siSmad3-2载体后,下调Smad3的表达,阻断TGF-β/Smad3信号途径,对大鼠HSC及四氯化碳肝纤维化模型有抗纤维化作用。(2)RNAi下调Smad3的表达可以作为肝纤维化基因治疗的实验依据。(3)在大鼠肝星状细胞中,ppGalNAc-T2下调对于TGFβ1-Smad3激活途径基因表达基本没有影响,其在肝星状细胞中的具体功能有待于进一步研究。
徐丽红[8]2006年在《反义TβRI及与反义TIMP-1联合作用对实验性肝纤维化的影响》文中指出背景与目的:肝纤维化是临床各种慢性肝病的共同病理基础和特征,肝脏细胞外基质(ECM)的合成与降解失衡、导致ECM在肝内的过度沉积是肝纤维化发展的主要机制。目前关于肝纤维化的研究已达成共识:肝纤维化是可逆性病变,而肝硬化则不可逆转。因此阻止和延缓肝纤维化的发生、发展是治疗肝硬化的关键环节。研究发现在致肝纤维化的细胞因子中最重要有血小板衍化生长因子(PDGF)和转化生长因子β(transforming growth factorβ,TGF-β),其中TGF-β是最强有力的致纤维化细胞因子。近几年,肝纤维化中TGF-β的一般信号传导通路已基本阐明:首先活化了的TGF-β与II型TGF-β受体(TβRII)结合并使之磷酸化而具有激酶活性;与TGF-β结合的TβRII再结合I型TGF-β受体(TβRI)形成I、II型受体复合物,并使TβRI磷酸化具有激酶活性;最后,激活的TβRI激活酶磷酸化其特殊的受体Smads (R-Smads) ,从而调节肝星形细胞(HSC)的转化和ECM的合成、降解。即TGF-β发挥作用必须借助其在细胞膜上的跨膜受体,TβRI和TβRII。故从理论上,可推测选择性抑制TβRI的表达,应可影响TGF-β信号传导,从而抑制TGF-β的促纤维化作用。在正常肝脏中,基质金属蛋白酶(matrixmetalloprotei-nases,MMPs)与基质金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitor of metallopropteinases,TIMPs)处于动态平衡的状态,维持胶原的产生与降解之间的平衡。当有损伤因子作用于肝脏,使HSC活化,打破了MMPs与TIMPs的平衡,就会导致胶原纤维降解的减少,致使大量的胶原在肝组织中沉积。肝内主要存在的TIMPs有TIMP-1和TIMP-2,其中以TIMP-1表达更为显着;主要存在的MMPs在人类为MMP-1,在啮齿类动物为MMP-13;TIMP-1可与MMP-1/MMP-13特异性结合,抑制其活性。故推测,抑制TIMP-1的表达,可减轻TIMP-1对MMP-1/MMP-13的抑制作用,增加ECM的降解,减少ECM的沉积,延缓肝纤维化的发生、发展。我们应用重组DNA技术构建反义TβRI真核细胞表达质粒和反义TIMP-1真核细胞表达质粒,导入大鼠肝纤维化模型中。一方面,通过选择性抑制TβRI的表达,调节TGF-β信号传导,从而抑制TGF-β的促纤维化作用;另一方面通过抑制TIMP-1的表达,减轻TIMP-1对MMP13的抑制作用,提高MMP13的活性,减少ECM的沉积,最终同时在两个环节上干预肝纤维化的发生、发展。材料和方法:1.反义质粒的构建和鉴定:取-80℃冰冻保存的大鼠肝组织,应用TRIzol法提取总RNA,15 g/L琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性,并用紫外分光核酸蛋白分析仪测定RNA浓度和纯度。使用一步法逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒获得目的基因TβRI cDNA片段,采用巢式PCR扩增TβRI基因片断。用Cacl2法诱导感受态细胞。将纯化回收的pcDNA3.1(+)线性化载体和TβRI基因片段定向及反向连接,构建以pcDNA3.1(+)为载体的反义TβRI基因真核表达质粒。转化JM109大肠杆菌。酶切证实的阳性克隆行测序分析。2.大鼠肝纤维化模型制备及质粒导入:有效进入实验的大鼠90只。实验大鼠随机分为6组:反义TβRI治疗组(A组)、反义TβRI+反义TIMP-1治疗组(B组)、反义TIMP-1治疗组(C组)、pcDNA3.1(+)空质粒对照组(D组)、模型对照组(M组)、正常对照组(N组)。每组15只。采用四氯化碳复合法制
参考文献：
[1]. 核糖体S6激酶在大鼠肝纤维化发生中的作用[D]. 杨妙芳. 第二军医大学. 2004
[2]. 核糖体S6激酶与大鼠肝纤维化相关性研究[J]. 杨妙芳, 张新, 强晖, 孙田美, 谢渭芬. 中华消化杂志. 2005
[3]. 核糖体S6蛋白激酶在大鼠肝纤维化组织中的表达[J]. 杨妙芳, 谢渭芬1, 张新, 强晖, 孙田美. 第二军医大学学报. 2004
[4]. 肝纤维化相关基因的筛选及其功能初步研究[D]. 强晖. 第二军医大学. 2003
[5]. CTGF/整合素/FAK信号通路在肝纤维化中的表达变化以及肝复康的调节作用[D]. 张坤. 大连医科大学. 2013
[6]. 肝脏细胞生长相关基因在大鼠肝再生中表达模式和作用分析[D]. 赵利峰. 中国海洋大学. 2008
[7]. SiRNA下调Smad3基因后对大鼠HSC及大鼠四氯化碳肝纤维化模型的纤维化相关影响[D]. 王泽荣. 苏州大学. 2011
[8]. 反义TβRI及与反义TIMP-1联合作用对实验性肝纤维化的影响[D]. 徐丽红. 石河子大学. 2006