周振明[1]2001年在《兔胚胎干细胞的分离与克隆》文中指出本论文对影响兔胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES细胞）和胚胎生殖细胞（embryonic germ cell，EG细胞）培养、克隆、分离和传代效果的因素进行了研究。 采用昆白小鼠成纤维细胞（MEF）作为饲养层，低糖DMEM+10％NBS+10％FCS+10ng/mlLIF+10ng/mlSCF+0.1mM β-巯基乙醇+100IU/ml青霉素+80IU/ml链霉素作培养基，从72～120h胚胎中分离出兔类ES细胞系，克隆传至四代，其中第一代43个ES细胞集落（39.8％），第二代8个ES细胞集落（7.4％），第叁代3个ES细胞集落（2.7％），第四代1个ES细胞集落（0.9％）。ES细胞在体外悬浮培养，形成类胚体，单层兔类ES细胞在衰老的饲养层上培养，可分化为多种类型细胞，例如心肌和神经细胞。此外，本实验还研究了胚龄、生长因子、饲养层对兔ES细胞分离和克隆的影响。结果表明，72h兔胚胎贴壁率和内细胞团增殖率依次为68.1％和50.0％，96h兔胚胎贴壁率和内细胞团增殖率依次为71.4％和53.6％，120h兔胚胎贴壁率和内细胞团增殖率依次为77.4％和45.2％。生长因子SCF和LIF的联合使用能显着提高胚胎的贴壁率（71.4％∶34.8％）和ICM的增殖率（53.6％∶8.7％），对照组没有得到ES细胞克隆。用MEF作为饲养层，胚胎的贴壁率、内细胞团的增殖率、ES的克隆率都优于用REF作为饲养层。同时，比较了兔胚胎与小鼠胚胎在培养系统中的生长行为，（1）小鼠滋养层细胞推开饲养层直接铺展在培养皿上。兔滋养层推开饲养层力量较小，多数兔胚胎铺展在饲养层之上。（2）小鼠ICM呈团块状生长。兔胚胎的ICM呈多态性，有聚集生长、迁徙生长和单层生长。（3）小鼠ICM培养后4～5d传代，兔ICM培养3～4d传代。 采用14～18d兔胎儿的生殖嵴及周围组织与其同源成纤维细胞共培养，低糖DMEM+10％NBS+10％FCS+10ng/mlLIF+10ng/mlSCF+0.1mMβ-巯基乙醇+100IU/ml青霉素+80IU/ml链霉素作培养基，分离出兔原始生殖细胞（PGC），克隆并多次传代。从PGC中获得EG细胞集落，14d胎儿原代观察到类EG细胞集落，传至四代后丢失。16d胎儿的类EG只传二代，18d胎儿没有得到EG细胞集落。EG细胞具有干细胞的诸多特征，呈典型的团块状聚集生长，AKP染色呈阳性，在衰老饲养层的培养基中生长形成类胚体、上皮细胞、神经细胞和成纤维细胞等。
夏霞[2]2007年在《兔胚胎干细胞的分离和培养》文中提出本研究分别从胚胎处理方法、培养液中成分以及不同饲养层及采用大鼠心肌条件培养基等对兔胚胎干细胞培养时的影响进行比较,发现胚胎分割法和pronase E处理粘蛋白及部分透明带的胚胎容易贴壁和增值,分离出的内细胞团易生长于小鼠成纤维细胞饲养层上,消化后能够生长出ES细胞样的细胞集落。添加白血病抑制因子和胰岛素利于抑制ES细胞的分化和促进ICM的增值。SD大鼠心肌条件培养基在兔胚胎干细胞分离培养过程中效果较好,所分离的兔胚胎干细胞集落具有岛屿状生长特征,碱性磷酸酶染色为强阳性,体外分化可形成类胚体状结构,贴壁的类胚体周边会出现许多分化的上皮样细胞或单个散在的细胞,经过常规冻存后再传代的胚胎干细胞集落具有较为一致的生长特征,并皇现胚胎干细胞集落所特有的岛屿状生长形态。试验结果如下:1.分别采用pronase E对不同胚龄(3.5d、4d、4.5d及5d)的兔胚胎消化掉粘蛋白及部分透明带后进行了培养(MEF饲养层)。结果表明,3.5d、4d、4.5d的胚胎处理后,ICM在24～72h孵出并贴壁,其中,4d的囊胚内细胞团贴壁最早,且细胞增值良好。5d胚胎冲出时已经扩张,24h之内ICM就已孵出,但贴壁和增值情况较差。2.分别在不同饲养层上对兔胚胎进行培养。结果显示,无饲养层中培养的胚胎脱带率较低,在兔原代成纤维细胞和小鼠原代成纤维细胞饲养层上,胚胎的脱带率差别不大。而不同的饲养层上胚胎的贴壁率差别较大,无饲养层中ICM几乎不能贴壁,且贴壁的少量胚胎,ICM增值较慢且容易分化。在兔胎儿原代成纤维细胞饲养层上培养的胚胎,贴壁后增值较慢。而在小鼠原代成纤维细胞饲养层上兔胚胎易扩展,脱带率和贴壁率都较高,而且贴壁后ICM增值较快,生长良好。故此后的实验均采用小鼠胚胎成纤维细胞作饲养层。3.对兔胚胎进行不同方法处理。结果显示,所得不同状态的胚胎,其贴壁率不同。兔囊胚不经处理直接培养,经7-8d才有少数胚胎贴壁,贴壁率极低。去除黏蛋白及部分透明带的胚胎24h后ICM就能部分孵出,72h后完全孵出。经胚胎切割后,ICM可在48h内贴壁,能保持较快的增殖速率,贴壁率提高。ICM集落呈扁平圆形单层集落,细胞之间界限不清。用胰酶消化传代后,ES集落较小,呈微隆起椭圆状集落、颜色较暗。4.本实验中分别在培养液中添加不同浓度的LIF因子(0.01、0.1、1、10ng/ml),结果显示,在饲养层上培养时,ES细胞贴壁、增值和抑制分化方面差异不显着;而在无饲养层培养液中培养时,0.1ng/ml和1ng/ml两种浓度的LIF使ES细胞生长良好。5.添加胰岛素(64%)与对照组(63%)相比,ES细胞贴壁率差异不显着(P＞0.05).6.采用大鼠心肌细胞条件培养液培养兔胚胎可明显提高胚胎的ICM贴壁率,最高可达59%,与对照组(ES培养液,添加10μg/mL牛胰岛素)差异显着(P＜0.05)。传代后24h可出现ES集落,而对照组(ES培养液,添加10μg/mL牛胰岛素)需48h以上,而且使用大鼠心肌细胞条件培养液后ES细胞的连续传代能力与对照组相比增强。7.对兔类胚胎干细胞进行鉴定,结果显示,对第1、3、5代ES集落进行碱性磷酸酶染色,ES集落均呈强阳性。对稳定传代的第5代ES集落随机取样,4个样本的二倍体核型正常率分别是78%、81%、76%和85%,平均值为80%,二倍体核型正常率大于75%,叁个为XY型,1个为XX型。
郭志林[3]2008年在《小鼠、兔和牛胚胎干细胞分离培养及其向神经样细胞的分化》文中进行了进一步梳理胚胎干细胞能在体外维持未分化状态与正常核型、具有无限增殖能力,注入囊胚可形成嵌合体,可分化为来自叁个胚层的各种细胞类型。ES细胞被广泛应用于生产转基因动物和克隆动物,构建医学动物模型,研究人类基因功能。利用ES细胞可研究真核细胞的基因表达和调控,寻求细胞分化和细胞修复的机制,研究细胞、组织、器官移植。ES细胞的研究应用已成为生命科学的热点之一。目前哺乳动物ES细胞建系仍存在着品种单一、建系效率低等许多问题,严重影响了ES细胞的研究与应用。本研究比较了不同种属、胚龄、取材、分离、传代方法及消化液、培养液对ES细胞分离培养的效果,对影响ES细胞分离建系的各种因素进行了研究,以求完善小鼠、兔、牛ES细胞的建系方法,提高建系效率。建立了一种不经类胚体阶段直接诱导小鼠EG细胞定向分化为神经细胞的方法,为小鼠EG细胞向神经细胞的体外分化研究提供参考。1.采用分离5日龄小鼠胚胎外胚层进行昆明小鼠ES细胞分离培养,与传统分离ICM的方法相比显着提高了昆明小鼠ES细胞的建系效率(12%&3.3%);大鼠心肌细胞条件培养液与添加10ng/mL LIF的ES培养液相比,使分离ICM的胚胎传至F1代的比例显着提高(52%&36%),传至F2代的比例极显着提高(40%&16%);采用0.125%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化液连续消化法进行ES细胞分离传代,ICM形成ES细胞克隆的比例提高到50%,ICM获得传至第5代的ES细胞的比例提高至20%;昆明小鼠和BALB/C小鼠胚胎用于ES细胞分离时在胚胎贴壁率、ICM贴壁率、F1和F2代ES细胞出现率上无显着差异;用丝裂霉素C处理MEF 1h适合作为ES细胞培养的饲养层,添加10ng/mL LIF的ES培养液能有效抑制昆明小鼠ES细胞的分化。证实用改进的建系方法可有效地建立昆明小鼠ES细胞系。2.从11.5～12.5日龄昆明小鼠胚胎生殖嵴分离培养PGCs,获得了能连续传9～11代的EG细胞系;用0.125%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化液多次消化生殖嵴,可有效地保持小鼠PGCs的活力;用差速贴壁法、与胎儿成纤维细胞共培养法分离PGCs,获得了较多的PGCs原代克隆,所得的F1代EG细胞集落百分率显着高于穿刺生殖嵴和取胎儿后1/3部位组织(21%、30%&7%、16%);2株EG细胞系传代达到11～13代,在第10代时检测AKP呈阳性,第5代时在体外可分化为多种细胞。3.对兔囊胚进行蛋白酶消化和机械切割分离出ICM,在MEF饲养层培养,提高了ICM的贴壁率(60%),获得了较多的ES细胞集落,而用全胚或离散胚培养不能获得可传代培养的兔类ES细胞集落;应用大鼠心肌细胞条件培养液提高了ICM贴壁率(59%),能有效抑制兔类ES细胞的分化。证实了经胚胎切割分离兔囊胚ICM在MEF饲养层上用大鼠心肌细胞条件培养液培养,能有效地建立兔类ES细胞系。4.从14～18天兔胚胎生殖嵴及其周围组织分离PGCs的过程中,用酶消化液加机械吹打,能获得有增殖能力的兔PGCs;用0.125%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化液进行兔类EG细胞分离与传代,所得到的EG细胞集落多,传代数高于0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA浓度消化液组;采用兔PGCs与同源胎儿组织成纤维细胞共培养适合兔类EG细胞分离培养,将兔类EG细胞克隆与成纤维细胞饲养层一起消化进行传代,获得了能连续传代的兔类EG细胞系。5.对5～13周龄牛胎儿生殖嵴分离PGCs时,用percoll液离心和差速贴壁法纯化PGCs,与穿刺生殖嵴法和酶液消化法相比所得的PGCs集落数无差别,但前者后期培养中EG细胞传代数高于后两种方法(13, 7 & 5, 3);大鼠心肌细胞条件培养液用于牛EG细胞培养时,所得PGCs集落数和EG细胞传代数高于添加LIF的EG细胞培养液组(13&7);牛胎儿成纤维细胞饲养层可支持牛EG细胞的增殖,并能有效抑制分化;冷冻保存不影响牛PGCs和EG细胞的活力;体外分化试验和AKP染色证实了所分离的牛EG细胞具有多能性。证实了对牛PGCs进行纯化后在牛胎儿成纤维细胞饲养层上用大鼠心肌细胞条件培养液进行培养能有效地建立牛EG细胞系。6.用不经过类胚体阶段的诱导分化方法,对小鼠EG细胞在老化饲养层上长期培养使其达到高密度起动了EG细胞的神经分化,获得了较高比例的神经细胞样集落(62.9%(78/124)),用RA进一步进行诱导可产生TH+阳性神经元细胞。经检测EG细胞源神经细胞样集落外层细胞以及从集落中迁出的细长细胞均表达神经前体细胞标志nestin,应用高浓度的RA对神经细胞样克隆诱导,可获得2.3±0.2%的TH+神经元细胞。应用不同浓度的RA对离散后的神经细胞样集落进行诱导,TH+阳性细胞的比例在一定范围内随着RA浓度升高和分化时间的延长而上升;对EG细胞源神经前体细胞进行冷冻保存,解冻后细胞存活率83.2%,继续培养仍具有增殖和分化能力,冷冻不影响EG源神经前体细胞的活力。在不更换饲养层连续增殖达到高密度的情况下培养小鼠EG细胞,建立了一种简单而有效的小鼠EG细胞体外分化为神经细胞的培养体系,能有效产生TH+神经细胞。
徐秋勤[4]2014年在《兔类ES细胞的分离培养及定向分化的研究》文中研究说明本研究采用兔胚胎作为试验对象，从中分离克隆出兔类ES细胞，而且系统地比较了不同的培养条件对兔类ES细胞分离培养的影响，并对其进行了传代培养及鉴定；采用不同浓度的视黄酸（retinoic acid, RA）对分离到的兔类ES细胞向原始生殖细胞（primordial germ cells,PGCs）诱导分化效果进行了初步探讨，为兔胚胎干细胞的建系及向原始生殖细胞的体外分化研究奠定了基础。试验主要结果如下：1.探讨超数排卵对兔胚胎体外发育能力的影响，收集自然发情和超数排卵处理配种后4d的胚胎，接种于MEF饲养层上培养，以自然发情交配所得兔囊胚作为对照。结果如下：超数排卵组的胚胎贴壁率、ICM形成率和F1代形成率高于自然发情组，但没有显着差异（P>0.05），兔超数排卵对兔胚胎的体外发育能力没有显着影响。但在干细胞克隆传代方面差异显着（P<0.05）。因此，为保证试验的效率，尤其在严寒和酷热的环境下，兔子自然交配不易成功，对母兔采取超排方式可获得足够的胚胎，但在春秋季节时获得胚胎以自然发情交配为好，其胚胎更适宜分离胚胎干细胞。2.探讨兔胚胎的不同处理对兔胚胎克隆、传代的影响。将自然发情获得的挑破透明带胚、离散胚和未处理胚分别置MEF饲养层上培养。结果显示：挑破透明带法和胚胎分割法较对照组得到的胚胎更容易贴壁和增殖，有显着差异（P<0.05），虽然离散胚组的胚胎贴壁率（85.7%）显着高于挑破透明带组（70.0%）（P<0.05），但挑破透明带组的ICM形成率（53.3%）高于离散胚组（40.0%）（P<0.05），挑破透明带组F1、F2代兔类ES细胞的克隆率分别为34.7%和25.7%，均显着高于其他两组（P<0.05），最高传至30代。因此，挑破透明带有利于提高从兔胚胎中分离胚胎干细胞的效率，能更好的支持兔类ES细胞的培养与增殖。3.探讨不同培养基对兔胚胎克隆和传代的影响。结果显示：胚胎在含15%FBS的培养液中ICM集落形成率以及1~5代类ES细胞传代过程中均显着高于其他两组含15%KSR和7.5%FBS+7.5%KSR的培养液（P<0.05），培养液为高糖-DMEM+2mmol/L L-谷氨酰胺+0.1mmol/Lβ-巯基乙醇+1%NEAA+15%FBS+100IU/mL双抗时改善了兔类ES细胞的体外培养环境，有利于兔类ES细胞集落的形成，能够进行稳定的传代。4.探讨了机械消化传代、胰酶消化传代和“机械+胰酶”消化传代3种不同的传代方法对兔类ES细胞分离培养传代的影响，结果发现“机械+胰酶”消化传代法最有利于兔类ES细胞传代和集落的形成，细胞克隆形态最佳，为理想的ES细胞分离传代方法。5.将分离克隆得到的兔类ES细胞进行鉴定，结果显示，碱性磷酸酶染色和Oct-4、Nanog免疫荧光鉴定兔类ES细胞集落均呈阳性；提取兔类ES细胞集落的RNA，扩增多能性基因Sox2、Nanog和GAPDH经RT-PCR检测，得到了与预期大小一致的目的片段。体外分化形成具有叁个胚层构成的类胚体（embryoid bodies, EBs）。6.探讨不同浓度的RA对兔类ES细胞向原始生殖细胞诱导分化的能力。采用不同浓度RA（0.2μM、2μM、20μM）诱导液和不加RA的培养液对兔类ES细胞进行诱导，用流式细胞仪进行DNA倍体分析，结果显示：0.2μM浓度RA诱导21d经DNA倍体分析单倍体含量达54.4%，诱导效率最高，2μM浓度RA诱导14d经DNA倍体分析单倍体含量达12.6%，而其他浓度在诱导了相同天数则不含单倍体，说明兔类ES细胞可以用RA向原始生殖细胞诱导，0.2μM浓度的RA诱导效率要比其他浓度高，表明RA的较佳浓度为0.2μM。
张蓉[5]2000年在《兔和牛原生殖细胞用于胚胎干细胞系建立的研究》文中研究指明与经典胚胎干细胞的分离路线不同，原生殖细胞（Primordial Germ Cells，简称PGCs）作为胚胎干细胞分离的新型材料是1992年由Resnick和Matsui分别独立在小鼠上率先采用并取得成功。随后，大鼠（Mitani等，1994）、牛（Cherny等，1994a，b）、猪（S等，1997；Piedrahita等，1998），尤其是人原生殖细胞胚胎干细胞（Gearhart，1998）的建立极大地推动了该领域的研究，但从兔原生殖细胞分离胚胎干细胞尚未见报道。 本研究取兔15-28 dpc和牛74 dpc以及106 dpc的含原生殖细胞的胚胎组织，经机械剪碎和胰蛋白酶+乙二胺四乙酸二钠消化液消化，分离出单个细胞或细胞团，培养于MEF、rEF和bEF的饲养层细胞上，培养基中分别添加20ng/mL LIF、65ng/mL SCF和20ng/mL Forskolin等细胞生长因子。培养24小时后，PGCs细胞开始贴壁，并有一定程度的增殖，兔的PGCs很少显示出典型的囊泡和伪足，且单个PGCs的直径相对较小（平均10.5μm）；牛的PGCs呈圆形，平均直径约为18μm，且类伪足的形成过程并不频发。经过短期培养后，兔和牛的PGCs迅速增殖，培养至3天的PGCs大多已转变为由2-20细胞构成的克隆，其中包括从PGCs群聚或细胞增殖所形成的两种克隆类型。 在有效的抑制分化条件下，兔和牛PGCs集落继续增大并转化为岛状和巢状干细胞集落，明显突出于饲养层表面；集落中细胞的轮廓相对不清，但与周围细胞却存在明显的界限。进一步的比较分析发现，新西兰大白兔19-20 dpc胎儿的PGCs较其它迁移时期胎儿的PGCs更易建成稳定增殖的多能胚胎干细胞/胚胎生殖细胞（Embryonic germ cells，简称EG）系，并传至第5代。传代至第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ代的集落分别是28、3、2和2处。19-20dpc塞北兔和大耳白兔胎儿与同期的新西兰大白兔胎儿相比，由PGCs建成的EG细胞系在相同培养条件下易于分化。 通过比较在MEF、rEF和bEF饲养层上干细胞的生长行为，证明同源胎儿成纤维细胞饲养层优于异源的饲养层。与仅添加Forskolin的培养基相比较，兔和牛PGCs在同时添加叁种生长因子的培养基中培养，其体外存活时间稍有延长。而且，细胞生长因子和饲养层的协同作用能够促进PGCs增殖，促使其向EG细胞的转化，并维持EG集落的未分化状态。将兔的EG细胞在无抑制分化条件下培养，兔的EG细胞最早可在3-4天时形成类胚体，并进而可在5-6天时观察到囊状胚体。长期培养的EG细胞可分化为类似于外、中、甘肃农业大学硕士论文 兔和牛原生殖细胞用于胚胎干细胞系建立的研究 中文摘要一内叁个胚层的多种细胞（主要有上皮样细胞、成纤维样细胞和搏动的自律细胞等）。 本研究首次由兔的PGCS在体外建成了EG细胞系，并进行了广泛的体外分化试验，结果证实所建成的EG细胞系具一定的发育多能性。
李义书[6]2008年在《兔类胚胎干细胞体外培养体系的优化与建立》文中进行了进一步梳理本研究以兔为材料,系统地研究了不同培养条件和传代方法对兔类ES、EG细胞分离培养的影响,为完善兔类ES、EG细胞建系的技术路线提供资料。实验主要结果如下:1试验比较不同饲养层和不同培养液对ES细胞分离培养的影响。选用DMEM+15%FBS+0.1mMβ-巯基乙醇+0.1mM MEM+100IU/ml青霉素+100IU/ml链霉素+1000IU/ml LIF+10mg/mL胰岛素作为体外分离培养家兔ES细胞的培养液,胚胎能较快贴壁、增殖,兔类ES细胞最高能够传至5代而不分化。无饲养层培养与在MEF、REF饲养层中培养的家兔胚胎贴壁率,ICM增殖率之间有极显着差异(P<0.05),几乎不能传代。MEF作为饲养层,胚胎的贴壁率为67.4%,最高传代至第5代;以REF为饲养层胚胎的贴壁率为63.2%,最高传至第4代。2本试验对ICM和类ES细胞集落采用叁种不同的传代方法进行传代,结果发现,连续消化法相对一次消化法ES细胞克隆的比率大为提高,连同饲养层一起消化产生ES克隆的比率太低,ES细胞只传1代,不适合用作ES细胞的早期分离、传代。3 14～18d胎龄的兔胎儿均能分离得到PGCs原代集落,但是15、16d的胎儿分离得到的集落数要比14、17、18d胎儿得到的集落要多,类EG细胞最高传了9代,适合克隆兔类EG细胞。SD大鼠心肌条件培养基能够较好地促进兔PGCs的分离培养,与添加LIF组差异不显着(P>0.05),但明显好于未添加LIF组,可以用于兔PGCs的分离培养。4将取得的兔PGCs分别培养在MEF﹑REF饲养层上或与同源兔胎儿生殖脊成纤维细胞(HEFgr)﹑兔睾丸支持细胞(RSC)共培养。结果表明,采用共培养的模式分离得到的集落明显多于传统的饲养层模式。与RSCs共培养得到的EG细胞集落数最多,保持未分化的时间最长,并传了8代,与HEFgr共培养得到的EG细胞集落数与RSCs相比差异不明显,但最高只传了6代。培养在MEF上的兔类EG细胞也能较好的保持未分化状态,传了4代。培养在REF上的兔类EG集落数目较少,出现分化时间较早,只传了3代。因此可以用与RSCs或HEFgr共培养的方法分离培养兔PGCs。5试验比较了不同传代方法对兔类EG细胞传代的影响,结果发现手工传代和连同饲养层细胞一起消化传代法均获得了较高的P1集落数,两者差异不显着,但手工传代EG集落能够传至第9代,而连同饲养层细胞一起消化只能将EG细胞传至第4代,不适合作为兔类EG细胞传代的方法。6分离得到的兔ES、EG细胞,经形态学观察、AKP染色、体外分化能力检测实验等,证明其具有胚胎干细胞的诸多特性。
余树民[7]2007年在《小鼠胚胎干细胞建系的研究》文中提出小鼠胚胎干细胞(Embryonic stem cells, ESCs)已在发育生物学、人类疾病和药物开发等研究领域中得到广泛应用,小鼠ESCs建系技术的丰富完善为建立人类和动物ESCs系提供了参照标准和理论依据。目前小鼠ESCs建系主要来自129小鼠,少部分来自C57BL/6J和BALB/c小鼠,除129及杂交小鼠ESCs建系比较容易外,其他品系小鼠ESCs建系比较困难,建系效率很低。昆明(KM)小鼠是国内广泛使用的实验动物,但其ESCs分离建系很困难,大多数情况下只能在体外传几代,却不能充分增殖。所以,仍需要继续研究昆明小鼠ESCs。本研究在优化小鼠胎儿成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblast, MEF)饲养层制备条件的基础上,比较不同添加物对昆明小鼠ESCs分离培养的影响;以129♂×KM♀杂交F1代小鼠胚胎为材料,分离培养小鼠ESCs,建立了该杂交小鼠ESCs的分离培养体系,获得了1株传52代的类ESCs,1株传38代的孤雌胚胎来源的类ESCs(pESCs),为更深入研究奠定了基础并准备了材料。本研究获得如下结果:1.MEF饲养层制备条件的优化利用MTT法检测丝裂霉素C(10ug/mL)处理后MEF活力变化情况,比较不同条件下MEF活力稳定维持的时间。结果显示,以5代以内MEF制备饲养层,用丝裂霉素C(10ug/mL)处理2~3h,以1.2~1.6×104/孔的细胞量接种96孔板,用体积分数10%犊牛血清(Neonatal bovine serum, NBS)的培养液培养,MEF活力可稳定维持10~12 d,是制备MEF饲养层的适宜条件。2.昆明小鼠ESCs分离培养影响因素的研究以昆明小鼠胚胎为材料,以丝裂霉素C(10ug/mL)处理的MEF为饲养层,共培养493枚胚胎,获得287个ICM集落(58.2%),将2株ESCs传到7代(0.697%),细胞表现碱性磷酸酶活性,表达Oct-4和Nanog蛋白。①ESCs培养液中添加KSR,胚胎平均贴壁时间为4.58±1.05 d,比添加FBS的平均贴壁时间(3.74±1.10 d)显着延长(P<0.05),胚胎贴壁率显着低于添加FBS(P<0.05),ICM集落形成率二者没有显着差异(P>0.05);1~5代ESCs传代结果显示,KSR比FBS显着有利于维持昆明小鼠ESCs的未分化状态。②在ESCs培养液中添加FBS+ PD98059(50μmol/L),胚胎平均贴壁时间为5.56±1.15 d,胚胎贴壁率、ICM集落形成率显着低于添加KSR或FBS(P<0.05),不能有效维持昆明小鼠ESCs的未分化状态。③昆明小鼠胚胎ICM和ESCs适宜用0.05%胰酶-0.02%EDTA离散消化,并配合机械分割。3.杂交小鼠ESCs的分离与鉴定①以129♂×KM♀杂交F1代小鼠胚胎为材料,以丝裂霉素C(10ug/mL)处理的MEF为饲养层,培养杂交小鼠胚胎135枚,形成ICM集落72个(53.3%),获得7株传9代以上的细胞,其中3株分别传了52代(编号为060728084)、40代(编号为070109137)和11代(070109153),这3株细胞有细胞冻存。对其中编号为060728084的细胞株进行鉴定。结果显示,该细胞株在33代以内75%以上细胞保持核型完整,核型为XY;具有小鼠ESCs特征性的酶活性(AKP和端粒酶)、标志抗原(SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、Oct-4和Nanog)和基因(Oct-4、Nanog和GDF-3)的表达模式,体内外能分化为叁胚层来源的各种类型细胞(免疫组化检测7种标志抗原,RT-PCR检测5个标志基因),除未进行嵌合体鼠实验外,其余均符合小鼠ESCs建系的各项要求。②添加3.75%FBS+ 11.25%KSR、7.5%FBS+ 7.5%KSR和15%FBS的3组培养液,其胚胎贴壁率显着高于添加15%KSR的培养液(P<0.05);添加3.75%FBS+ 11.25%KSR和7.5%FBS+ 7.5%KSR的培养液,更有利于ICM集落形成。③1~5代ESCs传代结果显示,添加15%KSR、1%FBS+ 14%KSR和3.75%FBS+11.25%KSR均能支持ESCs未分化生长;单细胞接种实验显示,添加1%FBS+14%KSR、3.75%FBS+11.25%KSR和7.5%FBS+ 7.5%KSR,其克隆形成率显着高于添加15%KSR和15%FBS。4.杂交小鼠孤雌胚胎来源ESCs的分离与鉴定①以129♂×KM♀杂交F1代小鼠MⅡ期卵母细胞为材料,经过孤雌激活、体外培养获得35枚孤雌囊胚,在MEF饲养层上培养30枚胚胎,形成11个ICM集落(36.7%),离散后接种其中8个,最终获得1株能稳定传代的pESCs,命名为P061221132,目前传到38代,有细胞冻存。对细胞株P061221132进行鉴定。结果显示,该细胞株在23代内70%以上细胞保持核型完整,核型为XX,具有小鼠ESCs特征性的酶活性(AKP和端粒酶)、标志抗原(SSEA-1、SSEA-3、Oct-4和Nanog)和基因(Oct-4、Nanog和GDF-3)的表达模式,体内外能分化为叁胚层来源的各种类型细胞(免疫组化检测5种标志抗原,RT-PCR检测5个标志基因),除未进行嵌合体鼠实验外,其余均符合小鼠ESCs建系的各项要求。②单细胞接种实验显示,在ESCs培养液中分别添加1%FBS+14%KSR、3.75%FBS+11.25%KSR和7.5%KSR+7.5%FBS,克隆形成率为41.7%~45.4%之间,不同代次细胞在不同培养液中的克隆形成率之间没有显着差异(P>0.05),但添加7.5%KSR+ 7.5%FBS,ESCs集落形态不如添加1%FBS+14%KSR、3.75%FBS+ 11.25%KSR典型。
杨丽芬, 王清华, 韩芬霞, 项智锋, 张晓建[8]2006年在《哺乳动物胚胎干细胞分离与培养的研究进展》文中指出从胚胎干细胞的来源、分离方法和饲养层细胞等方面,总结了胚胎干细胞分离与培养在近年来所取得的进展。
孙国杰[9]2002年在《山羊类胚胎干细胞的分离、克隆》文中指出本论文对影响山羊类胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)和胚胎生殖细胞(embryonic germ cell,EG细胞)培养、分离、克隆、传代效果的影响因素进行了研究， 方法一：采用昆白小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)或山羊胚胎成纤维细胞(GEF)作为饲养层，高糖DMEM+10％NBS+20ng/mlLIF+10ng/mlSCF+0.1mMβ-巯基乙醇+100IU/ml青霉素+100IU/ml链霉素作为培养基，从5-6d胚胎中分离出山羊类ES细胞，克隆传至四代，其中第一代获得类ES细胞集落30个(33.3％)，第二代获得类ES细胞集落8个(8.9％)，第叁代获得类ES细胞集落3个(3.3％)，第四代获得类ES细胞集落2个(2.2％)。本实验研究了胚龄、生长因子、饲养层对山羊ES细胞分离和克隆的影响。结果表明：第6d的胚胎贴壁率最高(77.4％)；5.5d的胚胎获得11个类ES集落，有两个传至第4代；5d的胚胎贴壁率，获得类ES集落数均较低。LIF和SCF联合使用与对照组相比可提高类ES细胞的增殖率(52.9％:7.7％)，并且有两个类ES集落传至第4代。添加LIF和胰岛素对胚胎的贴壁和细胞的增殖有积极影响，单独添加LIF，没有形成类ES细胞集落，添加胰岛素有类ES集落形成，并传代一次。用小鼠胎儿成纤维细胞或山羊胎儿成纤维细胞作为饲养层，对胚胎的贴壁率、内细胞团的增值效果、ES的克隆效果，二种饲养层的差异不明显。ES细胞在体外悬浮培养，形成类胚体，山羊类ES细胞在无饲养层铺有明胶的皿底上培养，可分化为多种类型细胞，如上皮细胞、成纤维细胞、神经细胞等。同时还比较了山羊胚胎与小鼠胚胎在培养系统中的生长行为。 方法二：采用45-70d山羊胎儿的生殖腺与其同源成纤维细胞共培养，高糖DMEM+7.5％NBS+7.5％FCS+20ng/mlLIF+10ng/mlSCF+0.1mMB-巯基乙醇+100IU/ml青霉素+100IU/ml链霉素作培养基，分离出山羊原始生殖细胞(PGCs)，克隆并多次传代。45d胎儿原代观察到36个类PGCs细胞集落，传至4代后丢失。55d的胎儿获得11个PGCs集落，可传代2次，从70d胚胎的生殖腺没有分离到PGCs细胞集落。采用混合培养法，单独添加LIF和对照组相比没有积极影响，LIF和SCF联合使用有2个PGCs集落传至第4代。采用饲养层培养法，在培养基中添加LIF和SCF，分离到了原生生殖细胞，并有2个PGCs集落传至第3代。PGCs细胞具有干细胞的诸多特征，聚集生长，呈典型的鸟巢状、岛状，AKP染色呈阳性，在体外分化培养中生长形成多种类型的细胞。
魏如雪[10]2016年在《兔类胚胎干细胞及诱导性多潜能干细胞的研究》文中提出多能性干细胞对畜牧业发展和医学研究具有重要意义。兔作为传统的试验动物,被广泛地应用于转基因动物和人类疾病研究。兔的多能性干细胞—胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESC)和诱导性多潜能干细胞(Induced pluripotent stem cell,iPSC)研究仍处于初级阶段,分离培养及鉴定方法还需要进一步探索。为完善兔多能性干细胞的研究方法,本试验分离培养了日本大耳白兔的类ESC,进行了多能性鉴定,同时初步探索了将兔胎儿成纤维细胞(Rabbit embryo fibroblast,REF)诱导为iPSC的方法。研究结果如下:1、分离得到了兔类ESC:使用FSH和h CG结合的方法对60只母兔进行超排,交配96 h后冲取胚胎,平均每只母兔可得38枚胚胎,囊胚率为79.96%。选用76%Knockout DMEM+20%KSR+1%谷氨酰胺+1%NEAA+1%β-巯基乙醇+1%青链霉素+10 ng/m L bFGF+1000 IU/m L hLIF作为兔类ESC基础培养液,并在基础培养液中添加不同浓度的褪黑素(10-6,10-7,10-8,10-9,0 M),探索褪黑素对兔囊胚、内细胞团(Inner cell mass,ICM)、ESC生长增殖的影响。试验结果表明,添加褪黑素对兔囊胚的贴壁率没有显着影响,5组囊胚贴壁率均在50%左右,但对ICM和类ESC的增殖、传代有促进作用,其中褪黑素浓度为10-7 M时作用最为显着。10-7 M的褪黑素可以显着提高ICM的增殖率(P<0.05),由19.97%提升到34.57%。对ICM进行机械传代,可以得到形态扁平,有清晰边缘的兔类ESC克隆。添加10-7 M褪黑素可以将兔类ESC的传代数由4代提高到6代,并且能够显着提高第4和第6代的传代率(P<0.05)。2、对P5代兔类ESC进行鉴定,试验结果表明,兔类ESC具有多能性:兔类ESC克隆碱性磷酸酶染色为阳性;RT-PCR可以检测到多能性基因Oct4,Sox2,Klf4,c-Myc,Nanog,Line28a的表达;qPCR检测结果表明,多能性基因Oct4,Sox2,Nanog的表达量明显高于兔胎儿成纤维细胞;免疫荧光染色结果表明,多能性标志蛋白OCT4,SOX2,NANOG为阳性,胚胎干细胞表面标记蛋白SSEA-1,SSEA-4和TRA-1-60,TRA-1-81为阳性,其中SSEA-4和TRA-1-60微弱表达;核型正常为2n=44;去除饲养层和多能性维持因子后,兔类ESC可自然分化为脂肪样细胞、神经样细胞、成纤维样细胞和跳动的心肌细胞;悬滴培养8 d后可以形成拟胚体,分化14和21 d后,qPCR和免疫荧光检测结果表明,组织特异性基因Bmp4,Afp,Desmin,Sox17,Pax6和组织特异性蛋白VIMENTIN,β-TUBULIN,AFP,ALB,DESMIN的表达量随分化时间延长而升高,说明兔类ESC可以向神经、成纤维、肝脏、肌肉等细胞分化。将第3代兔类ESC注射到NOD-SCID小鼠腹股沟皮下,8周后可以形成具有神经、肌肉、腺体等叁胚层组织的畸胎瘤。3、探索了将兔胎儿成纤维细胞诱导为iPSC的方法:使用含有人源转录因子Oct4,Sox2,Klf4,c-Myc的逆转录病毒载体感染原代兔胎儿成纤维细胞。感染后12-18天获得了3种类型的细胞克隆,形成率分别为0.01%,0.03%和0.06%。其中第2种克隆可以稳定传代。机械法传至第10代后外源基因不沉默,第10代克隆AP染色为阴性,表明没有获得兔iPS细胞系。
参考文献：
[1]. 兔胚胎干细胞的分离与克隆[D]. 周振明. 河北农业大学. 2001
[2]. 兔胚胎干细胞的分离和培养[D]. 夏霞. 河南农业大学. 2007
[3]. 小鼠、兔和牛胚胎干细胞分离培养及其向神经样细胞的分化[D]. 郭志林. 西北农林科技大学. 2008
[4]. 兔类ES细胞的分离培养及定向分化的研究[D]. 徐秋勤. 河南农业大学. 2014
[5]. 兔和牛原生殖细胞用于胚胎干细胞系建立的研究[D]. 张蓉. 甘肃农业大学. 2000
[6]. 兔类胚胎干细胞体外培养体系的优化与建立[D]. 李义书. 西北农林科技大学. 2008
[7]. 小鼠胚胎干细胞建系的研究[D]. 余树民. 西北农林科技大学. 2007
[8]. 哺乳动物胚胎干细胞分离与培养的研究进展[J]. 杨丽芬, 王清华, 韩芬霞, 项智锋, 张晓建. 安徽农业科学. 2006
[9]. 山羊类胚胎干细胞的分离、克隆[D]. 孙国杰. 河北农业大学. 2002
[10]. 兔类胚胎干细胞及诱导性多潜能干细胞的研究[D]. 魏如雪. 中国农业科学院. 2016
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