李旭[1]2004年在《肝内肾素-血管紧张素-醛固酮系统在肝纤维化形成中的信号转导机制研究》文中指出局部组织肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)广泛地存在于各组织器官之中，对组织器官纤维化的形成具有促进作用。其效应分子血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)和醛固酮(Aldo)是重要的致炎因子，可促进细胞增殖和细胞外基质(ECM)的合成。近年研究发现：肝内RAAS与肝纤维化的形成关系密切，AngⅡ可激活肝星状细胞(HSC)并促进ECM的合成。肝内RAAS成为肝纤维化研究的新靶点。 核转录因子KB(NF-κB)、激活蛋白1(AP-1)和EGR-1是与炎症和组织纤维化密切相关的核转录因子。它们可被各种致炎因子激活，调控与炎症和纤维化有关的基因如肿瘤坏死因子α(TNFα)、环氧合酶-2(COX-2)、α1-Ⅰ型前胶原和血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)等的转录。 目前，AngⅡ和Aldo诱导HSC激活、增殖、转化和ECM合成的信号转导机制仍未明确，有关RAAS的效应分子对HSC核转录因子通路影响的研究报告较为鲜见。 本研究试图在原有的工作基础上，运用分子生物学和细胞生物学的方法，从体内和体外研究两个方面进行系统研究，目的在于探讨AngⅡ和Aldo对HSC中NF-κB、AP-1和EGR-1等叁个重要的核转录因子信号转导通路的影响，进一步阐明AngⅡ和Aldo促进HSC激活、转化、ECM合成以及促纤维化因子分泌的机制。同时观察AngⅡ是否也可作用于枯否细胞(KC)从而促进肝纤维化的进程。 一、动物实验研究:以四氯化碳皮下注射诱导大鼠肝纤维化，同时分别以血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)一培垛普利和血管紧张素n一1型受体(Ar一1受体)阻滞剂一氯沙坦干预4周和6周。组织学观察培噪普利和氯沙坦对实验性肝纤维化的抑制作用;放免检测血清中透明质酸 (HA)、层粘蛋白(LN)的含量;酶图法检测肝组织中金属蛋白酶一2，9(MMP一2，9)的活性;Westem blot检测组织中AT一1受体、PDGF一BB和转化生长因子即(TGF一pl)的表达;电泳迁移率变更分析(EMSA)检测组织中NF一沼的活性;TLJNEL法及免疫组化双标检测HSC和肝细胞原位凋亡。结果显示:研究发现:培噪普利和氯沙坦对实验性肝纤维化具有抑制作用;培噪普利和氯沙坦可抑制肝组织NF一忍活性以及致纤维化因子ToF一pl和pDGF一BB的蛋白表达和MMp一2、MMp一9的活性。培噪普利和氯沙坦不能诱导HSC和肝细胞的凋亡。 二、细胞水平研究:采用HSC一T6细胞株，分别予细胞外调节蛋白激酶1/2(ERKI/2)特异性抑制剂UO 126、户工1受体阻滞剂irbesartan和抗氧化剂N一乙酸半胧氨酸(NAC)预先处理细胞1小时后，再予Angll或Aldo刺激。 1.Angll和Aldo可通过ERK通路作用于Hse。westem blot结果显示:Angll和Aldo可诱导磷酸化P42/44的表达，并呈时间依赖性，1 0 min达到峰值，之后逐渐减低。U0126可抑制磷酸化P42/44的表达。Ithesartan可抑制Angll诱导的磷酸化P42/44的表达。 2.Angn和Aldo对HsC中NF一出通路的影响。结果显示:Angn和Aldo可增强NF一虑的DNA结合活性并促使NF一沼核转位，该活性可被irbesa到习n和ACEI抑制;Uo126则不能抑制其活性;NAC可显着抑制Angn诱导的NF一出的活化，部分抑制Aldo诱导的NF一沼激活。此外，Angn和Aldo可抑制细胞浆内I沼a的蛋白质水平。Angll和Aldo 一2-可上调TN FamRNA和COX一2蛋白的表达。 3.Angn和Aldo对HSC中AP一1通路的影响。结果显示:Angll和Aldo可增强HSC的AP一1的DNA结合活性。ithesartan和ACEI可显着抑制AP一1的活性;uo 126和NAc可以显着抑制Angn诱导的AP一1的活化，部分抑制Aldo诱导的AP一1的活化。Angll和Aldo可诱导al一I型前胶原mRNA的表达。 4.Angll和Aldo对Hsc中 EGR一1通路的影响。结果显示:Angn和Aldo可显着诱导HSC的EGR一1 DNA结合活性。irbesartan可抑制EGR一1的DNA结合活性且呈浓度依赖性。uo126可以显着抑制Angll和Aldo诱导的EGR一1的活化。ACEI对EGR一1的活性的影响尚不确定，AcEI的浓度为1林M和10nM时，EGR一1的活性被显着抑制，当浓度减至o.IllM时，EGR一1活性反而显着增加。Angn和Akl。可增加HscPDGF一BB的蛋白质水平。 5.原代培养Kc，免疫组化显示AT~1受体可在Kc中表达，Angll可促使NF一沼核转位，并诱导PDGF一BB和TGF一盯的表达。 通过以上研究可以得出以下结论: 1.培噪普利和氯沙坦对实验性肝纤维化具有抑制作用;培噪普利和氯沙坦可抑制肝组织NF一出活性以及致纤维化因子TGF一pl和PDGF一BB的蛋白表达和MMP一2、MMP一9的活性。培噪普利和氯沙坦不能诱导 HSC和肝细胞的凋亡。AngAngll和11和AldoAldo可经ERK通路诱导HSC AP一1和EGR一1活性增强;而与对HSC的NF一虑活性的诱导作用不依赖ERK通路，I沼的磷酸化和降解有关。3.Angll和Aldo可促进NF表达;Angll和Aldo可促进AP-一沼调控转录基因调控转录基因al-TNFa和COX一2的Ang 11和Aldo可促进EoR一l调控转录基因PDGF一BB 一3-型前胶原的表达;的蛋白质表达。4.肝枯否细胞可表达AT.1受体;Angll可激活枯否细胞NF一虑并促使其核内转移。Angn可促进枯否细胞PDGF一BB和TGF一pl的蛋白质表达。
张小兰[2]2008年在《血管紧张素Ⅱ和醛固酮对大鼠肝星状细胞收缩及RhoA-Rock通路的影响》文中认为研究背景众所周知,各种慢性肝病可由肝纤维化发展为肝硬化,门静脉高压是肝硬化的严重并发症。肝硬化状态下,肝内血管阻力的增加是导致门静脉高压的重要因素。肝呈状细胞(hepatic stellate cells,HSC)是肝纤维化细胞外基质的主要细胞,HSC活化在肝纤维化的发生发展以及门脉高压形成一系列过程中起关键作用。活化的HSC转化为肌成纤维细胞和成纤维细胞,不断增殖,并获得收缩性。当HSC发生强烈收缩,致使肝窦直径缩小,肝内血管阻力增大;同时可引起肝组织瘢痕挛缩,进一步增加肝内血管阻力,导致门静脉高压。可见,HSC收缩的调控机制是门静脉高压机理研究的重要一环。近年来,肝内肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)已成为肝纤维化研究领域的热点,血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)是RAAS的重要效应分子,可诱导HSC的活化和增殖而促进肝纤维化的形成,肝内ACE-AngⅡ-AT1R轴与门静脉高压的形成有密切的关系。研究还表明合成醛固酮(AIdosterone,AIdo)也具有和AngⅡ似的作用。然而目前有关AngⅡ和AIdo诱导HSC收缩的机制的研究较为鲜见,其作用机制尚不明确。HSC活化后转化为肌成纤维细胞样细胞,具有平滑肌细胞的特征,提示HSC收缩和平滑肌细胞收缩的分子机制是类似的,可通过钙离子依赖性和非钙离子依赖性两种通路完成收缩。在非钙途径中,RhoA-Rock通路对HSC收缩的调控机制是近年研究的热点。本研究通过观察AngⅡ和AIdo对HSC收缩及RhoA-Rock信号通路上各元件表达的影响来阐明其对HSC收缩机制的影响。目的探讨血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)和醛固酮(Aldosterone,Aldo)对大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)收缩以及由Rho激酶介导的非Ca~(2+)依赖性信号转导通路的影响。方法采用HSC-T6细胞株,给予AngⅡ和Aldo 1μmol/L处理,聚硅酮膜法直观检测HSC的收缩性;激光共聚焦显微镜下动态观察HSC胞内游离钙离子浓度变化;另予AngⅡ和Aldo 10μmol/L处理,免疫印迹法检测肌球蛋白轻链(myosin lightchain.MLC)和磷酸化MLC表达水平。观察AngⅡ1型受体(AT-1受体)阻断剂伊贝沙坦(irbesartan)、Aldo受体阻断剂安体舒通(antisterone)、PKC(Protein kinaseC)特异性抑制剂Stauro、Rho激酶特异性抑制剂Y27632、MLCK(myosin lightchain kinase,MLCK)特异性抑制剂ML-7对磷酸化MLC表达水平的影响;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Rho-Rock通路中Rock_2(Rho kinase_2)、RhoAGTP、RhoGEF(Rho Guanine Nucleotide Exchange Factors,RhoGEF)及PKCmRNA的表达。结果AngⅡ和Aldo均可诱导HSC的收缩;AngⅡ可促进HSC胞内游离钙离子浓度增加,而Aldo对HSC胞内游离钙离子浓度变化无显着性影响。AngⅡ和Aldo均可诱导磷酸化MLC蛋白水平的变化,并呈时间依赖性,均在刺激15min达到峰值后逐渐减低。AngⅡ+Irbesartan和AngⅡ+Y27632处理组可抑制AngⅡ诱导的MLC蛋白磷酸化水。而AngⅡ+ML-7+Stauro联合处理组磷酸化MLC蛋白水平显着高于AngⅡ+Y27632处理组(P=0.003)。AngⅡ+Y27632+ML-7+Stauro四者联合作用可使磷酸化MLC蛋白水平显着降低,差异有统计学意义(P=0.000)。Aldo处理组磷酸化MLC蛋白的表达水平显着高于对照组(P=0.001);安体舒通和Y27632可抑制Aldo诱导的MLC蛋白磷酸化水平;Aldo+ML-7+Staur联合处理组磷酸化MLC蛋白水平显着低于Aldo+Y27632处理组(P=0.022)。Aldo+Y27632+ML-7+Stauro叁者联合作用可使磷酸化MLC蛋白水平显着降低,与Aldo处理组相比差异有统计学意义(P=0.001)。AngⅡ处理组Rock2、RhoAGTP、RhoGEF mRNA的表达显着增强,AngⅡ+Irbesartan处理组叁种元件的表达显着减弱。AngⅡ+Y27632处理组Rock2与RhoGEF mRNA的表达减弱,RhoAGTP的表达增强。ML-7和Stauro联合抑制组以及Y27632、ML-7和Stauro叁种阻断剂联合抑制组,叁种元件的表达均增强。Aldo组Rock_2、RhoAGTP、RhoGEF和PKC mRNA的表达显着增强,而其阻断剂安体舒通可明显抑制这四种元件mRNA的表达。Aldo+Y27632组上述四种元件mRNA的表达较Aldo组减弱。Aldo+ML-7+Stauro联合组断后四种元件的mRNA表达较对照组增强,Y27632、ML-7和Stauro叁者同时抑制组,RhoGEF的表达较ML-7+Stauro联合抑制组增强,PKC mRNA的表达减弱。结论AngⅡ和Aldo均可诱导HSC的收缩;AngⅡ可促进HSC胞内游离钙离子浓度增加,Aldo对HSC胞内游离钙离子浓度变化无显着性影响。AngⅡ主要通过RhoA-Rock信号通路诱导HSC的收缩;Aldo可通过RhoA-Rock信号通路诱导HSC的收缩。
张东慧, 徐晨阳, 李亚芯, 张源淑[3]2012年在《血管紧张素转移系统(RAS)在肝脏纤维化形成中的作用机制》文中认为肝纤维化是多种致病因子导致细胞外基质(ECM)过度沉积的过程。肾素血管紧张素系统(RAS)是机体重要的体液调节系统,在调节血压和水、盐代谢中发挥重要作用。近年来发现RAS与肝纤维化的发生也有着密切联系。特别是RAS中新的关键因子ACE2的发现丰富了RAS的作用,证明其主要通过水解AngII生成Ang(1-7))对抗ACE-AngII-AT1/AT2通路从而抗纤维化。本文结合近年的研究结果,就RAS中各关键因子在肝脏纤维化生成中的作用及其机制作一简要综述。
于继红[4]2008年在《血管紧张素Ⅱ促进酒精性肝纤维化的机制研究》文中指出目的随着生活水平的提高和乙肝疫苗预防的逐步普及,酒精性肝病已成为威胁我国人民生命健康的主要疾病之一。酒精性肝病包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、洒精性肝纤维化和酒精性肝硬化。其中肝纤维化阶段是可逆的,因此肝纤维化的发生机制以及如何逆转肝纤维化一直是国内外研究的热点。肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)是一类血管调节因子,通过内分泌作用调节血管收缩和水钠潴留来维持机体血流动力学的稳定。近年来发现RAAS中的血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)还有上调细胞因子、促进细胞增生和调节细胞外基质代谢等非血流动力学作用,能够促进心脏和肾脏纤维化的形成,其在肝纤维化发生中的作用也日益受到关注。有学者发现在肝脏局部存在非血液源性的AngⅡ,而且在肝硬化患者中,血浆AngⅡ和血管紧张素转换酶(ACE)均明显升高,提示RAAS在肝纤维化的发生中可能发挥重要作用。肝星状细胞(HSC)是肝纤维化发生的关键环节。目前研究表明HSC能够分泌AngⅡ,并表达介导AngⅡ作用的主要受体AT1R,提示AngⅡ促进肝纤维化的作用可能是通过促进HSC活化和增殖来实现的,但具体的作用方式和作用途径还不十分清楚,可能与TGF-β1和MAPK有关。为了验证AngⅡ在酒精性肝纤维化发生中的作用及其作用环节,我们应用乙醇灌胃法制备了酒精性肝纤维化动物模型,观察了酒精性肝纤维化过程中血浆AngⅡ的动态变化和ACEI类药物Captopril对酒精性肝纤维化形成的影响;并在此基础上应用原代HSC细胞培养观察了AngⅡ对HSC增殖、胶原分泌和TGF-β1、p38 MAPK表达的影响,以明确AngⅡ在酒精性肝纤维化发生中的作用及其作用机制,为临床治疗提供新的靶点。材料和方法1、酒精性肝病动物模型制备雄性Wistar大鼠随机分为3组,分别给予乙醇及Captopril灌胃。2、肝脏组织病理学检查肝脏标本置于福尔马林中固定,石蜡包埋,HE及VG染色,观察肝脏病理形态学改变。3、血清透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)检测应用放射免疫分析法严格按照说明书进行操作。4、血浆、肝组织内血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)水平检测应用放射免疫分析法严格按照说明书进行操作。5、Ⅰ、Ⅳ型胶原免疫组织化学染色采用SABC法。结果应用病理图像分析仪对染色强度和染色面积进行分析,分析时每张切片选取阳性染色最明显的10个视野。6、肝星状细胞分离、培养参照宋少刚等报道的方法分离肝星状细胞。7、HSC鉴定(1)细胞存活的鉴定:吸取901μl细胞悬液,加入0.4%台盼蓝溶液10μl,混匀后光镜下未着色者为活细胞。(2)性质鉴定:SP免疫细胞化学染色,胞浆Desmin阳性者为HSC。8、细胞增殖率测定采用MTT比色法。9、HSCα-SMA免疫细胞化学染色采用SP免疫细胞化学染色方法。10、α1(Ⅰ)、α1(Ⅳ)型胶原实时定量PCR(real time quantitativePCR)采用SYBR GreenⅠ荧光染料嵌合法。11、上清液TGF-β1测定采用双抗体夹心ELISA方法进行检测。12、p38 MAPK测定采用Western blot方法。13、p38 MAPK抑制剂SB203580对HSC增殖、TGF-β1、α1(Ⅰ)、α1(Ⅳ)型胶原表达的影响采用Western blot方法。结果1、一般情况观察酒精组大鼠毛色晦暗,竖毛,反应迟钝,食欲不佳,体重下降;而ACEI组大鼠活跃,毛色光滑,体重持续增长。整个实验过程中酒精组大鼠死亡率最高。2、肝脏病理组织学染色结果HE及VG染色结果显示:对照组肝小叶结构完整,无变性、坏死和炎细胞浸润,无纤维组织增生。酒精组4w末即出现局限性肝小叶中央静脉区小泡状脂肪变,肝细胞点片状坏死,炎性细胞浸润;12w末,形成弥漫性混合性脂肪变,并可见中央静脉及汇管区周围纤维组织增生,窦周亦有明显的纤维组织增生。而ACEI组8w末才出现局限性轻度脂肪变性,肝细胞坏死及炎性细胞浸润均不明显:12w末脂肪变略有增加,无纤维条索形成。3、血清透明质酸、层粘连蛋白检测结果实验8w末时酒精组血清LN浓度开始升高,实验12w末时酒精组血清LN浓度进一步升高,明显高于对照组和ACEI组。ACEI组血清LN浓度与对照组无统计学差异。血清HA浓度在实验12w末时酒精组血清HA浓度开始升高,明显高于与对照组和ACEI组(P＜0.0005)。4、血浆、肝组织内血管紧张素Ⅱ水平检测结果实验8w末ACEI组血浆AngⅡ水平开始升高(t=6.54,P＜0.0005)。随实验时间延长并进一步的升高,但仍维持于较高水平。实验4w末酒精组肝组织内AngⅡ水平即开始高于对照组(t=7.51,P＜0.0005)。并随实验时间延长继续升高。5、Ⅰ、Ⅳ型胶原免疫组织化学染色结果对照组大鼠中Ⅰ型胶原主要分布于汇管区的结缔组织、血管壁及胆管壁,在肝实质内沿肝窦壁形成的丝状着色。酒精组中Ⅰ型胶原主要分布于中央静脉、汇管区周围及增生的纤维组织处,形成宽而粗大的纤维条索;酒精组Ⅰ型胶原阳性面积百分比显着升高(P＜0.0005)。ACEI组Ⅰ型胶原的分布部位与对照组基本一致,阳性面积百分比与对照组比较没有统计学差异(P=0.054),较酒精组明显减少(P＜0.0005)。Ⅳ型胶原在对照组主要位于中央静脉、汇管区的血管壁。酒精组可见大量的Ⅳ型胶原沉积于增生的纤维间隔内,并且在肝窦间隙亦可见沿肝窦壁连续分布的强阳性线性染色。ACEI组Ⅳ型胶原的分布部位与对照组基本一致。病理图像分析结果显示酒精组Ⅳ型胶原阳性面积百分比与对照组及ACEI组比较均显着升高(P＜0.0005),ACEI组与对照组比较无统计学差异(P=0.055)。6、AngⅡ促进HSC表达α-SMA无AngⅡ刺激时,仅见少数培养的HSC细胞胞质内α-SMA弱阳性染色,加入10~(-8)moL/L AngⅡ刺激24h后,阳性细胞百分比明显上升,加大AngⅡ浓度后阳性细胞百分比随之上升(P＜0.0005),并于10~(-6)moL/L AngⅡ时阳性细胞百分比达到最高。7、AngⅡ促进HSC增殖与正常对照组比较,10~(-8)moL/L AngⅡ即可促进HSC增殖,差异有统计学意义(P=0.015);升高AngⅡ浓度使HSC增殖活性更加明显;浓度达10~(-6)moL/L时促HSC增殖作用达到高峰(P＜0.0005)。说明AngⅡ能够促进HSC增殖,并具有浓度依赖性。8、AngⅡ促进α1(Ⅰ)、α1(Ⅳ)Col mRNA的表达利用标准曲线对样品中的α1(Ⅰ)、α1(Ⅳ)Col基因和GAPDH基因进行定量,结果发现不同浓度AngⅡ作用24h后,α1(Ⅰ)Col mRNA分别为与正常对照组比较均有明显的统计学差异(P＜0.0005)。α1(Ⅳ)Col mRNA表达结果与α1(Ⅰ)Col基因类似。这些结果提示AngⅡ上调HSCα1(1)、α1(Ⅳ)Col mRNA表达。9、AngⅡ促进HSC分泌TGF-β1正常情况下,HSC细胞能够分泌较低浓度的TGF-β1,加入10~(-8)、10~(-7)、10~(-6)moL/LAngⅡ刺激后,TGF-β1浓度明显升高与对照组相比差异具有统计学意义(P＜0.0005)。10、AngⅡ促进HSC表达p38 MAPKWestern blot结果显示p38丝裂原活化蛋白激酶在38 kDa处存在特异性蛋白条带。对各条带进行半定量分析发现,10~(-8)、10~(-7)、10~(-6)moL/L AngⅡ作用24h后,p38 MAPK蛋白的相对含量与正常对照组相比具有明显的统计学差异(P＜0.0005)。11、p38 MAPK抑制剂SB203580可以阻断AngⅡ引起的TGF-β1表达上调与正常对照组相比,10~(-6)moL/L AngⅡ作用24h后能够明显促进HSC细胞分泌TGF-β1(P＜0.0005);但当加入SB203580预先阻断p38 MAPK活性后,AngⅡ引起的HSC分泌TGF-β1浓度明显下降(P＜0.0005)。说明p38 MAPK是TGF-β1的上游信号分子。12、p38 MAPK抑制剂SB203580可以阻断AngⅡ引起的HSC增殖与正常对照组相比,10~(-6)moL/L AngⅡ作用24h后能够明显促进HSC增殖;但当加入SB203580预先阻断p38 MAPK通路后,AngⅡ引起的促HSC增殖作用明显下降(P＜0.0005)。说明AngⅡ的促HSC增殖作用是通过p38 MAPK通路介导的。13、p38 MAPK抑制剂SB203580可以阻断AngⅡ引起的HSCα1(Ⅰ)、α1(Ⅳ)型胶原mRNA表达增加10~(-6)moL/L AngⅡ作用24h后,α1(Ⅰ)Col mRNA明显高于正常对照组(P＜0.0005);加入SB203580预先抑制p38 MAPK活性后,α1(Ⅰ)Col mRNA为明显低于未加入SB203580组(P＜0.0005)。α1(Ⅳ)Col mRNA表达结果与α1(Ⅰ)Col基因类似。这些结果提示AngⅡ上调HSCα1(Ⅰ)、α1(Ⅳ)Col mRNA表达需要p38 MAPK的作用。结论1、酒精性肝纤维化时血浆及肝组织内AngⅡ增高,后者与肝纤维化水平呈正相关。2、ACEI能抑制酒精性肝纤维化的形成,降低血清HA、LN水平,减少肝脏内Ⅰ、Ⅳ型胶原蛋白表达。证明AngⅡ具有促进酒精性肝纤维化发生的作用。3、AngⅡ促进原代培养的HSC活化。4、AngⅡ促进原代培养的HSC增殖。5、AngⅡ上调原代培养HSC细胞α1(Ⅰ)、α1(Ⅳ)Col mRNA的表达。6、AngⅡ能够促进HSC细胞合成和分泌TGF-β1。7、AngⅡ能够促进HSC细胞表达p38 MAPK蛋白。8、p38 MAPK介导AngⅡ促HSC细胞增殖,增加α1(Ⅰ)、α1(Ⅳ)型胶原mRNA表达的作用。9、p38 MAPK介导AngⅡ介导促进HSC分泌TGF-β1的作用。10、p38 MAPK介导AngⅡ介导引起的HSC增殖
简玲丽[5]2011年在《非酒精性脂肪性肝病大鼠血管紧张素Ⅱ-1型（AT1）受体及基因表达的研究》文中提出目的探讨AT1受体及基因在非酒精性脂肪性肝病发病机制中的作用。方法雄性SD大鼠32只随机分组,正常对照组、模型组各16只,适应性喂养1周后,模型组给予高脂饮食,正常对照组给予正常饮食,10周、14周后分两次平均处死各组8只大鼠,全自动生化分析仪测定肝功能、血脂,放射免疫计数器测定血管紧张素、醛固酮,运用免疫组化方法观察肝组织中血管紧张素Ⅱ-Ⅰ受体(AT1R)的表达,应用Trizol法提取SD大鼠肝脏组织RNA,采用RT-PCR法检测AT1R mRNA表达。结果1、10周末,模型组大鼠体重增长高于正常对照组,14周末,模型组大鼠体重增长低于正常对照组;2、10周、14周末模型组肝湿重、血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、总胆固醇(TC)、甘油叁酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、血管紧张素Ⅱ(AⅡ)浓度值均高于正常对照组;模型组大鼠高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)均低于正常对照组;3、10周末时,模型组血管紧张素Ⅰ(AⅠ)、AⅡ均较正常对照组升高,AⅠ不具有统计学意义(P>0.05),14周末时:模型组AⅠ、AⅡ均较正常对照组升高,具有统计学意义;4、模型组ALD(醛固酮)均较正常对照组降低,不具有统计学意义;5、模型组有AT1R表达,且14周时表达量高于10周时,正常对照组几乎不表达;6、模型组、对照组肝脏组织均提取出RNA,模型组AT1R mRNA表达显着高于对照组(P<0.01)。结论血管紧张素Ⅱ-Ⅰ受体(AT1R)及基因在非酒精性脂肪性肝病大鼠肝组织中表达,且随着脂肪肝程度的加重表达量有所增加。
罗晓英[6]2014年在《肾素与非酒精性脂肪肝的关系及肾素抑制剂对其的干预研究》文中研究表明研究背景目前非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的患病率不断上升，且其发病机制尚未完全明确。据研究循环肾素-血管紧张素系统(RAS)和肝脏RAS的激活与脂肪肝、肝炎、肝纤维化和肝硬化密切相关。肾素(REN)是RAS起始限速酶，通过级联反应，导致血管紧张素II(ANG II)持续生成，促进机体胰岛素抵抗(IR)、氧化应激及炎症。但RAS对NAFLD的作用，目前研究多局限在细胞和动物水平，临床研究尚不足，且REN对NAFLD的影响国内外鲜有报道。此外，治疗NAFLD目前尚无特效药，针对RAS与NAFLD的关系，国内外开始利用部分RAS抑制剂(如血管紧张素转换酶抑制剂ACEI、血管紧张素受体拮抗剂ARB)干预NAFLD动物模型，但肾素抑制剂(RI)对NAFLD的作用鲜有研究。Aliskiren是一种RI，能直接阻断REN活性，进一步抑制RAS。本研究通过临床实验，探讨血浆肾素活性(PRA)与NAFLD的相关性；并予Aliskiren干预NAFLD大鼠，探索Aliskiren对NAFLD的干预作用。第一部分血浆肾素活性与非酒精性脂肪性肝病的相关性目的探讨血浆肾素活性(PRA)对非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)发生和发展的临床意义。方法选取我院350例研究对象，经临床和影像学(B超和CT)诊断分NAFLD组(159例)与对照组(191例)，并根据肝/脾CT值比，分轻、中重度两组；NAFLD组和对照组的性别、年龄均无统计学差异。收集病史，并检测血浆肾素活性(PRA)、血管紧张素I(ANG I)、血管紧张素II(ANG II)及生化指标(包括肝功能、血脂、血糖)，分析PRA与NAFLD发病和进展、以及PRA与各生化指标的相关性；分别作PRA和谷丙转氨酶(ALT)水平对NAFLD从轻度到中重度的特征曲线(ROC曲线)，比较两者对NAFLD严重程度的诊断效能，确定其诊断界点(cut-off值)，得出灵敏度和特异度较好的评价指标。结果(1) NAFLD的患病情况在不同年龄段有差别，NAFLD患者主要集中于51~80岁。(2)与对照组相比，NAFLD组中伴有T2DM、MS的比例显着升高；NAFLD组中有26.4%人群伴有T2DM，而对照组中只有11.0%(P=0.000)；NAFLD组中有56.0%人群伴有MS，而对照组中只有20.9%(P=0.000)。(3)与对照组相比，NAFLD患者PRA、ANG I、ANG II、ALT、AST、GGT、TG、TC、Apo B、LDL-C、FBG均显着升高(P均小于0.05)；HDL-C则显着降低(P=0.000)。在NAFLD患者中，中重度组的PRA、 ALT、 GGT较轻度组显着升高(P分别为0.006;0.021;0.012)，而HDL-C显着降低(P=0.042)。(4)伴有T2DM、MS病史、PRA≥19pg/mL、ANG I≥1.06ng/mL、ANG II≥97pg/mL、ALT≥40U/L、GGT≥50U/L、TG≥1.70mmol/L、TC≥5.18mmol/L、HDL-C<0.9mmol/L(男)或<1.0mmol/L(女)、LDL-C≥3.37mmol/L、FBG≥6.1mmol/L、2h PBG≥7.8mmol/L是NAFLD发生的危险因素，其中伴有MS、PRA≥19pg/mL是NAFLD发生的独立危险因素(OR分别为5.940;2.671，P均小于0.05)；而且伴有MS病史、PRA≥19pg/mL、ALT≥40U/L是NAFLD从轻度发展至中重度的危险因素，其中PRA≥19pg/mL、ALT≥40U/L是NAFLD从轻度发展至中重度的独立危险因素(OR分别为8.079;6.660，P均小于0.05)；PRA的升高(≥19pg/mL)是贯穿于NAFLD发生和发展全过程的独立危险因素。(5) PRA分别与NAFLD严重程度、ANG I、ANG II、ALT、GGT、TG、TC、LDL-C呈正相关(r分别为0.276;0.674;0.756;0.203;0.272;0.172;0.144;0.130，P均小于0.05)；PRA分别与肝/脾CT值比、HDL-C呈负相关(r分别为-0.238;-0.163，P均小于0.05)。(6) PRA、ALT水平对NAFLD从轻度发展至中重度的ROC曲线中，PRA的AUC比ALT的显着增大，PRA的灵敏度高于ALT，PRA曲线上预测NAFLD中重度的cut-off值为26.86pg/mL，AUC为0.677(95%CI为0.577~0.777)，灵敏度为94.1%。结论PRA的升高对NAFLD的发生进展有重大影响，PRA可作为一项较灵敏的评价NAFLD严重程度的指标。第二部分肾素抑制剂Aliskiren对非酒精性脂肪肝大鼠的干预作用目的探讨肾素抑制剂Aliskiren对非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的干预作用及机制。方法将40只8周龄SD雄性大鼠随机分3组：正常对照(N)组(n=15只)、NAFLD模型(M)组(n=15只)、Aliskiren干预(A)组(n=10只)，其中N组予普通饲料，M组和A组均予高脂饲料喂养。A组予Aliskiren (50mg/(kg·d))灌胃，M组和N组予等量生理盐水灌胃，共干预8周。干预前叁组大鼠的体重、身长、收缩压(SP)、舒张压(DP)、尾静脉空腹血糖(FBG)均无统计学差异。观察叁组大鼠每周生长情况、尾动脉血压和尾静脉FBG的变化。实验末取各组大鼠肝组织行HE染色和油红O染色评价脂肪变性程度，并比较各组肝功能、血脂、FBG、空腹胰岛素(INS)、胰岛素抵抗指数(HOMR-IR)、丙二醛(MDA)、血浆肾素(REN)和血管紧张素II(ANG II)以及肝组织脂质、MDA、REN、ANG II和转化生长因子-β1(TGF-β1)含量。结果(1)与N组相比，高脂喂养的M组和A组体重和肥胖指数(Lee’s Index)显着增高，而M组与A组间体重及Lee’s Index无差异；M组的SP和DP为叁组中最高，A组的SP和DP为叁组中最低。(2) M组的肝湿重和肝指数为叁组中最高，而A组肝湿重和肝指数与N组无差异；M组的ALT较N组显着升高，A组较M组显着降低；M组和A组的AST均较N组显着升高，但M组与A组间AST无差异；与N组相比，M组和A组的FBG、INS及HOMR-IR均显着增高，但A组的FBG、INS及HOMR-IR均较M组降低。(3)与N组对比，M组和A组血清和肝组织的TG、TC均明显升高，而M组与A组间血清TG、TC无差异，但A组肝组织的TG、TC较M组显着下降；M组血清和肝组织MDA最高，而A组肝匀浆MDA较M组低。(4) M组血浆和肝组织的REN、ANG II为叁组中最高，A组血浆和肝组织的REN、ANG II均较M组显着下降。(5) M组和A组肝匀浆TGF-β1(M组13.65±2.44ng/gprot、A组11.51±2.82ng/gprot)均较N组(6.99±1.01ng/gprot)显着增高；但A组较M组显着下降。(6) HE染色和油红O染色均显示，M组所有大鼠肝组织有脂肪变而A组部分大鼠肝组织脂肪变，且A组脂变程度均较M组显着减轻。结论Aliskiren通过抑制RAS活性、减少ANG II水平从而改善IR和氧化应激，以及抑制肝组织中脂质紊乱和减少TGF-β1，从而减少NAFLD的形成及减轻其发展。
张晓平[7]2013年在《川芎嗪影响血管紧张素Ⅱ诱导的肝星状细胞活化的机制研究》文中进行了进一步梳理[目的]肝纤维化是继发于各种形式的慢性肝损伤之后组织修复过程中的一种代偿反应,也是慢性肝病发展成为肝硬化必经的病理过程。在损伤肝脏中,HSC的活化和增殖与肝纤维化的发生发展密切相关,它是主要的细胞外基质生成细胞,也是预防和治疗慢性肝病的重要靶细胞。肝内Ang Ⅱ与肝纤维化程度呈正相关,可通过多种途径诱导HSC的活化致使肝纤维化难以逆转。体内外实验表明中药有效成分川芎嗪具有显着的抗炎、抗氧化及治疗肝纤维化的作用,但作用机制仍然不十分清楚。本课题利用Ang Ⅱ诱导HSC活化,旨在探讨:1)AngⅡ对HSC增殖活化的影响,并在此基础上观察川芎嗪对HSC的干预作用;2)从PDGF-βR/MAPK、PI3K/AKT/mTOR信号转导通路方面进一步阐明川芎嗪影响Ang Ⅱ诱导HSC活化的作用机制,旨在为临床治疗肝纤维化提供更有效的策略。[研究方法]本课题采用与肝纤维化发生发展密切相关的HSC进行体外实验研究,分离并培养原代HSC,应用 MTT、Hoechst 染色、免疫荧光、Western blotting、Real-time PCR、划痕、Transwell小室、流式细胞技术等实验技术进行检测。观察:1)Ang Ⅱ对HSC增殖、形态学、迁移能力及HSC活化标志物α-SMA及ECM(collagen αl(Ⅰ)及Fibronectin)表达的影响;2)川弯嗪对Ang Ⅱ诱导的HSC增殖、细胞周期、运动、凋亡、HSC活化标志物和HSC活化相关蛋白及mRNA表达的影响;3)明确Ang Ⅱ诱导的HSC中PDGF-βR/MAPK、PI3K/AKT/mTOR两条信号通路之间的相互作用关系,以及川芎嗪对AngⅡ诱导的HSC中PDGF-βR/MAPK、PI3K/AKT/mTOR信号转导通路的影响。[结果]研究发现,Ang Ⅱ在1μM时能显着促进HSC活化,主要表现为促进HSC增殖、改变HSC形态、促进α-SMA和ECM主要成分collagen α1(Ⅰ)及Fibronectin蛋白的表达。川考嗪进行干预后能够显着抑制Ang Ⅱ诱导的HSC的活化,表现为川芎嗪浓度在10μM时能够显着抑制HSC增殖(P<0.05),在50μM作用浓度时能非常显着抑制HSC增殖(P<0.01),并抑制α-SMA、collagen α1(Ⅰ)和Fibronectin蛋白和mRNA表达;川芎嗪在20μM时能显着增加PPARy蛋白的表达并抑制TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、NF-κB蛋白的表达;川芎嗪通过将HSC阻滞在G2期,抑制Ang Ⅱ作用引起的HSC中CDK1、Cyclin B1表达的升高和CDK2、Cyclin A的升高从而抑制HSC增殖;Ang Ⅱ能够促进HSC的迁移和侵袭,川芎嗪干预后,HSC迁移和侵袭能力降低,并抑制p-FAK、p-paxillin的表达;流式检测结果显示,川芎嗪浓度在20μM时能够显着诱导HSC凋亡(P<0.05),在50μM作用浓度时能非常显着诱导HSC凋亡(P<0.01),并通过增加活化型caspase-3的表达,降低Bcl-2/Bax的比值,发挥促HSC凋亡的作用。川芎嗪抑制HSC活化主要表现为能够显着抑制PDGF-βR和mTOR通路的激活。具体表现为川芎嗪能显着抑制PDGF-βR及其下游P-ERK、p38和JNK的表达,抑制p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表达。通过加入ERK抑制剂U0126、mTOR的抑制剂Rapamycin和PDGF-βR抑制剂Imatinib,明确了 Ang Ⅱ激活的HSC中PDGF-pR与mTOR信号通路存在交互关系。实验结果还显示川芎嗪能和U0126/Rapamycin/Imatinib共同抑制α-SMA、collagen α1(Ⅰ)和Fibronectin的表达,从而抑制HSC的活化。[结论]Ang Ⅱ能够显着诱导HSC活化,促进α-SMA的表达及ECM主要成分collagen α1(Ⅰ)及Fibronectin蛋白和mRNA的表达。川芎嗪进行干预后能够显着抑制Ang Ⅱ诱导HSC的增殖和迁移,阻滞其细胞周期并促进HSC凋亡,抑制肝纤维化相关标志蛋白的表达,这种作用是通过抑制PDGF-βR/MAPK和PI3K/AKT/mTOR信号转导通路来实现的,并且这两条信号通路存在交互作用。
韩宏光[8]2009年在《血管紧张素Ⅱ及其受体在人肝癌中的表达及其临床意义》文中研究说明目的:探讨血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)及血管紧张素ⅡⅠ型受体(angiotensinⅡtypeⅠreceptor,AT1R)在人肝细胞癌组织、癌旁组织和正常肝组织中的表达及与肝癌临床特征的关系。方法:应用免疫组织化学方法分析行手术切除的45例肝癌和癌旁组织以及12例正常肝组织的AngⅡ及AT1R的表达情况。结果:45例肝癌组织中39例AngⅡ表达阳性(86.67%),41例AT1R表达阳性(91.11%);45例癌旁组织中7例AngⅡ表达阳性(15.56%),10例AT1R表达阳性(22.22%)。正常肝组织标本AngⅡ及AT1R表达均阴性。AngⅡ及AT1R在肝癌组织中的表达与病人的性别、年龄、肿瘤直径、HbsAg(+/-)、AFP和肝硬化背景无关(P>0.05),临床分期及病理分级之间存在显着性差异(P<0.01)。结论:AngⅡ及AT1R在肝癌组织中的表达升高,并且随肝癌的分期及病理分级表达增高,表明AngⅡ及AT1R与肝癌的发生、发展及转移有关。
易雷鸣[9]2007年在《血管紧张素Ⅱ及血管紧张素Ⅱ-1型受体在口腔粘膜下纤维性变中的表达研究》文中进行了进一步梳理目的：通过检测血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)及血管紧张素Ⅱ-1型受体(angiotensinⅡtype 1 receptor，AT1R)在口腔粘膜下纤维性变(Oral Submucous Fibrosis，OSF)病变组织中的表达与分布情况，进一步探讨OSF的发病机制。方法：采用免疫组化SP法，分别测定AngⅡ及AT1R兔抗人多克隆抗体在5例正常对照者及30例OSF患者口腔粘膜中的表达及分布情况。采用盲法观察阳性反应，AngⅡ及AT1R蛋白的染色强度用平均灰度值评价。结果：(1) AngⅡ蛋白在正常口腔粘膜中呈弱阳性表达，在OSF早期、中期、晚期的表达呈强阳性或阳性。早期表达最强，中、晚期表达有所下降，但仍高于正常对照组，各期OSF与正常对照组之间的表达有显着性差异(P＜0.05)。AngⅡ蛋白在各期上皮组织中的表达均高于在粘膜下结缔组织中的表达，差别具有统计学意义(P＜0.05)。(2) AT1R蛋白在正常口腔粘膜中呈阳性表达，在OSF早期、中期、晚期的表达呈强阳性或阳性。在早期表达最高，中、晚期表达有所下降，早期、中期OSF与正常对照组之间的表达有显着性差异(P＜0.05)；晚期OSF与正常对照组之间的表达无显着性差异(P＞0.05)。AT1R蛋白在各期上皮组织中及粘膜下结缔组织中均有明显表达，就其在两组织中表达强度相比，差别无统计学意义(P＞0.05)。结论：(1)正常口腔粘膜中AngⅡ与AT1R蛋白均有表达，提示口腔粘膜可能存在局部肾素血管紧张素系统，AngⅡ与AT1R结合后能维持口腔粘膜的正常生理功能。(2) OSF病变组织中AngⅡ蛋白及AT1R蛋白表达升高，提示AngⅡ与AT1R选择性结合后参与了OSF的发病进程。(3) AngⅡ与AT1R蛋白在正常及OSF病变的上皮组织及粘膜下结缔组织中的分布趋势不完全一致，推测AT1R只介导了AngⅡ部分作用。
英嵩崧[10]2009年在《血管紧张素1-7经Rho-Rock通路对大鼠肝星状细胞收缩的影响》文中研究说明研究背景多种慢性肝病可由肝纤维化发展为肝硬化,门静脉高压是肝硬化的主要特征之一。肝硬化状态下,肝内血管阻力的增加是导致门静脉高压的重要因素。肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)是肝细胞外基质的主要细胞,HSC活化在肝纤维化的发生发展以及门脉高压形成一系列过程中起关键作用。活化的HSC转化为肌成纤维细胞和成纤维细胞,不断增殖,并获得收缩性。当后者发生强烈收缩,致使肝窦直径缩小,肝内血管阻力增大;同时可引起肝组织瘢痕挛缩,进一步增加肝内血管阻力,导致门静脉高压。可见,HSC收缩的调控机制是门静脉高压机理研究的重要一环。近年来,肝内肾素-血管紧张素-醛固酮系统(therenin-angiotensin-aldosterone system,RAAS)已成为肝纤维化研究领域的热点,随着对RAAS认识的不断深化,发现了RAAS的许多新组分,如血管紧张素转换酶2(ACE2)、血管紧张素1-7(Ang-(1-7))、Ang-(1-7)的受体Mas等。它们构成的ACE2-Ang(1-7)-Mas受体轴,成为RAAS的另一重要分支,对ACE-AngⅡ-AT1R轴具有显着的抑制作用。肝内ACE-AngⅡ-AT1R轴与门静脉高压的形成有密切关系。目前未见有关ACE2-Ang(1-7)-Mas受体轴对HSC收缩调控的研究报道。HSC活化后转化为肌成纤维细胞样细胞,具有平滑肌细胞的特征,提示HSC收缩和平滑肌细胞收缩的分子机制是类似的,可通过钙离子依赖性和非钙离子依赖性两种通路完成收缩。在非钙途径中,Rho-Rock通路对HSC收缩的调控机制是近年研究的热点。本研究通过观察Ang-(1-7)对HSC收缩及Rho-Rock信号通路上各元件表达的影响来阐明其对HSC收缩调控的影响。目的探讨血管紧张素1-7(angiotensin1-7,Ang-(1-7))对大鼠HSC收缩以及由Rho激酶介导的非Ca~(2+)依赖性信号转导通路的影响。方法①将HSC-T6细胞株给予Ang-(1-7)1μmol/L处理,聚硅酮膜法直观检测HSC的收缩性;②将HSC-T6细胞株给予Ang-(1-7)10μmol/L处理,免疫印迹法检测肌球蛋白轻链(myosin light chain,MLC)、磷酸化MLC和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达水平。观察Ang-(1-7)、AngⅡ(angiotensinⅡ)、Ang-(1-7)MAS受体阻断剂A779、AngⅡ和Ang-(1-7)对磷酸化MLC和α-SMA表达水平的影响;③逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Rho-Rock通路中Rock2(Rho kinase2)、RhoAGTP、RhoGEF(Rho Guanine Nucleotide Exchange Factors,RhoGEF)的表达。结果AngⅡ处理组磷酸化MLC蛋白的表达显着增强(P=0.000)。Ang-(1-7)可抑制AngⅡ诱导的HSC的收缩。AngⅡ+Ang-(1-7)处理组可抑制AngⅡ诱导的MLC蛋白磷酸化水平(P=0.000),而Ang-(1-7)处理组磷酸化MLC蛋白水平显着高于Ang-(1-7)+A779处理组,差异有统计学意义(P=0.000)。AngⅡ处理组α-SMA蛋白的表达显着增强(P=0.000),AngⅡ+Ang-(1-7)处理组可抑制AngⅡ诱导的α-SMA蛋白表达水平,差异有统计学意义(P=0.000)。AngⅡ组RhoGEF mRNA显着高于阴性对照组(P=0.000),Ang-(1-7)+AngⅡ组RhoGEF mRNA比AngⅡ组的表达显着减弱(P=0.000),Ang-(1-7)组RhoGEF mRNA显着低于阴性对照组(P=0.000),差异有统计学意义(P=0.000)。AngⅡ组Rock2 mRNA显着高于阴性对照组(P=0.000),Ang-(1-7)+AngⅡ组Rock2 mRNA比AngⅡ组的表达显着减弱(P=0.000),Ang-(1-7)组Rock2 mRNA显着低于阴性对照组(P=0.000),Ang-(1-7)+A779组Rock2 mRNA的表达显着低于Ang-(1-7)组,差异有统计学意义(P=0.000)。AngⅡ组RhoAGTP mRNA显着高于阴性对照组(P=0.000),Ang-(1-7)+AngⅡ组RhoAGTP mRNA比AngⅡ组的表达显着减弱(P=0.000),Ang-(1-7)组RhoAGTP mRNA显着低于阴性对照组(P=0.000),Ang-(1-7)+A779组RhoAGTP mRNA的表达显着低于Ang-(1-7)组,差异有统计学意义(P=0.000)。结论Ang-(1-7)可通过Rho-Rock信号通路抑制AngⅡ诱导的HSC收缩。
参考文献：
[1]. 肝内肾素-血管紧张素-醛固酮系统在肝纤维化形成中的信号转导机制研究[D]. 李旭. 第一军医大学. 2004
[2]. 血管紧张素Ⅱ和醛固酮对大鼠肝星状细胞收缩及RhoA-Rock通路的影响[D]. 张小兰. 南方医科大学. 2008
[3]. 血管紧张素转移系统(RAS)在肝脏纤维化形成中的作用机制[J]. 张东慧, 徐晨阳, 李亚芯, 张源淑. 畜牧与兽医. 2012
[4]. 血管紧张素Ⅱ促进酒精性肝纤维化的机制研究[D]. 于继红. 中国医科大学. 2008
[5]. 非酒精性脂肪性肝病大鼠血管紧张素Ⅱ-1型（AT1）受体及基因表达的研究[D]. 简玲丽. 福建医科大学. 2011
[6]. 肾素与非酒精性脂肪肝的关系及肾素抑制剂对其的干预研究[D]. 罗晓英. 广州医科大学. 2014
[7]. 川芎嗪影响血管紧张素Ⅱ诱导的肝星状细胞活化的机制研究[D]. 张晓平. 南京中医药大学. 2013
[8]. 血管紧张素Ⅱ及其受体在人肝癌中的表达及其临床意义[D]. 韩宏光. 青岛大学. 2009
[9]. 血管紧张素Ⅱ及血管紧张素Ⅱ-1型受体在口腔粘膜下纤维性变中的表达研究[D]. 易雷鸣. 中南大学. 2007
[10]. 血管紧张素1-7经Rho-Rock通路对大鼠肝星状细胞收缩的影响[D]. 英嵩崧. 南方医科大学. 2009
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