张勇[1]2004年在《根癌农杆菌介导的新疆甜瓜转化兔防御素NP-1基因研究》文中研究说明近年在新疆甜瓜的生产中，微生物病害已成为影响新疆甜瓜产量和品质的重要因素。作者试图通过植物基因工程方法，利用根癌农杆菌将兔防御素基因NP-1导入新疆甜瓜中，以提高其抗病原菌危害的能力。实验中选取新疆甜瓜主栽品种：伽师瓜和皇后，建立组培再生体系。结果表明：3日龄子叶切块，均在MS＋BA1.0mg/L＋IBA 0.2 mg/L 时不定芽诱导最佳，35d有效芽诱导率分别可以达到28%和25.6％。较佳的茎段增殖培养条件为：MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.1mg/L＋琼脂粉8g/L, pH 5.8 ,增殖系数最高达7.3 。在生根培养时，用1/2MS+0.5mg/L IBA诱导生根率较高。同时，利用根癌农杆菌介导，将广谱抗菌的NP-1基因导入伽师、皇后两个甜瓜品种。着重研究了影响甜瓜转化的外部因子：子叶外植体经3d预培养，重悬于MS液体培养基使菌液浓度达O.D600 0.6后进行侵染8～12min，再经3d共培养对转化最为有利；在侵染前进行0.2mg/L甘露醇高渗处理可提高转化率6.6%，乙酰丁香酮在甜瓜的转化中并未有显著影响。转化中卡那霉素合适筛选压力为100mg/L，转化后抑菌氨苄青霉素浓度为500mg/L有利于获取转化植株，转化率可达到12％。经卡那霉素的抗性筛选，获得转化的再生植株。分别使用PCR反应、RT-PCR反应及离体抑菌实验等手段，进一步研究了再生植株的基因整合与表达情况。经PCR和RT-PCR扩增反应的琼脂糖电泳检测，在转化植株中扩增出了特异片段，证明外源基因已整合到甜瓜基因组中，离体抑菌实验中兔防御素NP-1的转化植株能够对多种细菌表现良好的抗性，表明整合的外源基因已经得到表达。
李群[2]2000年在《根癌农杆菌介导的β-1，3-葡聚糖酶基因在新疆甜瓜中的转化与表达》文中研究说明为了获得抗真菌性病害的新疆甜瓜（Cucumis melo L.）转基因品种，以栽培品种“红蜜脆”、“伽师”、“皇后”、“黄醉仙”为实验材料，通过组织培养，建立了遗传转化的最佳再生体系。在此基础上，选用甜瓜子叶块作为外植体，经含有β-1，3-葡聚糖酶基因的根癌农杆菌（Agrobactriumtumefaciens）LBAG3301浸染，用改良的MS培养基，经卡那霉素抗性筛选，获得了根、茎、叶完整的再生植株。用PCR特异性扩增、琼脂糖电泳、SDS-PAGE、过氧化物酶同工酶电泳等手段，进一步研究了再生植株的基因的整合与表达情况以及同工酶的变化情况。结果表明：与对照相比，只有转化植株DNA样品出现特异性PCR扩增片段，长度约为760bp，与该基因引物扩增产物片段长度吻合，表明该基因确已整合在转化甜瓜基因组内。SDS-PAGE结果表明，转化植株与对照相比在47kD处多一条蛋白质谱带，其分子量与该基因表达产物分子量吻合，可初步确定该基因在转化植株内得到正常表达。过氧化物同工酶电泳表明：转化植株比对照分别在迁移率较快和较慢的区域多出两条酶谱带，表明转化植株与对照相比过氧化物酶同工酶活性有所变化。
刘玲玲[3]2004年在《Chi和Glu的克隆与维管束特异启动子驱动的表达载体构建及其对甜瓜的遗传转化》文中研究表明甜瓜（Cucumis melo L.）是世界上广泛种植的水果之一,因其香甜可口、营养丰富，加之经济价值高，应用广泛而深受消费者青睐。但目前生产上使用的大多品种为抗性单一或抗病性差的品种，往往给生产造成严重的损失，故加强抗病性甜瓜品种尤其是广谱抗性品种的选育是提高甜瓜品质和产量的关键。通过常规育种方法将多抗基因集中到同一个品种的研究，不但耗时耗力，而且难度极大；加之甜瓜自身抗性基因资源缺乏，往往导致育种周期长而效率不高的问题。相比之下，植物基因工程技术是培育多抗性品种的一条十分便捷的途径，它可以打破物种间的界限，可以从微生物及其近缘植物中分离出抗病基因，然后通过遗传转化一次性将抗病基因导入受体植物品种以提高其抗病能力，具有目标明确，育种周期短和效率高的突出优点，现已成为抗病育种的尖端技术。本研究从美洲黑杨叶片中提取基因组DNA，克隆到维管束特异性表达蛋白（BSP）基因启动子功能区段，分子大小为860bp，其中富含A/T的区域和富含A/T的重复序列。通过序列对比分析与已报道的碱基序列有98.2％的同源性。以绿色荧光蛋白（GFP）基因为报道基因，通过基因枪法转化烟草叶片，通过转化烟草维管组织的瞬时表达结果表明，该启动子具有维管组织特异性表达活性。设计特异扩增引物，采用PCR扩增技术从质粒pART27Tch中克隆到木霉几丁质酶（Chi）基因，该片段分子大小为1275bp，通过序列分析与文献报道的碱基序列有99.45％的同源性。同时设计特异扩增引物，从质粒pBLGC中克隆到烟草β-1,3-葡聚糖酶(Glu)基因，该片段分子大小为1088bp，通过序列分析与文献报道的碱基序列有99.81％的同源性。将Chi和Glu基因分别插入到微生物表达载体pET28a(+)的T7启动子和终止子之间，构建成N-端携带6×His标签子的原核表达载体，通过IPTG诱导表达，提取表达产物，进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定，分别得到分子量约49.5kDa和42.5kDa的特异蛋白条带，证明Chi和Glu基因的表达产物的分子量与理论推算的相符。将表达产物进行抑菌实验，结果表明：几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶都对真菌有很强的抑制作用。构建了具有BSP－Chi－终止子和具有BSP－Glu－终止子的表达载体pBIC和pBIG,然后切下载体pBIG上的具有BSP-Glu-终止子的片段，插入到载体pBIC，<WP=10>构建了双价植物表达载体pBIBCG：采用直接导入法已将双价表达载体质粒导入农杆菌LBA4404得到了工程菌。采用农杆菌介导法，对甜瓜叶片和茎段进行了遗传转化，从不同受体材料的转化效果来看，试管苗叶片是遗传转化的较好材料，具有愈伤诱导率高，分化再生能力强，取材方便的突出优点。对2号和5号甜瓜品种进行了转化研究，结果显示农杆菌对甜瓜基因型存在依赖性，目前得到了2号品种的转化苗，正在进行继代繁殖，以便进行阳性植株检测。
葛屹松[4]2002年在《新疆甜瓜组培体系的优化及抗病转基因研究》文中研究指明近几年来在新疆甜瓜的生产中，真菌病害已成为影响新疆甜瓜产量和品质的重要因素。作者试图通过植物基因工程方法，利用根癌农杆菌将抗真菌蛋白的几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因导入新疆甜瓜中，以提高其抗真菌病害的能力。选用新疆优良甜瓜品种：红蜜脆、皇后、黄醉仙、8601，用未成熟子叶切块作为外植体，经过组织培养获得再生植株。以MS为基本培养基，取3日龄子叶块外植体，选用MS+6-BA0-2.5mg/L诱导丛生芽,最高诱导率可达89%。其中杂交种的芽诱导率高于本地种。由于基因型的差异，不同品种甜瓜诱导不定芽的最适激素浓度不同，而且在整个生长过程中，6-BA的浓度逐渐降低。在生根培养时，用1/2MS+0.5mg/L IBA或 NAA诱导生根率较高。在建立甜瓜高效再生体系的基础上，用根癌农杆菌介导法将几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因导入新疆甜瓜中，经卡那霉素的抗性筛选，获得转化的再生植株。用PCR反应、点杂交及SDS-PAGE等手段，进一步研究了再生植株的基因整合与表达情况。经PCR扩增反应和琼脂糖电泳检测，在转化植株中扩增出了特异片段，证明外源基因已整合到甜瓜基因组中。点杂交检测转化植株有阳性反应。SDS-PAGE分析表明，转化植株比对照在35.5KD处有一条明显的蛋白质谱带，其分子量与几丁质酶基因表达产物分子量相符。可初步确定该基因在转化植株内得到正常表达。
赵晓琴[5]2003年在《新疆甜瓜转化再生体系优化及抗真菌病转基因研究》文中研究表明选取新疆伽师瓜、8601甜瓜品种种子常规灭菌，取3天日龄的子叶块为外植体，以MB为基本培养基(基本组成为MS，有机元素为B5)。进行6—BA最适浓度梯度、6—BA与IBA的搭配试验、赤霉素、抗生素、甘露醇、浸染时间和共培养时间等几个因素对甜瓜再生体系建立及转化影响实验，其结果如下： (1)单加6-BA诱导丛生芽，所选甜瓜品种子叶块在6-BA浓度为1.0mg/L左右诱导效果好，最高出芽率可达93.3％。子叶块外植体靠近胚轴端的切口处有大量丛生芽产生，远离胚轴端基本无芽的产生，说咀以甜瓜子叶块为外植体芽的产生有一定的极性。(2)以1.0mg／L 6-BA为基础，配合不同浓度的IBA(0.05、0.1、0.3mg／L)，其中1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L IBA的诱导芽丛效果较好(出芽率89.1％)，较单加6-BA的芽丛诱导率低。甜瓜子叶块在加有IBA的培养基上膨大十分明显、快速，说明IBA在一定浓度范围有助于甜瓜外植体的膨大生长。(3)赤霉素(0.2-0.5 mg/L)一方面十分有利于成苗的拔高、木质化，另一方面还有利于周围小苗的生长，从而提高出芽率。(4)农杆菌浸染前用0.2 mg/L甘露醇处理子叶块24-36hr，可以提高转化效率，而乙酰丁香酮效果不明显。(5)加有头孢霉素和氨苄青霉素两种抗生素培养基对甜瓜的出芽率影响不是很大，只是稍有降低。但在含有头孢霉素的培养基上生长的再生芽长势较弱也较缓慢，而氨苄青霉素效果较好，合适浓度为500-700mg／L。(6)农杆菌浓度0．D_(600)为0.4-0.6时，浸染8分钟共培养5天的时间比较合适。 对经过卡那霉素筛选得到的抗性植株进行几丁质酶和β-1.3-葡聚糖酶两种酶的PCR检测和SDS-PAGE检测。PCR检测证明，所选的转基因外植体已整合有两个目的基因。但SDS-PAGE初步检测认为抗性外植体中只有几丁质酶的表达，而β-1.3-葡聚糖酶没有表达。
白婧[6]2008年在《农杆菌介导β-1，3-葡聚糖酶（BG2）基因转化南瓜的研究》文中进行了进一步梳理南瓜营养丰富、用途广泛,具有较高的食用价值和经济价值。黑龙江省籽用南瓜栽培面积年达到300万亩,是国内外重要的籽用南瓜产区。南瓜籽也是黑龙江省农产品出口创汇产品之一。南瓜真菌病害的危害极大降低了南瓜的产量和品质。南瓜疫病造成死秧烂瓜,个别多雨年份病害大流行可造成局部地区绝产。南瓜白粉病造成植株早衰而降低产量和影响籽粒饱满度。常规抗病育种方法在南瓜的品种改良、选育等方面发挥了重要作用,但存在选育年限长、耗资大、效率低及抗性种质资源匮乏等问题。近年来以导入目的基因创造新种质的基因工程手段的应用,为南瓜抗真菌病育种的选育开辟了一条新途径。本试验以金辉一号南瓜为试材,建立了南瓜高频再生体系,通过农杆菌介导将抗真菌病基因β-1,3-葡聚糖酶(BG2)基因导入金辉一号南瓜中,并探讨了影响其再生体系和遗传转化效率的主要因素,确定了金辉一号南瓜最佳再生和遗传转化条件,为培育南瓜抗真菌病新品种奠定了基础。研究的主要内容和结果如下:(1)建立了金辉一号南瓜再生体系:最佳无菌苗萌发培养基为0.8%琼脂,接种方式为平放;最佳外植体来源为“两片子叶呈直立状态,颜色为绿色”的无菌苗;最佳外植体为1/2子叶节;最佳不定芽分化培养基为MS+1.0mg/L 6-BA,芽伸长培养基为MS+0.1mg/L 6-BA+0.1mg/L GA3;最佳生根培养基为MS+0.1mg/L NAA。(2)确定了抗生素筛选浓度:载体上含有NPTⅡ选择标记基因,使转化植株带有卡那霉素抗性,本试验进行两次筛选,确定芽分化阶段卡那霉素筛选浓度为100mg/L。(3)确定了预培养时间、菌液浓度、侵染时间、共培养时间、AS添加浓度五个因素对遗传转化的影响:最佳组合为:预培养36h+OD600(0.3~0.5)侵染10min+共培养2d(培养基中添加100 mg/LAS)(4)对得到的抗性植株进行PCR检测和Southern杂交检测,获得5株阳性植株。
娄树宝[7]2008年在《β-1，3-葡聚糖酶活性与大豆抗疫霉根腐病的关系》文中研究表明β-1,3-葡聚糖酶是一种重要的PR蛋白,能够降解β-1,3-葡聚糖(大多数病原真菌细胞壁的主要成分之一),从而使细胞内含物外溢,导致病原菌死亡。β-1,3-葡聚糖酶可由多种生物因子和非生物因子诱导产生,能催化β-1,3-葡聚糖和β-1,3-1,6-葡聚糖的水解,水解产物寡糖是植物防御反应的重要激发子。β-1,3-葡聚糖酶不但能够抑制真菌菌丝的生长,而且还可以释放真菌细胞壁的诱导物,从而间接促进寄主体内植保素的积累,增加抗病能力。同时β-1,3-葡聚糖在植物细胞壁含量极少,因此该酶在植物抗病工程中具有极高的生防价值。本研究对β-1,3-葡聚糖酶与大豆抗疫霉根腐病的关系、酶学性质以及抑菌活性进行了系统的研究,其结果如下:1.接种大豆真叶和复叶后各大豆品种的β-1,3-葡聚糖酶活性均明显升高。接种大豆真叶后抗病品种48 h出现酶活性高峰,酶活性增加105%;中感品种和感病品种72 h出现酶活性高峰,酶活性增加量分别为67%和65%。接种大豆复叶后酶的含量和活性的变化与真叶反应一致。β-1,3-葡聚糖酶的活性与大豆品种的抗病性呈正相关,抗病品种较感病品种酶活性峰值出现早,酶活性增加量高,且高活性维持的时间长。2.对β-1,3-葡聚糖酶的基本性质进行了测定,结果表明酶的最适反应温度为55℃,最适反应pH为5.0,在55℃以下,pH 4.5～6.5范围内酶较稳定;Mg~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)、Fe~(3+)、Hg~(2+)、Ba~(2+)对β-1,3-葡聚糖酶活力有抑制作用,Ca~(2+)、K+、Al~(3+)对酶活力有激活作用;对β-1,3-葡聚糖酶的动力学分析结果表明,酶的米氏常数Km为0.736 mg /mL,最大反应速度Vm为0.261 mg /(mL·min)。3.离体抑菌试验表明,β-1,3-葡聚糖酶粗酶液对大豆疫霉菌的菌丝生长和孢子萌发有明显的抑制作用。
朱妍妍[8]2008年在《RNAi技术在黄瓜抗根结线虫遗传转化中的应用研究》文中研究表明根结线虫在引起黄瓜侵染性病害的四大病原中,正逐渐成为仅次于真菌、细菌病害的一类重要的植物病原物。黄瓜根结线虫病已成为影响黄瓜生产较突出的问题.根结线虫的防治方法包括栽培防病、化学防病和抗线虫品种培育。抗线虫品种培育一直是育种家追寻的理想途径,但由于种质资源的匮乏,仅靠现有资源和常规育种方法很难育出抗线虫的黄瓜品种。利用生物技术辅助传统育种是解决抗源匮乏的有效途径。通过基因工程提高植物抗逆性技术早已在黄瓜育种中探索应用。RNA干扰(RNAi)是目前分子生物学研究的热点之一,是一种由同源序列引发的基因沉默现象。由于黄瓜组织培养困难,再生率较低,再生周期长,因而很少生物技术工作者选择黄瓜作为遗传转化的受体。因此,本试验着重开展了黄瓜高效植株再生体系的研究,黄瓜抗根结线虫RNAi载体的构建,农杆菌介导和花粉管导入技术转化黄瓜的研究,研究结果如下:(1)筛选出较为优化的黄瓜再生体系。取材时间以播种2天苗龄的子叶为最佳接种苗龄;取材部位以近叶柄端子叶为最佳再生外植体材料;最佳芽诱导培养基是MS+ 6-BA 1 mg·L-1 + ABA 1 mg·L-1+ Ades20 mg·L-1;培养早期Ades和ABA的存在能降低POD的含量,促进不定芽的再生。(2)构建了抗根结线虫的RNAi表达载体。提取带有根结线虫的黄瓜根系总RNA,利用RT-PCR扩增出根结线虫保守基因16D10,连接到T载体pMD-18上,测序表明所扩增的序列与已发表的四种主要根结线虫(南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫和北方根结线虫)序列具有很高的同源性,然后将16D10基因正向和反向插入到pBLUE载体上,构建了双链载体pBLUE-22-21,并将此双链基因插入到由35S启动子调控的克隆载体pRTL2上,命名为pRTL2-22-21,再将含有启动子和终止子以及双链的目的片段插入到双元表达载体pBIN-19上,得到表达载体pBIN-22-21。(3)研究了影响农杆菌介导的黄瓜遗传转化因素。不同基因型黄瓜品种对抗性芽数影响很大,鲁黄瓜8号适合作为转化材料;不同发育时期的子叶直接诱导黄瓜抗性芽的潜能不同,当两片子叶将要脱离种壳,子叶露出部分为绿色时进行外植体切割产生的抗性芽多;黄瓜对Kan较敏感,采用延迟筛选法进行筛选;同一浓度的Carb和Cef对黄瓜芽分化没有明显的差异,但综合抑菌效果,选择Cef 300 mg·L-1或者是Carb500 mg·L-1作为抑菌剂。(4)研究了花粉管通道法介导的黄瓜遗传转化。不同注射方法影响坐果率,采用授粉后24 h后用刀片沿柱头与子房颈分处切去柱头的方法较好。
参考文献：
[1]. 根癌农杆菌介导的新疆甜瓜转化兔防御素NP-1基因研究[D]. 张勇. 新疆大学. 2004
[2]. 根癌农杆菌介导的β-1，3-葡聚糖酶基因在新疆甜瓜中的转化与表达[D]. 李群. 新疆农业大学. 2000
[3]. Chi和Glu的克隆与维管束特异启动子驱动的表达载体构建及其对甜瓜的遗传转化[D]. 刘玲玲. 甘肃农业大学. 2004
[4]. 新疆甜瓜组培体系的优化及抗病转基因研究[D]. 葛屹松. 新疆大学. 2002
[5]. 新疆甜瓜转化再生体系优化及抗真菌病转基因研究[D]. 赵晓琴. 新疆大学. 2003
[6]. 农杆菌介导β-1，3-葡聚糖酶（BG2）基因转化南瓜的研究[D]. 白婧. 东北农业大学. 2008
[7]. β-1，3-葡聚糖酶活性与大豆抗疫霉根腐病的关系[D]. 娄树宝. 黑龙江八一农垦大学. 2008
[8]. RNAi技术在黄瓜抗根结线虫遗传转化中的应用研究[D]. 朱妍妍. 山东农业大学. 2008