大鼠肢体缺血预处理对肝脏缺血再灌注损伤保护作用机制的初步探讨论文_张冰1通讯作者谭莉莉2杨永丰1张建军1瞿海龙1田占发1

张冰1通讯作者谭莉莉2杨永丰1张建军1瞿海龙1田占发1

1河北大学附属医院急诊科河北保定　071000;

2河北大学附属医院贵宾病房河北保定　071000

【摘要】

目的观察大鼠肢体缺血预处理(limb ischemic preconditioning，LIPC)对其肝脏缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)损伤的保护作用及可能的作用机制。方法 健康雄性SD大鼠50只，随机分为对照组(control，C)、假手术组(sham operation，SO)、缺血再灌注组(IR)、肝脏缺血预处理组(hepatic ischemic preconditioning，HIPC)、肢体缺血预处理组(limb ischemic preconditioning，LIPC)5组，分别检测ALT、AST水平；脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminaldeoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)检测肝组织凋亡细胞并计算凋亡指数(apoptosis index，AI)。结果IR组、HIPC组、LIPC组血清ALT、AST水平较C 组、SO组显著升高(P<005)。其中IR组转氨酶升高最明显，与HIPC组、LIPC组比较差异均有统计学意义(P<005)。而HIPC与LIPC两组比较差异无统计学意义(P>005)。凋亡细胞在SO组罕见，IR组、HIPC组和LIPC组都有明显增加。其中IR组凋亡指数增加最明显，与HIPC组、LIPC组比较差异均有统计学意义(P<005)。HIPC与LIPC两组比较差异无统计学意义(P>005)。结论 肢体缺血预处理与肝脏缺血预处理均可减轻肝脏缺血再灌注损伤，其保护作用机制与抑制肝细胞凋亡有关。

【关键词】缺血再灌注；预处理；肝脏；肢体；凋亡

【中图分类号】R3334

【文献标识码】B【文章编号】16748999(2013)12018802

缺血预处理(ischemic preconditioning，IPC)是组织或器官在经过1次或多次短暂缺血后，对随后长时间的缺血产生耐受的现象。随着缺血预处理研究的进一步深入，发现“远隔器官缺血预处理”现象，即通过对远离靶器官的组织或器官预先进行缺血预处理，同样能够减轻靶器官的缺血再灌注损伤。本研究预先对两组大鼠分别进行肝脏原位缺血预处理和肢体缺血预处理，随后对肝脏实施缺血再灌注，之后对比各组血清转氨酶变化，观察肢体缺血预处理这一远隔器官预处理方式对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用；通过计算肝细胞凋亡指数，初步探讨远隔器官缺血预处理的保护作用机制。

1材料与方法

11主要试剂 AST、ALT检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所；TUNEL检测试剂盒购于Roche公司。

12实验动物及分组清洁级雄性SD大鼠50只，体重200250g，由河北大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（冀）20081003。50只大鼠称重，编号，随机分为5组，每组10只：对照组(control，C)、假手术组(sham operation，SO)、缺血再灌注组(ischemia reperfusion，IR)、肝脏缺血预处理组(hepatic ischemic preconditioning，HIPC)、肢体缺血预处理组(limb ischemic preconditioning，LIPC)。

13动物模型的制备:5组大鼠术前12小时均禁食，可自由饮水。①C组：3%戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉（40mg/kg），经心脏采集血样待生化检测。②SO组：麻醉同C组，上腹正中开腹，向头侧牵开肝脏，暴露并游离肝十二指肠韧带，腹腔内注射庆大霉素1ml、生理盐水2ml，关腹。③IR组：麻醉、开腹、游离肝十二指肠韧带均同SO组，以血管夹夹闭肝十二指肠韧带，致肝缺血30min，然后松开血管夹恢复肝脏血流，腹腔内注射庆大霉素1ml、生理盐水2ml，关腹。④HIPC组：麻醉、开腹、游离肝十二指肠韧带均同SO组，以血管夹夹闭肝十二指肠韧带，致肝缺血10min，再松开血管夹恢复肝脏血流10min，如此反复3次。预处理后随即完成肝脏缺血再灌注，步骤与IR组同。⑤LIPC组：麻醉同SO组。两侧腹股沟区备皮、消毒、铺巾。切皮、游离两侧股动脉，以两枚血管夹同时夹闭两侧股动脉，致两侧后肢缺血10min，再松开血管夹恢复后肢血流10min，如此反复3次。预处理组后随即开腹行肝脏缺血再灌注，步骤与IR组同。

14标本的制SO组、IR组、HIPC组、LIPC组关腹6h后再次麻醉，经心脏采集血样置于70℃冰箱保存待生化检测；开腹取肝右叶切成约5mm×5mm×1mm的组织块置于4%多聚甲醛溶液中固定，待组织学检测。

15各项指标的测定756型分光光度计检测ALT、AST；TUNEL法染色，光镜下细胞核呈棕黄色染色为阳性凋亡细胞。每张切片随机检测10×500个细胞，计算每100个肝细胞中平均阳性细胞率，即为凋亡指数(apoptosis index，AI)。

16统计学处理各项指标测定结果用采用SPSS 160统计软件处理，计量资料以均数±标准差(±S)表示，多组间均数差异性比较用单因素方差分析(oneway ANOVA)，组内比较用LSDt检验，P＜005为差异有统计学意义。

2结果

21血清ALT、AST水平IR组、HIPC组、LIPC组血清ALT、AST水平与C组、SO组比较明显升高(P<005)。其中IR组升高最明显，ALT、AST水平分别为62828±12881 U/L、68720±6854 U/L，与HIPC组、LIPC组比较差异均有统计学意义(P<005)。HIPC组、LIPC组ALT水平分别为39552±3818U/L、43725±4841 U/L，AST水平分别为43175±4089U/L、48153±5817U/L，两组比较差异无统计学意义(P>005)（表1）。

表1各组大鼠血清ALT、AST水平(U/L)

3讨论

McClanahan于1993年研究中发现，兔经肾脏缺血预处理后能够减轻心脏缺血再灌注损伤，首次提出“远隔器官缺血预处理”这一概念［1］。目前研究远隔器官缺血预处理靶器官多集中在心、脑、肾［2］［3］［4］，而远隔器官缺血预处理对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用研究不多，具体机制也不甚明确。

本实验过程中先游离出大鼠两侧股动脉，然后用血管夹同时夹闭股动脉行肢体缺血预处理［5］。各组大鼠肝脏缺血再灌注后，测定血清ALT、AST水平可以反映肝细胞损伤程度。结果发现，HIPC组、LIPC组血清ALT、AST水平较C组、SO组明显升高，但却明显低于IR组，表明肝脏缺血预处理、肢体缺血预处理均可以减轻缺血再灌注损伤；TUNEL法检测肝脏凋亡细胞，HIPC组、LIPC组的凋亡指数明显高于SO组，但较IR组凋亡指数降低。HIPC组与LIPC组的凋亡指数比较差异无统计学意义，表明肝脏缺血预处理、肢体缺血预处理可以抑制缺血再灌注损伤诱导的细胞凋亡，从而减轻肝脏缺血再灌注损伤。

远位器官缺血预处理能够减轻靶器官缺血再灌注损伤，提示远隔器官缺血预处理后机体产生了某种内源性触发物质，从而介导了这一保护作用。触发物质是指在缺血预处理时机体释放的内源性活性物质，包括：一氧化氮、腺苷、缓激肽、活性氧族等。这些内源性活性物质通过血液循环到达靶器官，与相应的受体结合，通过信号转导启动效应蛋白的合成，效应蛋白包括热休克蛋白、超氧化物歧化酶、一氧化氮合酶等［6］。

综上所述，肢体缺血预处理与肝脏缺血预处理对肝脏的缺血再灌注损伤具有同样的保护作用。经典的原位缺血预处理在临床影响手术操作、延长手术时间，而肢体缺血预处理避免了原位缺血预处理的缺点，在实际操作中可行性更强。肢体缺血预处理的保护机制之一可能是通过抑制肝细胞凋亡来减轻缺血再灌注损伤，但其它的具体作用机制还有待深入研究。

论文作者:张冰1通讯作者谭莉莉2杨永丰1张建军1瞿海龙1田占发1

论文发表刊物:《中医学报》2013年12月第28卷供稿

论文发表时间:2014-3-26

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