王宇[1]2000年在《基质金属蛋白酶及其抑制因子基因表达调控在治疗肝纤维化中作用的实验研究》文中研究表明研究背景：肝纤维化作为各种致病因素所致肝硬化的共同病理基础和发生途径，其实质是间质胶原纤维等细胞外基质（ECM）合成与降解失衡，导致肝内ECM降解减少，沉积过度（以Ⅰ、Ⅲ型胶原为主）而形成的。肝内参与ECM降解的主要水解蛋白酶是基质金属蛋白酶类（MMPs），该酶系的生物活性主要受其特异性抑制物金属蛋自酶组织抑制因子（TIMPs）的调节。目前研究表明MMP1、MMP2及TIMP1与肝纤维化发展形成及逆转密切相关。现知干扰素α（IFNα）和汉防己甲素（Tet）对肝纤维化均有较好的疗效，可抑制肝内ECM的合成，并促进其降解，但其作用机制尚未完全清楚，与肝内MMPs及TIMPs表达的关系亦无研究报道。本课题拟对IFNα和Tet抗肝纤维化作用与MMP1、MMP2及TIMP1表达的关系进行研究。 目的：本实验旨在探讨IFNα及Tet在治疗肝纤维化过程中对MMP1、MMP2和TIMP1基因表达的调控和酶原蛋白表达的影响，进一步了解IFNα及Tet的作用机理，并阐明调控MMPs及TIMPs基因表达在肝纤维化治疗中所起的作用。 方法和结果： 1、建立CCL_4中毒性大鼠肝纤维化模型，在肝纤维化早中期（造模8周）分别以IFNα（用药6周）和Tet（用药12周）进行治疗，结果显示治疗后大鼠的肝细胞变性坏死程度和肝纤维化程度较对照组明显减轻，血清ALT亦降低，所形成的肝纤维化得以逆转。 2、采用逆转录PCR对治疗过程中肝内MMP1、MMP2和TIMP1 mRNA表达水平进行定量分析。结果显示与对照组相比IFNα可使MMP1基因表达逐渐增强，MMP2基因表达逐渐减低，而对TIMP1基因表达无显著影响；Tet则可抑制TIMP1基因表达，而对MMP1和MMP2基因表达无显著影响。 3、应用免疫组化和Western blot方法对治疗过程中MMP1、MMP2及TIMP1蛋白水平进行检测和定量。免疫组化显示MMP1、MMP2和TIMP1在正常和纤维化肝组织中均有阳性着色，肝纤维化形成后及逆转过程中阳性着色主要集中于纤维板及汇管区内，且三者来源定位基本一致。Westernblot定量分析结果显示治疗过程中三者变化情况与RT-PCR检测的基因表达变化趋势相一致。 结论：IFN a及 Tet对早中期肝纤维化均有较好疗效。IPN a通过上调MMPI的基因表达，使MMPI的酶原合成增加，可促进1、Ill型胶原为主的间质胶原的降解；同时通过抑制MMPZ的基因表达，使MMPZ对其主要底物IV胶原基底膜降解破坏减少，Disse fd隙内皮下胶原纤维沉积作用减弱，从而起到抗肝纤维化作用。而Tet虽然对MMPI、MMPZ基因表达无直接显著影响，但通过降低TIMPI的基因表达，可使其对MMPI的活性抑制作用减弱，MMPI对间质胶原的降解作用相对加强，使肝纤维化得以逆转。因此，通过调控MMPS及TIMPS的基因表达，干预肝内ECM的降解可能是治疗肝纤维化的有效途径。
刘飞[2]2007年在《化纤胶囊对肝纤维化大鼠防治作用的研究》文中认为目的：本研究旨在探讨和揭示肝纤维化的某些发病机理，观察化纤胶囊对肝纤维化的预防和治疗作用。方法：采用改良复合因素法复制肝纤维化大鼠模型，实验动物随机分为空白对照组、模型对照组、秋水仙碱组、化纤胶囊低剂量组、化纤胶囊高剂量组5组。造模各组分别以生理盐水、秋水仙碱悬液、低剂量化纤悬液、高剂量化纤悬液进行干预，测定各组大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸转移酶(AST)、总胆汁酸(TBA)以及层粘蛋白(LN)、透明质酸(HA)、Ⅲ型前胶原氨端肽(PⅢNP)的含量，同时经HE染色后光镜下观察各组大鼠肝组织形态结构的变化。结果：与空白组比较，模型组大鼠血清中ALT、AST、TBA以及LN、HA、PⅢNP的含量均显著升高(P＜0.01)，且肝组织形态结构改变最显著；与模型组比较，秋水仙碱组、化纤低、高剂量组血清中ALT、AST、TBA以及LN、HA、PⅢNP的含量均显著降低(P＜0.05或P＜0.01)；与秋水仙碱组比较，化纤低剂量组血清中LN的含量降低更为显著(P＜0.05)；各治疗组其余各项指标间差异无统计学意义(P＞0.05)。秋水仙碱组、化纤低、高剂量组肝组织病变均有不同程度改善，而以化纤低剂量组最为显著。结论：化纤胶囊能显著降低血清中ALT、AST、TBA的含量，表明化纤胶囊有一定程度的保肝降酶的作用；化纤胶囊能显著降低血清LN、PⅢNP、HA的含量，表明化纤胶囊具有改善机体胶原代谢，降低细胞外基质合成和(或)促进细胞外基质降解的作用；化纤胶囊有一定程度的减轻肝细胞变性、坏死，减少肝组织胶原纤维增生，重塑肝组织超微结构的作用，表明化纤胶囊能改善肝纤维化大鼠肝组织损伤程度，对肝纤维化具有一定的防治作用。化纤胶囊与秋水仙碱相比较，其疗效在部分指标上优于秋水仙碱。化纤胶囊低剂量组与高剂量组相比较，低剂量组改善肝纤维化大鼠肝组织损伤程度更显著，表明抗肝纤维化中药治疗用药与病变修复程度具有量效关系，合理剂量用药对已损伤肝功能的恢复具有重要的价值，并已从实验角度证明了肝病治疗用药宜轻清，避免过量伤正以及审因度势、辩证施治、驱邪以扶正的理论价值。
付德才[3]2008年在《甲珠防治肝纤维化基础及临床研究》文中研究说明肝纤维化是各种病因所致慢性肝病的共同病理过程,也是肝硬化发生的前奏和必经中间环节。其可逆性为临床防治肝硬化提供了良好契机,防治和逆转肝纤维化是延缓或阻止肝硬化发生的重要手段,为肝病患者延长寿命、提高生命质量提供了可能,是治疗各种慢性肝炎的远期目标。肝纤维化的防治和逆转已成为该领域国内外同行的研究热点。目前的研究认为,肝纤维化的病理改变是细胞外基质(ECM)的增生和降解失衡所致,近年来研究显示许多中医方药对肝纤维化有很好的治疗效果,并已展示良好的应用前景。从祖国医学辩证,认为肝纤维化是由于气滞、血瘀、络阻所致,肝纤维化初期主要为气滞,进而血瘀,最后络阻,气机不畅,肝纤维化、肝硬化形成。甲珠为穿山甲的鳞片,主归肝经,具有软坚、通络、散结的功效,是历代医家治疗癥、瘕、集、聚的常用药,近来,被广泛用治肝硬化取得了较好的临床效果。本实验利用CCl4建立急性肝损伤和慢性肝纤维化的实验鼠动物模型,造模两周后采用中药甲珠不同剂量灌胃,干预肝纤维化的形成,观察实验效果,探讨其抗肝纤维化的机制,结果发现甲珠通过提高机体对自由基的清除能力,保护肝细胞,改善肝功能,减少肝纤维化发生发展的始动因素,对治疗组各肝纤维化指标有明显改善;通过临床病例治疗观察,进一步证实甲珠对肝纤维化的有一定的防治作用。为临床甲珠抗肝纤维化提供了理论基础。
林家禾[4]2009年在《白藜芦醇对大鼠肝纤维化的防治及相关机制的研究》文中进行了进一步梳理肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)是多种慢性肝病发展的共同病理基础,是肝脏纤维组织的过度沉积,其中心环节是静止期肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的活化和向肌成纤维样细胞和成纤维细胞的转化,导致大量细胞外基质的合成,另一方而细胞外基质的降解减少导致其合成与降解的不平衡促进了肝纤维化形成。近年来的研究认为,氧化应激及活性氧在HSC活化和肝纤维化形成过程中起着重要的作用。因此,清除氧自由基、抑制脂质过氧化成为抗肝纤维化的一个重要靶点。在我国,肝纤维化、肝硬化大多数与病毒性肝炎有关,往往是由于慢性病毒性肝炎迁延变化而成的,针对慢性肝炎肝纤维化的病理特征,本文拟在以前工作的基础上,采用猪血清诱导的肝纤维化模型,从病理观察、血清生化指标等进一步阐明白藜芦醇抗肝纤维化的有效性;并拟采体外培养表型活化的肝星状细胞HSC-T6建立细胞模型,采用分子生物学方法(Real Time-PCR技术)、从细胞凋亡、H_2O_2诱导HSC脂质过氧化等方面对白藜芦醇抗肝纤维化的作用机理进行研究,为白藜芦醇的进一步推广与开发应用提供实验依据。1.通过对猪血清诱导的肝纤维化大鼠模型,观察白藜芦醇大鼠肝组织形态学的影响及肝组织HA、LN、C-Ⅳ、PⅢNP及HyP的影响。结果显示:(1)白藜芦醇高剂量组和中剂量组明显改善,汇管区纤维结缔组织显著减少;而模型组大鼠肝组织小叶内、小叶间有炎性细胞浸润;汇管区因纤维结缔组织增生而扩大明显。白藜芦醇可显著改善大鼠肝纤维化,预防组和治疗组中白藜芦醇干预的大鼠肝纤维化分级程度与各自模型组相比明显减轻护(P＜0.01)。(2)白藜芦醇30mg/kg、15mg/kg腹腔注射可显著降低大鼠血清ALT、AST、ALP水平,提高A/G比值(P＜0.01)。(3)白藜芦醇30gm/kg、15mg/kg腹腔注射可显著降低肝纤维化大鼠血清HA、LN、PⅢNP、C-Ⅳ水平(P＜0.01)。(4)与模型组相比,在大鼠肝纤维化形成过程中和肝纤维化形成后灌胃给药白藜芦醇30mg/kg、15mg/kg、7.5mg/kg可下调TGF-β_1、TIMP-1表达(P＜0.01)。2.通过对猪血清诱导的肝纤维化大鼠模型,制备大鼠肝脏组织匀浆,分别检测过氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、羟脯氨酸(Hyp)的含量。猪血清诱导的肝纤维化模型大鼠肝组织脂质过氧化指标MDA含量升高,SOD含量下降(与正常组比较P＜0.01),白藜芦醇大剂量和中剂量均能够降低MDA含量,升高SOD含量(与模型组比较P＜0.05,P＜0.01);模型组大鼠肝组织Hyp含量明显升高(与正常组比较P＜0.01),白藜芦醇大剂量组和中剂量组能够明显降低Hyp含量(与模型组比较P＜0.01,P＜0.05)。3.观察大鼠Fas/FasL、TNF-α凋亡基因mRNA的表达与白藜芦醇的干预作用。结果显示:白藜芦醇可明显上调大鼠肝组织及体外培养HSC Fas/FasL基因mRNA的表达,体内体外实验中其上调作用均优于阳性对照药。认为白藜芦醇通过调节Fas/FasL系统诱导活化的HSC凋亡,从而逆转肝纤维化。4.观察白藜芦醇对肝星状细胞(HSC-T6)抑制增殖及基质金属蛋白酶抑制因子mRNA(TIMP-1mRNA)表达的影响,探讨白藜芦醇高、中、低剂量组抗肝纤维化效果和作用。体外培养HSC-T6,随机分为4组:对照组、白藜芦醇高剂量组、中剂量组和小剂量组。加药后用MTT法检测各组HSC-T6增殖变化,且采用RT-PCR方法测定各组HSC-T6的TIMP-1mRNA的表达。结果显示:白藜芦醇各组药对HSC-T6的增殖有明显的抑制作用,且作用效果较稳定。TIMP-1mRNA表达对照组明显TIMP-1mRNA/GAPDH(0.936±0.01,P＜0.01)高于30mg组(0.646±0.007,P＜0.01)、15mg(0.765±0.02,P＜0.01)、7.5mg(0.718±0.04,P＜0.01)组。正常对照组、高剂量组、中剂量组和低剂量组相比,各药物组明显低于正常对照组。证实了白藜芦醇可通过抑制TIMP-Ⅰ的这一作用来发挥其抗肝纤维化作用,并且作用较明显。5.采用Ⅳ型胶原酶灌流法分离大鼠肝细胞进行原代培养,用H_2O_2体外诱导肝细胞损伤,MTT法检测细胞存活和增殖活性。实验表明,H_2O_2损伤导致肝酶变化,如反映肝细胞损伤的AST,ALT均明显升高。在H_2O_2损伤的肝细胞中加入白藜芦醇后,随白藜芦醇剂量加大,细胞培养上清中的肝酶活性进行性降低,提示白藜芦醇能减轻肝细胞损伤,减少ALT与AST的释放(P＜0.01)。在H_2O_2损伤的肝细胞中加入白藜芦醇后,白藜芦醇能明显降低肝细胞内的MDA含量,同时也可提高GSH的含量,提示白藜芦醇能有效对抗H_2O_2引起脂质过氧化作用,减少脂质过氧化物的形成。提示白藜芦醇对H_2O_2诱导肝细胞损伤有直接保护作用。6.用H_2O_2诱导HSC脂质过氧化,白藜芦醇(0.125～1mg·m~(-1))可明显降低培养上清液中MDA含量和Ⅰ型胶原水平,与空白对照组比较,模型组HSC增殖明显升高;与模型对照组比较,白藜芦醇各剂量组不同程度降低HSC的增殖,呈明显剂量效应关系(P＜0.01)。模型组MDA水平明显升高,而SOD活力显著降低。给予白藜芦醇后,MDA水平明显降低,SOD活力明显升高,且呈明显剂量效应关系(P＜0.01)。提示白藜芦醇对HSC的增殖及Ⅰ型胶原的介成具有抑制作用,该作用可能与其抗氧化作用有关。本文利用猪血清诱导的大鼠肝纤维化模型,从血清肝纤指标、肝脏HyP含量及肝脏组织形态改变对白藜芦醇治疗实验性肝纤维化的作用进行了评价,证实白藜芦醇对猪血清诱导的大鼠实验性肝纤维化具有明显的预防和治疗作用;其作用机制与拮抗细胞因子TGF-β_1、抑制TIMP-1表达增高,从而促进胶原降解;抑制肝星状细胞活化并促进活化的肝星状细胞凋亡相关。体外实验以HSC-T6细胞作为模型,用MTT法检测了白藜芦醇对HSC-T6增殖的影响,进一步证实白藜芦醇具有抑制HSC增殖和活化的作用。从体内、体外探讨了白藜芦醇对HSC凋亡的诱导作用及其凋亡的途径,表明白藜芦醇可通过Fas/FasL系统介导的HSC凋亡发挥治疗肝纤维化的作用。体外实验以HSC--T6细胞作为研究平台,探讨白藜芦醇对H_2O_2诱导HSC脂质过氧化,证实白藜芦醇可能通过抑制脂质过氧化从而抑制HSC的活化、增殖和细胞外基质(ECM)的生成,起到抗肝纤维化的作用。
黄碧松[5]2008年在《加味大黄蛰虫丸治疗实验性肝纤维化的作用及机制研究》文中指出肝纤维化(Hepatic fibrosis)是由多种病因导致的慢性肝病的共同病理学改变,是各种慢性肝病向肝硬化甚至肝癌发展的主要病理基础,其致病因素以乙型肝炎病毒和酒精为主,但在不同地区有一定差异。我国是慢性肝病的高发区域,其发病以慢性乙型肝炎所致排在首位。据世界卫生组织统计,全球目前有3.5亿慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染者,其中约75%分布在亚太地区,我国是HBV感染率较高的地区之一据不完全统计,HBV感染者已达1.2亿人左右,人群乙型肝炎表面抗原(HBsAg)检出率高达9.75%,而西欧各国以酒精为肝纤维化的主要原因,在我国随着人民生活水平的提高,酒精性肝纤维化也呈上升的趋势。据最近统计资料显示,我国目前有肝病患2000多万,肝纤维化在我国的发病率较高,是我国人民必须严肃对待的一个健康问题。因此,寻找防治肝纤维化的有效方法和有效药物,是我国人民的迫切要求,具有深远的意义和重大的社会价值。肝纤维化是肝脏受到慢性损伤时的一个愈合修复过程,又是所有慢性肝病进展成肝硬化的共同病理基础。有效的治疗肝纤维化可以防止各种慢性肝病向肝硬化发展。近年来,国内外在对肝纤维化启动和进展机制的研究方面取得了一定进展。但是在肝纤维化临床治疗领域,并没有取得明显的进步。当前,临床虽然已有一些治疗肝纤维化的中西药物,但疗效还不够理想,而且有些药物副作用较大,费用较高。所以国内外的研究者都在努力寻找疗效确切、价格低廉、毒副作用小的防治肝纤维化药物,以便能阻止和逆转肝纤维化的进程,最终治愈大多数慢性肝病。在我国,肝纤维化、肝硬化大多数与病毒性肝炎有关,往往是由于慢性病毒性肝炎迁延变化而成的,针对慢性肝炎肝纤维化的病理特征,本文拟在以前工作的基础上,采用DMN诱导的肝纤维化模型,从病理观察、血清生化指标等进一步阐明自拟加味大黄蜇虫丸抗肝纤维化的有效性:并拟采用免疫组化、细胞培养技术、流式细胞术、分子生物学方法(RealTime-PCR技术)从细胞凋亡、纤溶系统两方面对该方抗肝纤维化的作用机理进行研究,为该方的进一步推广与开发应用提供实验依据。1.通过对DMN肝纤维化大鼠模型,观察加味大黄蜇虫丸肝组织肝HA、LN、IVC、PCIINP及HyP的影响。结果显示:模型组及各给药组血清HA、LN、IVC、PCIII及HyP的水平均升高,与正常组比较,有显著性差异(P＜0.01)。复方水提大、小剂量组与模型组比较,血清HA、PCIII、LN、CIV及HyP水平均明显下降(P＜0.05或0.01),且大剂量组优于小剂量组;醇提大剂量组与模型组比较,血清LN、IVC、PCIII及HyP的水平有一定程度下降,但无显著意义(P＞0.05)。醇提小剂量组与模型组比较,血清PCIII、CIV、HyP水平有下降,但无显著意义(P＞0.05)。鳖甲软肝片组血清HA、PCIII、LN、CIV水平较模型组无显著差异(P＞0.05)。2.通过对DMN肝纤维化大鼠模型,观察加味大黄蜇虫丸对DMN肝纤维化大鼠肝组织形态学的影响:(1)HE染色;(2)α-SMA免疫组化;(3)Ⅰ型胶原免疫组化。本实验表明,从肝小叶破坏、假小叶形成、胶原纤维增生等肝脏结构的客观改变出发,认为大黄蛰虫丸可减轻肝纤维化的程度,改善肝脏结构,促进ECM降解,从而治疗实验性肝纤维化。3.观察加味大黄蜇虫丸对HSC-T6体外生长的抑制作用,复方的TC_(50)是42.15mg,丹参的TC_(50)是1∶10的稀释浓度。(1)TIMP-1、MMP-2、MMP-13mRNA表达(2)提取细胞RNA。培养细胞经药物作用24h后,按Trizol一步法提取细胞RNA,用荧光定量PCR检测HSC-T6细胞TIMP-1、MMP-2、MMP-13mRNA的表达情况本实验表明,加味大黄蛰虫丸可以有效减轻肝细胞炎症,改善并减轻肝纤维化程度,结合本实验数据证实,加味大黄蛰虫丸可通过调节uPA纤溶系统,间接调节ECM降解,促进ECM在肝内沉积,从而治疗肝纤维化。4.观察大鼠Fas/FasL、TNF-α凋亡基因mRNA的表达与加味大黄蜇虫丸的干预作用。结果显示:加味大黄蛰虫丸可明显上调大鼠肝组织及体外培养HSC Fas/FasL基因mRNA的表达,体内体外实验中其上调作用均优于阳性对照药。认为加味大黄蛰虫丸通过调节Fas/FasL系统诱导活化的HSC凋亡,从而逆转肝纤维化。5.观察体外培养的HSC Fas/FasL、TNF-α凋亡基因mRNA的表达与加味大黄蜇虫丸的干预作用。对HSC-T6细胞凋亡的影响。实验方法:Annexin V/PI双染结合流式细胞仪分析:实验结果:在双变量流式细胞仪的散点图上,左下象限显示活细胞,为(FITC-/PI-),右上象限是非活细胞,即坏死细胞,为(FITC+/PI+);而右下象限为凋亡细胞,呈现(FITC+/PI-)。结果显示:加味大黄蛰虫丸和丹参注射液均可诱导HSC凋亡,其中加味大黄蛰虫丸30mg/ml剂量组较15mg/ml剂量组细胞凋亡明显;加味大黄蛰虫丸各剂量组诱导细胞凋亡的能力优于丹参注射液组。提示诱导HSC凋亡可能是加味大黄蛰虫丸发挥抗纤维化作用的机制之一。6.观察纤溶系统与加味大黄蜇虫丸抗肝纤维化的关系。结果:(1)各组大鼠肝组织uPA、PAI-1免疫组化图片:在正常对照组肝组织,uPA、PAI-1未见阳性表达。模型对照组肝组织,uPA主要分布于假小叶以及增生的纤维隔内,PAI-1在肝纤维化活跃的汇管区、肝细胞变性坏死处有明显阳性染色。加味大黄蛰虫丸可以有效减轻肝细胞炎症,改善并减轻肝纤维化程度,结合本实验数据证实,加味大黄蛰虫丸可通过调节uPA纤溶系统,间接调节ECM降解,促进ECM在肝内沉积,从而治疗肝纤维化。(2)HSC uPA、PAI-1、TIMP-1及MMP-13 mRNA相对表达量:与细胞对照组比较,丹参注射液各浓度组及加味大黄蛰虫丸大、小剂量组均可调节uPA、PAI-1、TIMP-1及MMP-13mRNA的表达。加味大黄蛰虫丸30mg/ml剂量组对上述基因的表达调节优于其它各组。认为加味大黄蛰虫丸可通过调节uPA纤溶途径,间接调节MMPs的活性,促进ECM降解,逆转肝纤维化。本文利用DMN诱导的大鼠肝纤维化模型,从血清肝纤指标、肝脏HyP含量及肝脏组织形态改变3个层面对加味大黄蛰虫丸治疗实验性肝纤维化的作用进行了评价,证实该方可以逆转DMN所致的大鼠肝纤维化。体外实验以HSC-T6细胞作为模型,用MTT法检测了大黄蛰虫丸对HSC-T6增殖的影响,进一步证实加味大黄蛰虫丸具有抑制HSC增殖和活化的作用。从体内、体外探讨了加味大黄蛰虫丸对HSC凋亡的诱导作用及其凋亡的途径,表明加味大黄蛰虫丸可通过Fas/FasL系统介导的HSC凋亡发挥治疗肝纤维化的作用。体外实验以HSC-T6细胞作为研究平台,探讨加味大黄蛰虫丸对uPA纤溶途径的调节作用,证实加味大黄蛰虫丸可通过上调uPA和MMPs活性,促进ECM降解,逆转肝纤维化。
宣佶[6]2018年在《化肝通络方改善肝纤维化的临床研究和Th17细胞分化介导的机制研究》文中研究指明研究目的:本研究首先通过临床研究,评价了化肝通络方(Huagantongluofang,HGTLF)治疗乙肝肝纤维化的临床疗效;随后制备肝纤维化动物模型,探讨化肝通络方干预肝纤维化模型的影响及可能的作用机制,并研究肝纤维化中Thl7细胞分化的潜在调控机理。研究方法:1.化肝通络方对肝纤维化患者临床疗效研究60例慢性乙型肝炎(CHB)患者,随机分为2组:化肝通络方联合ETV治疗组患者利用化肝通络方联合恩替卡韦(entecavir,ETV)治疗,对照组患者仅接受ETV治疗。观察6月,比较治疗前后中医证候积分、血清肝功能指标、血清肝纤维化指标变化情况。2.化肝通络方干预胆汁淤积性肝纤维化动物模型的评价和机制研究将72只SD大鼠随机分为5组,包括:HGTLF高剂量组、HGTLF中剂量组、HGTLF低剂量组、熊去氧胆酸(UDCA)和假手术。采用结扎胆总管方法制备肝纤维化大鼠模型,在造模成功后,药物干预4周后采集血清及肝组织。采用生化方法测定大鼠肝功能、常规病理、ELISA测定血清基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)表达,RT-PCR测肝星状细胞(Hepatic stellate cell,HSC)、转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)、NF-κB、血小板衍生生长因子(Platelet-derived growth factor,PDGF)、p38、细胞间粘附分子-1(Intercellular adhesion molecular-1,ICAM-1)和金属蛋白酶组织抑制剂(Tissue inhibitors of metalloproteinase-l,TIMP-1),流式分析测各组大鼠Th17细胞比例。3.探索肝纤维化模型Th17细胞分化的调控机制3.1健康雄性C57BL/6小鼠,腹腔注射10%CCL4橄榄油溶液建立肝纤维化模型,对照组给予等量橄榄油,10周后处死小鼠。测小鼠血清中谷丙转氨酶(Alanine Transaminae,ALT)和天冬氨酸转氨酶(Aspartate transaminase,AST);分离小鼠肝组织中浸润的CD4+T细胞,流式检测CD4+T细胞中的Th17细胞(CD4+IL-17A+)比例;ELISA测血清IL-17A和 IL-22 含量;Real-time PCR 测 IL-17A 和 IL-22 的表达。3.2取材模型小鼠和对照组小鼠的肝脏组织,利用real-time PCR检测miR-29a、miR-652和ARRB1 mRNA的表达;Western blot检测ARRB1的蛋白表达。3.3分离正常小鼠脾脏中的CD4+ T细胞,转染pre-NC或miR-29a mimic或miR-652 mimic后,经活化培养后,再在诱导Th17细胞生成的培养基中培养。流式检测过表达miR-29a或miR-652对Th17细胞比例的影响;ELISA试剂盒检测过表达miR-29a mimic或miR-652 mimic 对 IL-17A 和 IL-22 含量的影响;real-time PCR 检测过表达 miR-29a mimic或 miR-652 mimic 对 IL-17A、IL-22 mRNA 和 ARRB1 mRNA 水平的影响;Westernblot 检测过表达miR-29a mimic或miR-652 mimic对ARRB1蛋白水平的影响。3.3分离正常小鼠脾脏中的CD4+ T细胞,转染相应载体后分组,(miR-29a mimic、miR-652 mimic 组、miR-29ainhibitor、miR-29amimic+ARRB1 mimic 共转染组,经活化培养后,再在诱导Th17细胞生成的培养基中培养。流式检测各组Th17细胞比例;ELISA、real-time PCR测各组IL-17A和IL-22含量的表达;Western blot检测ARRB1蛋白水平的影响。3.4培养HEK293T细胞,采用双荧光素酶报告基因法验证miR-29a/miR-652与ARRB1的关系。分离培养正常小鼠脾脏来源的CD4+ T细胞,转染miR-29a mimic/miR-652 mimic/miR-29a mimic+ miR-652 mimic,观察 ARRB1 的表达;CD4+ T 细胞转染 miR-29a inhibitor/miR-652 inhibitor/miR-29a inhibitor+miR-652 inhibitor,观察 ARRB1 的表达情况。3.5分离正常小鼠脾脏中的CD4+T细胞,转染相应载体后,经活化培养,再在诱导Th17细胞生成的培养基中培养3天。观察细胞共转染miR-29a mimic或miR-652 mimic和pcDNA-ARRB1对IL-17A和IL-22的含量和表达的影响。3.6健康雄性C57BL/6小鼠腹腔注射CCL4,8周后,分3组:对照组,Ad-miR-29a组,Ad-miR-652组(构建miR-29a或miR-652过表达的腺病毒载体),采取尾静脉注射方式给药,每周两次,共延续10周。测ALT和AST含量;流式检测Th17细胞比例;real-time PCR 和 western blot 检测 ARRB1 表达。研究结果:1.化肝通络方对肝纤维化患者临床疗效研究两组慢性乙肝(CHB)患者治疗前后比较结果显示,与对照组相比,化肝通络方联合ETV治疗组能明显改善患者临床症状:右胁疼痛、口干、口苦、腹胀、纳呆、尿黄、便秘、面色晦暗、唇紫、舌紫暗、苔黄腻等;改善部分肝功能指标:ALT、AST、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)以及谷氨酰转移酶(Gamma-glutamyltransferase,GGT)及部分肝纤维化指标:透明质酸(Hyaluronic acid,HA)、Ⅳ 型胶原(Ⅳ collagen,IVC)、胶原肽 Ⅲ(Peptide collagenⅢ,PCⅢ),差异具有统计学意义(P<0.05)。2.化肝通络方干预胆汁淤积性肝纤维化动物模型的评价和机制研究2.1与模型组比,化肝通络方药物干预各组肝功能水平均下降(P<0.05),与UDCA组相比,差异有统计学意义(P<0.05);药物干预各组肝脏组织炎性细胞浸润减少。2.2与模型组比较,化肝通络方药物组各项肝纤维化化相关因子TGF-β1、NF-κB、PDGF、p38、ICAM-1、TIMP-1 有明显下降(P<0.05);2.3与模型组比较,化肝通络方药物组TH17分化比例明显下降,高剂量组更显著。3.探索肝纤维化模型Th17细胞分化的调控机制3.1与对照组相比,模型组小鼠血清中ALT和AST明显升高(P<0.05),流式检测CD4+T细胞中的Th17细胞比例明显升高(P<0.05);ELISA、real-time PCR测血清IL-17A、IL-22显著降低(P<0.05)。3.2与对照组相比,模型组肝脏组织中miR-29a和miR-652低表达,ARRB1显著升高(P<0.05)。3.3 CD4+T细胞共转染miR-29a mimic或miR-652 mimic后,显著降低Th17细胞比例(P<0.05);ELISA、Rt-PCR检测提示IL-17A和IL-22的含量和表达显著降低(P<0.05);Rt-PCR和 Western blot 检测显示抑制 ARRB1 mRNA 水平(P<0.05)。3.4培养HEK293T细胞,双荧光素酶报告基因法验证,和对照组相比,miR-29a mimic/miR-652 mimic 抑制 ARRB1 荧光素酶活性,而 miR-29a inhibitor/miR-652 inhibitor促进 ARRB1 荧光素酶活性;CD4+ T 细胞转染 miR-29a inhibitor 或 miR-652 inhibitor 或miR-29a inhibitor+ miR-652 inhibitor,与对照组相比,Rt-PCR 和 Western blot 检测显示ARRB1 mRNA水平明显增加(P<0.05)。3.5过表达miR-29a或miR-652显著降低IL-17A、IL-22的含量,同时过表达ARRB1逆转了 miR-29a 或 miR-652 过表达对 1L-17A、IL-22 的影响(P<0.05)。3.6肝纤维化模型注射miR-29a或miR-652过表达的腺病毒载体,与对照组相比,ALT和 AST 含量、Th17 细胞比例显著抑制(P<0.05);real-time PCR 和 western blot 检测 ARRB1表达显著降低(P<0.05)。研究结论:1.化肝通络方对肝纤维化患者临床疗效研究化肝通络方联合ETV与单用ETV治疗乙肝肝纤维化湿热瘀毒证患者,两组均能明显改善患者临床证候,降低患者肝功能指标、肝纤维化水平。其中化肝通络方联合ETV治疗组在改善患者证候,部分肝功能指标(ALT、AST、ALP、GGT)及部分肝纤维化指标(HA、IVC),较单用ETV组有优势。2.化肝通络方干预胆汁淤积性肝纤维化动物模型的评价和机制研究化肝通络方能剂量依赖地降低肝脏损伤,改善肝纤维化。其抗肝纤维化机制可能是通过抗炎和抑制肝星状细胞活化而减少肝细胞损伤,其中TGF-β1、NF-κB、PDGF、p38参与其逆转肝纤维化过程。同时,TH17细胞分化在化肝通络方治疗肝纤维化中起到了重要作用。3.探索肝纤维化动物模型Th17细胞分化的调控机制CCL4诱导的肝纤维化显着增加了 Th17细胞的百分比,IL-17A、IL-22的水平以及ALT和AST的表达;此外,miR-29a/miR-652过表达显着降低ALT、AST指标、Th17分化以及ARRB1的表达,表明过表达miR-29a/miR-652对肝纤维化的保护作用。因此,miR-29a和miR-652通过阻遏ARRB1介导的Th17细胞分化改善肝纤维化进展。
郭敏[7]2011年在《化浊解毒中药血清及补骨脂素对肝星状细胞生物活性的影响》文中进行了进一步梳理肝纤维化是以结节形成和肝脏收缩为特征,是肝脏疾病末期的所有并发症包括门脉高压、腹水、肝性脑病、合成及代谢功能障碍的基础,因此肝纤维化既损伤肝细胞的功能又能增加门静脉压力。几乎在所有的慢性肝损伤的病人中都会产生纤维化,最终形成肝硬化甚至肝癌,严重影响人的生命。目前一般认为肝纤维化发生的原理为:肝纤维化是肝脏发生慢性非自限性损伤之后的一个创伤修复反应;激活的肝星状细胞是肝纤维化形成最主要的细胞。肝纤维化最主要的事件是肝星状细胞的活化,肝星状细胞是正常和纤维化肝脏细胞外基质的基本来源,是肝细胞和窦内皮细胞之间的内皮下间隙非游走的窦旁细胞,是体内储存视黄醛衍生物的首要部位,在星状细胞被激活的过程中,静止的富含维生素A的细胞转化为高度致纤维化的细胞,其形态特征为粗面内质网增大、维生素A颗粒减少、核膜皱缩,出现可收缩性的纤维丝及细胞增殖。被激活的肝星状细胞造成肝纤维化的最直接的方式就是增加细胞外基质的形成。细胞外基质是指一系列参与构成正常肝和纤维化肝间质框架的大分子,包括几个结构和支撑分子家族:胶原、非胶原糖蛋白、基质结合生长因子、黏多糖、蛋白多糖和基质细胞蛋白。细胞外基质是细胞功能的动态调节器,纤维化肝脏的基质成分在性质和含量上均有别于正常肝脏,其胶原总含量增加了3~10倍,在肝损伤区域内首先出现的基质改变是细胞纤连蛋白的增加,这些变化导致肝星状细胞的激活和纤维化速度的增加。而激活后的肝星状细胞表达针对胶原和层粘连蛋白的整合素受体则又有助于基质成分的沉积。最终导致细胞外基质合成增加,降解减少,造成细胞外基质的过度沉积。研究表明纤维化在多种疾病中可以被逆转,如酒精性肝病随着戒酒,其肝纤维化可被显著逆转;乙肝患者在应用抗病毒药拉米夫定之后肝纤维化程度也显著改善;丙肝患者应用干扰素和利巴韦林之后肝纤维化有短期的退化或肝纤维化进展减缓。目前肝纤维化的治疗主要集中在(1)治愈原发疾病如清除慢性病毒性感染;戒酒和停用有毒性的药物;去除过剩的铁和铜;解除胆道梗阻等。(2)减轻炎症和免疫反应。(3)抑制星状细胞的活化包括能够抑制星状细胞增殖、促进星状细胞凋亡、抑制胶原等细胞外基质的合成;增加细胞外基质的降解,起到抗纤维形成的作用。现在研究多将肝星状细胞作为治疗肝纤维化的靶点。治疗上多用抗氧化剂如生育酚、水飞蓟素等,可以经保护肝细胞和抑制库普弗细胞功能的双重作用减少肝损伤。另一类为抑制细胞外基质产生的物质,主要是通过直接阻断基质合成和处理或间接抑制转化生子因子(TGF-β)的活性而实现,由于中和转化生长因子能够取得加速基质降解和抑制基质产生的双重效果,所以转化生长因子拮抗剂也是目前的热点,如松弛肽等。PPAR-γ在星状细胞内有表达,其配体可以下调星状细胞的活性,在活化的肝星状细胞中PPAR-γ表达显著减少。上调PPAR-γ表达能够使肝星状细胞从激活态转为静止态,从而抑制肝星状细胞活性。所以本实验将肝星状细胞及TGF-β和PPAR-γ作为靶点观察化浊解毒方的作用机制。中医多将肝纤维化、肝硬化归为“癥积”“臌胀”“积聚”等范畴。历代医家多认为是由气血瘀滞造成,多用活血化瘀、软肝散结之品治疗,虽能取效,但是也仅能治标而不治本。经过多年的临床实践,导师李佃贵教授认为浊毒在肝纤维化形成中起着关键作用。浊毒内蕴可以影响肝的疏泄功能,导致气机郁滞,血不归藏,变生诸症,日久正虚,浊毒与虚共同致病。故治疗上固本与驱邪不可偏废,以化浊解毒为大法,兼补益肝肾,经多年临床验证化浊解毒方在临床应用中取得良好的效果,但是对其作用机制尚不明确,本实验从细胞水平观察化浊解毒中药血清对肝星状细胞的作用,从而探讨其作用机制。在治疗肝纤维化的中药复方中除了大剂量的应用化浊解毒、软肝散结、活血化瘀之品外,根据中医的辨证论治的原则我们会选择性的应用一些补益肝肾的药物其中较常用的是补骨脂,其主要成分是补骨脂素,结合现代研究,在治疗肝纤维化中的天然黄酮类药物的应用如水飞蓟素,姜黄素等能够通过抑制肝星状细胞的增殖和分化及细胞外基质的合成而阻止肝纤维化的发生和肝硬化的形成。在以往的研究中发现补骨脂素也有很多与姜黄素相似的作用,我们推测属于香豆素类化合物补骨脂素有可能也具有类似的防治肝纤维化作用,所以本实验观察补骨脂素对肝星状细胞增殖及氧化应激的作用,从而观察其在肝纤维化治疗中的作用机理。进而研究化浊毒与抗氧化应激之间是否存在一定联系。本研究将分五部分来探讨化浊解毒中药血清及补骨脂素对肝星状细胞生物活性的影响。第一部分化浊解毒中药血清对体外活化肝星状细胞增殖及凋亡的影响目的:化浊解毒方是临床上治疗肝纤维化的验方,但对其作用机理缺乏研究。本研究通过观察化浊解毒中药血清对体外培养的活化肝星状细胞增殖与凋亡的影响,探讨化浊解毒方治疗肝纤维化的作用机制。方法:选择健康的SD大鼠,制备含药血清,分为干扰素组(阳性对照组),化浊解毒方大、中、小剂量组及空白对照组。体外培养活化的肝星状细胞,加入各含药血清进行培养24小时、48小时、72小时,利用MTT法观察化浊解毒中药血清对肝星状细胞增殖的影响;培养48小时后运用流式细胞仪分析各组肝星状细胞的凋亡情况。结果:肝星状细胞在不同浓度化浊解毒中药血清培养基中培养24h,与空白对照组比较,大剂量组(0.216±0.051)和阳性对照组(0.232±0.029)有抑制肝星状细胞增殖的作用(P<0.05);培养48 h后,化浊解毒中药血清各剂量组均有抑制肝星状细胞增殖的作用,其中大剂量组(0.160±0.044)效果更为明显(P<0.05),且与阳性对照组(0.20±0.039)比较无差别,其效果优于中(0.266±0.046)、小剂量组(0.315±0.043)(P<0.05);培养72h后,阳性对照组和化浊解毒中药血清各剂量组均有明显的抑制HSC-T6增殖的作用(P<0.05),且化浊解毒中药血清大剂量组效果优于阳性对照组(P<0.05)。经过流式细胞术分析后显示:肝星状细胞经过含药血清干预48h后,空白对照组的凋亡率约2.68%,即说明正常的肝星状细胞也存在着凋亡,阳性对照组15.78 %和化浊解毒中药血清各组的凋亡率均较空白对照组高(P<0.05);与阳性对照组比较,化浊解毒中药血清的大剂量组的细胞凋亡率更高为20.02 %(P<0.05);中剂量组细胞凋亡率13.38%与阳性对照组没有明显差别(P>0.05),小剂量组的凋亡率12.88%要低于阳性对照组(P<0.05)。结论:化浊解毒中药血清各浓度组在体外均能够抑制肝星状细胞的增殖并诱导其凋亡,同时存在一定的量效关系,即浓度越大其抑制增殖和促进凋亡的作用越强。与干扰素组比较,化浊解毒中药血清尤其是大剂量组能有效的抑制肝星状细胞的增殖和诱导其凋亡。第二部分化浊解毒中药血清对肝星状细胞细胞外基质的影响目的:本部分实验主要观察化浊解毒中药血清对肝星状细胞细胞外基质尤其是对I型胶原、Ⅲ型胶原、层粘连蛋白、透明质酸的影响。方法:肝星状细胞加入含药血清后培养48小时后,运用酶联免疫吸附法检测化浊解毒中药血清对肝星状细胞细胞外基质I型胶原、Ⅲ型胶原、层粘连蛋白、透明质酸的影响。结果:肝星状细胞在不同浓度化浊解毒中药血清培养基中培养48 h后,与空白对照组比较,各组均能抑制肝星状细胞分泌I型胶原、Ⅲ型胶原、层粘连蛋白、透明质酸。其中I型胶原、Ⅲ型胶原的含量在大剂量组(分别为117.9 ng·mL~(-1),56.3 ng·mL~(-1))最低,其作用效果明显优于中(158.0 ng·mL~(-1),70.9 ng·mL~(-1))、小剂量组(162.6 ng·mL~(-1),79.6 ng·mL~(-1))及阳性对照组(148.3 ng·mL~(-1),64.3 ng·mL~(-1))(P<0.05);层粘连蛋白、透明质酸的含量在大剂量组(60.1 ng·mL~(-1),31.2 ng·mL~(-1))与阳性对照组(60.0±5.1 ng·mL~(-1),32.8±4.1 ng·mL~(-1))均较低,两组之间无明显差异(P>0.05),均优于中药的中、小剂量组(P<0.05)。结论:化浊解毒中药血清能够减少体外培养的肝星状细胞分泌的细胞外基质,包括降低I型胶原、Ⅲ型胶原、透明质酸和层粘连蛋白的含量。第三部分化浊解毒中药血清对肝星状细胞TGF-β/Smad4信号通路的影响目的:观察化浊解毒中药血清对肝星状细胞内TGF-β1 mRNA和Smad4 mRNA的影响。方法:运用RT-PCR方法观察化浊解毒中药血清各浓度组对TGF-β1 mRNA和Smad4 mRNA基因表达的影响。结果:经化浊解毒中药血清干预48小时后,化浊解毒方各剂量组的TGF-β1 mRNA表达均较正常血清对照组显著减少(P<0.05)。各组的Smad4 mRNA表达量均显著减少(P<0.05)。结论:化浊解毒中药血清抑制肝星状细胞增殖、促进其凋亡及减少合成细胞外基质可能是通过下调TGF-β1 mRNA与Smad4 mRNA表达,影响TGF-β/Smad4通路起作用。第四部分化浊解毒中药血清对肝星状细胞PPARγmRNA的影响目的:本研究将观察化浊解毒中药血清对肝星状细胞内PPARγ的影响,并最终发现对PPARγ及TGF-β/Smad通路的作用,进一步明确化浊解毒中药血清抗肝纤维化的作用机制。方法:运用RT-PCR方法观察化浊解毒中药血清各浓度组对PPARγmRNA基因表达的影响。结果:与空白对照组比较,各组的PPARγmRNA表达量均显著增加(P<0.05)。其中化浊解毒中药血清大剂量组的PPARγmRNA表达量明显优于阳性对照组和中、小剂量组(P<0.05)。结论:化浊解毒中药血清能够增加肝星状细胞内PPARγmRNA的表达量,以化浊解毒中药血清大剂量组最为明显,这也表明了化浊解毒方之所以能干预TGF-β/Smad信号通路可能是通过上调PPARγmRNA来起作用的。第五部分补骨脂素对肝星状细胞的增殖及活性的影响目的:观察化浊解毒方中补骨脂所含有的主要成分补骨脂素对肝星状细胞增殖及活性的影响。方法:常规培养肝星状细胞,并用0.1 mmo·L~(-1)的H2O2造成HSC-T6氧化应激的模型。加入补骨脂素,并用MTT法、放射免疫法和ELISA法分别检测肝星状细胞增殖、细胞上清液中超氧化物歧化酶(SOD),丙二醛(MDA),还原性谷胱甘肽(GSH),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)及I型胶原的含量。结果:与正常对照组比较,补骨脂素在浓度为10μmol·L~(-1),1μmol·L~(-1),0.1μmol·L~(-1),均呈现出抑制HSC增殖的作用(P<0.05),且效果最好的是在作用48h(P<0.05);与模型组比较,补骨脂素各个浓度组能够提高SOD和GSH-PX的活性(P<0.05),并降低细胞上清液中MDA和GSH的含量(P<0.05);与模型组比较,补骨脂素各个浓度组在作用48 h后,细胞上清液中的I型胶原的表达量均降低(P<0.05)。结论:补骨脂素能有效的抑制肝星状细胞的增殖及氧化应激,说明补骨脂素是化浊解毒中药血清治疗肝纤维化的物质基础之一,从另一层面上也说明了浊毒导致肝纤维化的机制可能和氧化应激有关,化浊毒的方法之所以能在治疗肝纤维化中起作用,很可能与其中的抗氧化成分有关,即化浊毒与抗氧化应激有关。总论1化浊解毒中药血清各浓度组均能够抑制肝星状细胞的增殖。2化浊解毒中药血清各浓度组均促进肝星状细胞的凋亡。3化浊解毒中药血清各浓度组均能抑制HSCs细胞分泌I型胶原、Ⅲ型胶原、透明质酸和层粘连蛋白。4经化浊解毒中药血清干预后,化浊解毒中药血清大剂量组的HSC内TGF-β1mRNA表达量明显降低。5化浊解毒中药血清大剂量组的Smad4 mRNA表达量明显低于中、小剂量组(P<0.05)。6化浊解毒中药血清大剂量组的PPARγmRNA表达量明显优于阳性对照组和中、小剂量组。7化浊解毒方防治肝纤维化的机制可能是通过上调PPARγmRNA表达而干预肝星状细胞内TGF-β/Smad4信号通路,从而促进肝星状细胞凋亡和抑制肝星状细胞的增殖及减少其分泌细胞外基质含量而实现的。8不同浓度补骨脂素均有明显抑制肝星状细胞增殖的作用,其中10μmol/L组效果更为明显,在培养48h、72 h后作用更为明显,并呈现出量效关系和时效关系。补骨脂素能有效的抑制肝星状细胞的增殖及氧化应激,说明补骨脂素是化浊解毒方治疗肝纤维化的物质基础之一,化浊毒的方法之所以能在治疗肝纤维化中起作用,很可能与其中的植物雌激素成分有关。
娄莹莹[8]2013年在《基于浊毒理论的肝复健方抗大鼠肝纤维化作用及机制研究》文中研究说明肝纤维化(Hepatic fibrosis,HF)是指各种致病因素所引起肝脏内细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的合成大于降解，致使ECM在肝脏内过度沉积，它是大多数慢性肝病所共有的病理特征，也是慢性肝炎进一步向肝硬化、肝癌发展的重要环节。肝纤维化是可被逆转的阶段，如能阻断和逆转肝纤维化的发生，就可阻止严重后果的发生。肝纤维化的形成是一个多因素、多环节、多阶段的复杂过程，其形成不是静止的，而是不断变化的动态过程。各种细胞因子形成的复杂调节网络，不断影响着肝纤维化的形成和转归。从细胞因子及其信号转导角度研究药物的作用机制，将不断深化肝纤维化的治疗学研究。瘦素（leptin）与肝纤维化的形成之间有着密切的关系，与瘦素受体结合后，激活相应的信号转导通路，促进肝纤维化的发生发展。目前临床上仍然缺乏确切特效的抗纤维化药物与方法。中医药具有多层次、多环节、多途径、多靶点的作用特点，在治疗肝纤维化方面取得了显著的成果。李佃贵教授提出浊毒内蕴，肝络瘀滞是肝纤维化的主要病机之一，并从浊毒论治肝纤维化，在此指导下确立肝复健方，取得显著疗效。既往临床及实验研究表明，肝复健方具有明显的阻断病毒性乙型肝炎慢性化、减轻肝纤维化及保护肝功能的作用。本课题继续在腹腔注射猪血清复制免疫性肝纤维化模型的基础上，观察肝复健方对大鼠肝组织病理形态学、肝纤四项、MMP-1、瘦素(leptin)及其受体（OB-Rb)、JAK2、STAT3的表达情况，探讨其对瘦素调控肝纤维化大鼠JAK2/STAT3信号转导通路的影响，旨在对本方抗HF的药效和可能的作用机制进一步的研究，为肝纤维化的预防与治疗提供理论依据。本实验分为以下五部分：第一部分浊毒理论与肝纤维化目的：探讨浊毒理论与肝纤维化的关系，明确其在肝纤维化中的重要地位，提出肝纤维化治疗的新观点与新方法。方法：通过温习、回顾、整理中医文献，并结合临床实践经验，提出浊毒理论，提出肝纤维化的新病机，系统总结了肝纤维化浊毒证证治规律。结果：提出了浊毒理论，明确了浊毒的概念、临床表现及致病特点。探讨了浊毒与肝纤维化的关系，总结出了肝纤维化浊毒证证治规律，从临床上验证了从浊毒治疗肝纤维化的可行性。结论：浊毒理论是中医学术体系的新的组成部分，是研究浊毒致病的病因、病机、诊断、治疗等理法方药的学科。浊毒与肝纤维化关系密切，是其发生发展的关键环节。第二部分肝复健方对肝纤维化大鼠病理形态学和血清标志物的影响目的：观察肝复健方对猪血清诱导的肝纤维化大鼠病理形态学及血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ型胶原含量的影响，探讨其抗纤维化的作用机制。方法：清洁级SD大鼠60只，雄性，体重200±20g。适应性喂养一周后随机分为正常对照组（Normal group）、模型组（Model group）、秋水仙碱组（Colchicine）、肝复健方低剂量组（GFJL group）、肝复健方中剂量组（GFJM group）、肝复健方高剂量组（GFJH group）六组，每组10只。每周二、周五上午8点，采用无菌未灭活的猪血清腹腔注射进行造模，连续8周。造模成功后正常对照组与模型组给予生理盐水（10ml/kg），日1次灌胃。GFJL组给予含生药1.4g/ml水煎剂灌胃；GFJM组给予含生药2.8g/ml水煎剂灌胃；GFJH组给予含生药4.2g/ml水煎剂灌胃（灌胃液体量为10ml/kg，1次/d）；秋水仙碱组给予0.154mg/kg·d灌胃，均至12周末。实验期间观察大鼠的一般情况。12周末采用腹主动脉取血，分离血清，用放射免疫分析法测定各组大鼠血清中HA、LN、PCIII、CIV水平。留取大鼠肝组织，采用苏木精-伊红染色（HE染色）和胶原纤维特殊染色法（Masson染色）观察肝组织病理形态学改变。结果：1一般情况正常对照组一般情况良好，精神状态好，活泼好动，大鼠食欲佳，进食量正常，皮毛光滑，体重逐渐增加。模型组大鼠精神萎靡、不喜活动，进食较正常组少，皮毛杂乱、黯淡无光泽、尿黄，个别大鼠鼻有出血，体重增长变慢。秋水仙碱及中药治疗各组大鼠精神状态、活动、进食量尚可，被毛光泽，体重有所增加，无特殊异常状态出现。2肝脏大体观察正常组大鼠肝脏质地较软，表面光滑，略呈深红色，有光泽，无任何斑点、突起，边缘锐利。模型组大鼠肝脏质地硬，表面欠光滑，部分标本表面粗糙，凹凸不平，颜色暗红，边缘钝。秋水仙碱及中药治疗组大鼠肝脏质较脆，表面较光滑，颜色基本正常，基本无斑点、突起等。3肝复健方对肝纤维化大鼠肝组织病理的影响正常组肝小叶结构清晰完整，肝细胞围绕中央静脉呈放射状排列，无变性坏死，未见纤维组织增生及炎性细胞浸润。模型组肝小叶结构破坏，肝细胞索排列紊乱，肝细胞变性，部分肝细胞坏死，伴有中性粒细胞及淋巴细胞浸润，纤维组织大量增生，个别动物可见假小叶形成。秋水仙碱组与中药治疗各组肝脏损伤程度均较模型组轻，肝小叶结构破坏减轻，肝脏胶原纤维增生减轻，肝细胞水肿好转，变性情况明显改善，炎细胞浸润减少。肝复健方高剂量组肝脏结构改善最为明显。4肝复健方对肝纤维化大鼠血清HA、LN、PCⅢ、CIV的影响与正常对照组相比，模型组大鼠血清HA、LN、PCⅢ、CIV水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组相比，12周末各药物干预组大鼠血清HA、LN、PCⅢ、CIV水平下降(P<0.05)。肝复健方高剂量组血清HA、LN、PCⅢ、CIV水平显著性降低，优于秋水仙碱组、中剂量组及低剂量组（P＜0.05）；秋水仙碱组、肝复健中剂量组之间比较，差异无统计学意义（P>0.05）；秋水仙碱组与肝复健方低剂量组比较，血清HA、LN、PCⅢ、CIV水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。结论：肝复健方能够改善大鼠的一般状况，显著降低大鼠血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ型胶原含量，促进ECM的降解，抑制纤维组织增生，改善肝纤维化大鼠的病理组织结构，恢复肝细胞损伤，达到抗肝纤维化的作用。第三部分肝复健方对肝纤维化大鼠瘦素及瘦素受体表达的影响目的：观察肝复健方对血清瘦素、肝组织瘦素及瘦素受体的影响，进一步明确瘦素在肝纤维化形成过程中的生物学效应以及化浊解毒法抗肝纤维化的深层作用机制。方法：放射免疫分析法检测血清瘦素(Leptin)水平，逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)技术检测肝组织瘦素(leptin)及瘦素受体(OB-Rb)的表达。结果：1肝复健方对大鼠血清Leptin水平的影响与正常对照组相比,模型对照组、各药物组血清瘦素水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)；与模型对照组相比，秋水仙碱组和肝复健方各剂量组血清瘦素水平明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。各药物治疗组比较，肝复健方高剂量组血清瘦素水平显著性降低，优于秋水仙碱组、中剂量组及低剂量组（P＜0.05），秋水仙碱组与中剂量组比较，无显著性差异(P﹥0.05)。秋水仙碱组与低剂量组比较，血清瘦素水平下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。2肝复健方对大鼠肝组织Leptin、OB-RbmRNA表达的影响与正常对照组相比，模型对照组、秋水仙碱组和肝复健方各剂量组Leptin、OB-RbmRNA的表达明显增强，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型对照组相比，秋水仙碱组和肝复健方各剂量组Leptin、OB-RbmRNA表达明显减弱，差异有统计学意义（P＜0.05）。各药物治疗组比较，肝复健方高剂量组Leptin、OB-RbmRNA表达显著性降低，优于秋水仙碱组、中剂量组及低剂量组（P＜0.05），秋水仙碱组与中剂量组比较Leptin、OB-RbmRNA的表达有下降趋势，但均无显著性差异(P﹥0.05)。秋水仙碱组与低剂量组比较，Leptin、OB-RbmRNA的表达减弱，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：瘦素是内生浊毒的物质基础之一，肝复健方能够有效降低肝纤维化模型大鼠瘦素及瘦素受体的表达，减少两者的结合，进而抑制下游信号转导通路，从而达到抗肝纤维化的作用。第四部分肝复健方对大鼠肝组织MMP-1表达的影响目的：观察肝复健方对HF大鼠肝脏MMP-1表达的影响，从分子水平探讨肝复健方抗肝纤维化的深层作用机理。方法：逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)技术检测肝组织MMP-1的表达。结果：与正常对照组相比，模型对照组、秋水仙碱组和肝复健方各剂量组MMP-1mRNA的表达均明显减弱，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型对照组相比，秋水仙碱组和肝复健方各剂量组MMP-1mRNA表达明显增强，差异有统计学意义（P＜0.05）。各药物治疗组比较，肝复健方高剂量组MMP-1mRNA的表达显著性增强，优于秋水仙碱组、中剂量组及低剂量组（P＜0.05），秋水仙碱组与中剂量组比较MMP-1mRNA的表达有增强趋势，但均无显著性差异(P﹥0.05)。秋水仙碱组与低剂量组比较，MMP-1mRNA的表达增强，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：肝复健方可以显著提高MMP-1mRNA的表达水平，通过抑制HSC合成和分泌瘦素，促进MMP-1的表达，从而使细胞外基质降解，阻碍肝纤维化进程。第五部分肝复健方对肝纤维化大鼠肝组织JAK2/STAT3信号转导通路的影响目的：观察肝复健方对HF大鼠肝脏JAK2、STAT3蛋白表达的影响，以进一步探讨肝复健方抗肝纤维化的深层作用机理，为临床防治肝纤维化提供理论依据方法：Western blot检测HF大鼠肝组织JAK2、STAT3的表达。结果：1肝复健方对大鼠肝组织JAK2蛋白表达的影响(1)所有实验组大鼠肝组织中JAK2的表达量均高于正常对照组(P<0.05)。(2)肝复健方各剂量组及秋水仙碱组与模型组相比JAK2的蛋白表达量显著性降低(P<0.05)。(3)肝复健方中剂量组与秋水仙碱组相比JAK2蛋白表达量均无显著性差异(P﹥0.05)；秋水仙碱组与肝复健方低剂量组相比JAK2蛋白的表达量有显著性降低(P<0.05)，肝复健方高剂量组与秋水仙碱组相比，JAK2蛋白的表达量有显著性降低(P<0.05)。(4)肝复健方药不同剂量组之间比较，高剂量组JAK2蛋白的表达量优于中剂量组，中剂量组优于低剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05）。2肝复健方对大鼠肝组织STAT3蛋白表达的影响(1)所有实验组大鼠肝组织中STAT3的表达量均高于正常对照组(P<0.05)。(2)肝复健方各剂量组及秋水仙碱组与模型组相比STAT3的蛋白表达量有显著性降低(P<0.05)。(3)肝复健方中剂量组与秋水仙碱组相比STAT3蛋白表达量均无显著性差异(P﹥0.05)；秋水仙碱组与肝复健方低剂量组相比STAT3蛋白的表达量有显著性降低(P<0.05)，肝复健方高剂量组与秋水仙碱组相比，STAT3蛋白的表达量有显著性降低(P<0.05)。(4)肝复健方药不同剂量组之间比较，高剂量组STAT3蛋白的表达量优于中剂量组，中剂量组优于低剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：肝复健方能够下调肝纤维化大鼠肝组织JAK2、STAT3的表达，进而抑制HSC活化、增殖，降低胶原的表达和分泌，最终起到抗肝纤维化的作用。瘦素调控的JAK2/STAT3信号转导通路是肝复健方抗肝纤维化的新的作用途径和作用靶点。
参考文献：
[1]. 基质金属蛋白酶及其抑制因子基因表达调控在治疗肝纤维化中作用的实验研究[D]. 王宇. 第一军医大学. 2000
[2]. 化纤胶囊对肝纤维化大鼠防治作用的研究[D]. 刘飞. 兰州大学. 2007
[3]. 甲珠防治肝纤维化基础及临床研究[D]. 付德才. 吉林大学. 2008
[4]. 白藜芦醇对大鼠肝纤维化的防治及相关机制的研究[D]. 林家禾. 广州中医药大学. 2009
[5]. 加味大黄蛰虫丸治疗实验性肝纤维化的作用及机制研究[D]. 黄碧松. 广州中医药大学. 2008
[6]. 化肝通络方改善肝纤维化的临床研究和Th17细胞分化介导的机制研究[D]. 宣佶. 南京中医药大学. 2018
[7]. 化浊解毒中药血清及补骨脂素对肝星状细胞生物活性的影响[D]. 郭敏. 河北医科大学. 2011
[8]. 基于浊毒理论的肝复健方抗大鼠肝纤维化作用及机制研究[D]. 娄莹莹. 河北医科大学. 2013
标签：消化系统疾病论文; 白藜芦醇论文; 对照组论文; 基质金属蛋白酶论文; 肝星状细胞论文; 肝纤维化论文; 大黄蛰虫丸论文; 基因表达论文; 肝细胞论文; 药品论文; 养生论文;