1.湖南省人民医院肝胆外科 湖南长沙 410005；2.海南省人民医院 海南海口 570311
【摘 要】目的 探讨C- myc反义寡核苷酸（ASODN）对人胆管癌QBC939细胞侵袭力及其c-myc蛋白表达的影响。方法 采用常规方法培养QBC939细胞，合成C-myc ASODN及NSODN，并将其转染QBC939细胞；用Western-blot法检测转染ASODN组、转染NSODN组（无义组）及空白对照组细胞中c-myc蛋白的表达；通过Transwell实验计算穿透小室基底膜的细胞数来评价各组细胞在体外的侵袭力。结果 无义组与空白对照组比较无差异（P>0.05），转染组灰度值及细胞穿透数目显著低于空白对照组（P<0.01）。结论 C- myc ASODN能抑制QBC939细胞c-myc蛋白的表达，并抑制其体外的侵袭力。
【关键词】胆管癌；基因；C- myc；反义；侵袭力
The effect of c-myc antisense oligodeoxynucleotide on the invasiveness and c-myc expression in QBC939 cells
WU Yi-Fei，LI Zhuo-R，MAO Xian-Hai，WU Jin-Shu
（Department of Hepatobiliary Surgery，Hunan Provincial People’s Hospital，Changsha 410005，China）
【Abstract】Objective To investigate the effect of c-mycASODN on the invasiveness and c-myc expression in human bile duct carcinoma cell line QBC939.Methods QBC939 cells was conventionally cultured.C-myc ASODN and NSODN was designed and transfected to the cell line；Western-blot was used to detect the expression of c-myc in ASODN array，NSODN array and control group；Transwell experiment was used to evaluate the invading capacity of QBC939 cells by calculating penetrated cells.Results The luminosity numerus and the number of cells penetrated in ASODN group was significantly lower than that in blank comparison group（P<0.01）；NSODN group was no difference to blank comparison group（P>0.05）.Conclusions C- myc ASODN can inhibit the c-myc expression and invasiveness in QBC939 cells in vitro..
Key words：Bile Duct Carcinoma；Gene，c-myc；Antisense，invading capacity
胆管癌是起源于胆管上皮细胞的恶性肿瘤，近年来其发病率有增加趋势[ 1-3 ]，且经数十年努力，其预后并无明显改善[4]。随着现代分子生物学技术的迅猛发展，胆管癌的治疗有望从肿瘤基因治疗这门新兴领域中找到新途径。许多学者均研究证实了在胆管癌细胞中存在c-myc高度表达，并且当胆管从良性到恶性转变时，c-myc 蛋白表达水平上调，同时与肿瘤的浸润转移密切相关 [5，6]。研究亦表明[7 ]，应用“反义核酸技术”可特异性地抑制某一过度表达基因或有害基因的表达，从而达到肿瘤基因治疗的目的，且不影响其它基因功能。本研究合成C-myc ASODN及NSODN，并将其作用于胆管癌QBC939细胞，旨在探讨C- myc反义寡核苷酸（ASODN）对人胆管癌QBC939细胞侵袭力及其c-myc蛋白表达的影响，为胆管癌的基因治疗提供理论依据和实验基础。
1 材料与方法
1．1 C- myc ASODN及NSODN的设计与合成
在GenBank中检索出C–myc的基因序列，针对C - myc mRNA第二外显子及其后4个密码子，合成反义寡核苷酸（ASODN），正义链序列为5’- ATG CCC CTC AAC GTT - 3’，反义链序列（ASODN）为5’- AAC GTT GAG GGG CAT - 3’。自行设计无义链序列（NSODN）为5’- CAG AGT CGA TGA GCT - 3’经检索与人类其他基因无同源性。设计合成的寡核苷酸均全硫代修饰。由美国invitrogen公司上海分公司合成、修饰、纯化、分装，共5OD，分装成每管1OD，40C保存备用。
1．2 细胞培养、传代
人胆管癌细胞株QBC939由第三军医大学西南医院王曙光等建株、中南大学湘雅医学院细胞中心惠赠。该细胞株用改良型RPMI 1640培养液（含10％灭活小牛血清、100U青霉素＋链霉素），于370C，5％CO2 培养箱中培养，0.25％的胰蛋白酶消化传代。
1．3 实验分组与转染
本研究分为两个实验部分。其一为Western-blot实验，实验设3组：①QBC939细胞组（空白对照组）；②转染NSODN终浓度为8.0umol/L组；③转染ASODN终浓度为8.0umol/L组；每组4个加样孔，实验重复4次，即可得16个样本数（n＝16）。其二为Transwell小室侵袭实验，实验设3组：①QBC939细胞组（空白对照组）；②转染NSODN终浓度为8.0umol/L组；③转染ASODN终浓度为8.0umol/L组；每组设6个复孔（3个24孔板），即每组可得18个样本数（n=18）。以脂质体介导法转染，按照LipofectamineTM2000转染试剂盒（美国invitrogen公司）说明，以脂质体体积量与相应转染的ASODN的质量比为3：1的比例进行细胞转染。
1．4 Western-blot检测c-myc蛋白的表达
常规细胞培养瓶培养QBC939，瓶底贴壁细胞90％融合，细胞数达105。按ASODN及NSODN终浓度为8.0umol/L对细胞进行转染，空白对照组不转染，无义组转染NSODN。各组细胞于370C、5％CO2培养箱中培养24小时后，测定并制备蛋白样品；并进行SDS－PAGE电泳、转膜；进行免疫反应，一抗为鼠抗人c-myc单克隆抗体，二抗为辣根过氧化物酶（HRP）偶联的兔抗鼠IgG；DAB显色，凝胶图象分析。测得各组扫描相对灰度值A，灰度值越大，蛋白表达越强；反之，灰度值越小，蛋白表达越弱，说明蛋白表达受到抑制。3个实验组，每组4个加样孔，每实验样孔组均加入β-actin作内参照。实验重复4次。
1．5 Transwell法检测细胞侵袭力
备制细胞悬液，调整细胞浓度为2 x 105∕ml，将细胞悬液种入24孔板，每孔500ul，细胞数为每孔1x 105个，实验分3组，每组设6个复孔。按ASODN及NSODN终浓度为8.0umol/L对细胞进行转染，空白对照组不转染，无义组转染NSODN，转染6小时后收集各组细胞用于后续实验。按Transwell小室（美国invitrogen公司）说明，制备Transwell小室，用50mg/LMatrigel 1：8稀释液包被基底膜，用含10g/L BSA的无血清培养液水化基底膜。Transwell小室下面的孔内每孔加入500ul（含抗生素、10％FBS）1640液，上室各孔加入相应上述各实验组细胞，于370C、5％CO2 培养箱中培养24小时。取出上室，用棉签擦去基质胶和上室内的细胞，75％酒精固定，台盼兰染色，将小室反过来底朝上在正置显微镜下进行观察和拍照，每孔细胞计数时随机选取上下左右中5个视野。穿过基底膜的细胞数越多，侵袭能力越强；反之，穿过基底膜的细胞数越少，侵袭能力越弱，胆管癌细胞的侵袭能力受到抑制。
1．6 统计学处理
实验数据用x? ±s 表示，用SPSS-16.0软作统计分析。组间两两比较用t检验。以P<0.05为有差异，作为有统计学意义的标准。
2 结果
2．1 C- myc ASODN对QBC939细胞中C-myc蛋白表达的影响
Western-blot检测各实验组人胆管癌细胞中c-myc蛋白的表达，经SDS－PAGE电泳后，测出各组c-myc蛋白条带的灰度值，发现无义组的灰度值（22.31±2.51）与空白对照组（23.89±2.40）无差异（P>0.05），而转染组的灰度值（7.06±1.99）显著低于空白对照组（P<0.01），有统计学意义（见表1，图1、）。说明转染c-mycASODN后，c-myc蛋白在人胆管癌细胞中的表达受到了抑制。
3 讨论
目前，胆管癌正严重威胁着患者的生命，且其治疗效果较差；因此，开展胆管癌的研究尤其是开展有关其基因治疗方面的研究有着重要的临床意义。
近年来，肿瘤分子生物学和分子遗传学的研究表明，原癌基因的激活、抑癌基因的失活和细胞凋亡调控基因的失调是许多肿瘤的重要发生机制。研究证明[8]，由于c-myc的扩增和过度表达，而导致c-myc原癌基因的激活，从而促使胆管癌细胞的分裂、增殖和浸润。反义寡核苷酸能专一性地抑制靶基因的表达，国外的研究证明c-myc 反义核酸能够针对肿瘤发生的三个环节[9]来治疗肿瘤。因此，从理论上来讲，运用反义技术就可能封闭c-myc的表达，即可能抑制胆管癌细胞的分裂、增殖和浸润。
Western-blot蛋白印迹法检测蛋白表达其原理是通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测。本研究以c-myc蛋白作为靶物质，以鼠抗人c-myc单克隆抗体为探针，检测各组细胞中c-myc蛋白的表达；实验中经SDS－PAGE电泳后，测出各组c-myc蛋白条带的灰度值，无义组的灰度值为22.31±2.51，空白对照组为23.89±2.40，转染组的灰度值为7.06±1.99；无义组与空白对照组比较无差异（P>0.05），转染组明显低于无义组及空白对照组（P<0.05），从而提示c-mycASODN抑制了胆管癌细胞中c-myc的表达。
有学者研究认为 c-myc 基因作为转录调控因子，可以调节肿瘤细胞表面抗原的表达，并对肿瘤细胞的侵袭性、黏附性具有重要的影响[10]。本研究通过Transwell实验计算穿透小室基底膜的细胞数来评价细胞在体外的侵袭力，结果发现无义组的胆管癌细胞穿透数为381.33±17.03，与空白对照组的细胞穿透数目（393.50±10.65）无明显差异（P>0.05），而转染组的穿透细胞数是194.17±12.04，显著小于无义组及空白对照组（P<0.05）；表明转染c-mycASODN后，人胆管癌细胞在体外的侵袭作用受到了抑制。
综上所述，c-mycASODN对人胆管癌细胞中c-myc蛋白的表达，以及癌细胞在体外侵袭作用均有不同程度的抑制作用。根据反义技术的原理[11]分析，可能是c-myc ASODN通过干扰c-myc基因的解旋、复制、转录、c-mycmRNA的剪接加工乃至输出和翻译等各个环节，从而抑制了c-myc基因在胆管癌细胞中的扩增和过度表达。文献报道在许多不同类型的肿瘤中常伴随有c-myc 基因的高水平表达，且表达水平与生长率和侵袭性、黏附率呈正相关[12]；因此可说明正是由于c-myc ASODN抑制了人胆管癌细胞中c-myc基因的表达，从而导致癌细胞的浸润均受到不同程度的抑制。
反义寡核苷酸比其他药物设计方法更具有优越性，更有利于临床应用。但是c-myc ASODN对胆管癌细胞在体内是否有上述同样的作用，且达到最佳药效强度的浓度是多少，还有待进一步的探讨和研究。
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论文作者:吴一飞1,李灼日2,毛先海1,尹新明1
论文发表刊物:《航空军医》2017年第1期
论文发表时间:2017/2/27
标签：转染论文; 细胞论文; 胆管论文; 癌细胞论文; 蛋白论文; 小室论文; 基因论文; 《航空军医》2017年第1期论文;