【关键词】PDCD5 、MM、TM 、Survivin、BCL-2、凋亡
多发性骨髓瘤（Multiple myeloma，MM）是一种恶性浆细胞增生性疾病，据报道，发病率占血液系统约10%，主要患病人群为老年人，40岁以下者少见，近年来发病率有逐年上升的趋势。迄今为止仍未发现能够有效治愈多发性骨髓瘤的临床方案，如何提高患者的生存率及缓解率是国内外研究者的棘手问题，目前我们需要研究新兴临床药物来提高多发性骨髓瘤的疗效，近年来，随着来那度胺、硼替佐米、三氧化二砷等新药的问世，使复发、难治性MM取得了较好的缓解率，给MM治疗带来希望的同时，迫切需要我们寻求更有效、更突破的治疗方案。多发性骨髓瘤作为目前不能被治愈的恶性血液病的一种， 目前国内外鲜有研究报道作为凋亡促进剂的PDCD5蛋白联合应用作为凋亡诱导剂的沙利度胺是否具有正协同性，我们将通过流式细胞学、RT-PCR、Western Blot、MTT等实验方法探究PDCD5是否通过下调Survivin蛋白的表达诱导细胞凋亡，进一步探究讨其是否通过调控凋亡相关基因BCL-2的表达来实现，从而为治疗多发性骨髓瘤提供新的临床靶向治疗，给治愈多发性骨髓瘤带来新的篇章。
1 材料与方法
1.1材料
试剂准备：沙利度胺干粉17mg，用170ul的DMSO助溶，使其终浓度为100mg/ml，存放，2周内使用。使用前用含15％新生牛血清的RPMI 1640培养基稀释，配制成不同使用浓度，即20mg/L、10mg/L，DMSO终浓度＜0.2%。PDCD5蛋白购于北京宝赛公司，配制同沙利度胺。
1.2方法
细胞培养：RPMI-8226细胞，在相对无菌操作条件下，培养于含15％新生牛血清的RPMI 1640培养基中，置37℃，5％C02饱和湿度培养箱中培养，根据细胞生长情况，平均每隔3天换液并传代1次，倒置显微镜下观察细胞生长情况，取对数生长期细胞用于实验研究。
1.3实验分组及引物设计
对照组：不加任何药物干预。
实验组分为4组：第一组单独予20mg/l PDCD5蛋白后的细胞组；第二组单独予20mg/l 沙利度胺处理细胞组；第三组予20mg/l沙利度胺加10mg/L PDCD5蛋白处理细胞组；第四组予20mg/l沙利度胺加20mg/L PDCD5蛋白处理细胞组。
MTT法检测各个实验组和对照组RPMI-8226细胞的生长抑制表达。
取对数生长期细胞，以RPML-l640培养液调整细胞浓度为lxl06／ml，接种于96孔培养板，每个实验组分别做5个复孔，对照孔只加细胞，不加药物，细胞培养5h后加药物，培养24h、48h、72h，在培养时间终止前4h，每孔加入5mg／mL MTT 20ul，离心1000rpm，5min后，倒掉所有液体，每孔加二甲基亚砜(DMSO)150ul，摇床10min，置酶标仪读取OD 490值(A)。抑制率=（对照组OD值-处理组OD值）/对照组OD值×100%。
1.4统计学方法
实验数均以±S表示，各组数据进行采用统计计量方差分析，应用SPSS13．0统计分析软件处理实验数据，P<0．05为差异有统计学意义。 2实验结果
MTT检测各个药物处理组和对照组对RPMI-8226细胞增殖的抑制：结果显示，各个药物处理组均能不同程度的抑制RPMI-8226细胞增殖（P<0.05），见表1，采用SPSS11.5软件进行方差分析,我们发现20mg/l沙利度胺加10mg/L PDCD5蛋白处理细胞组、20mg/l沙利度胺加20mg/L PDCD5蛋白处理细胞组有明显的抑制率，且存在剂量依赖性和时间依赖性。结果表明，20mg/l沙利度胺加20mg/L PDCD5蛋白处理细胞组在24h、48h和72h的抑制率分别为（51.51±1.67）%、（69.93±3.48）%、（79.30±5.19）%，对RPMI-8226细胞增殖抑制最明显,下图1纵向显示三个时间点各个细胞处理组作用于RPMI-8226细胞的抑制率。
表 1
.png)
附：▲ 与24h比较，P<0.05；★与48h比较，P<0.05
1:PBS对照组；2:单独予20mg/l PDCD5蛋白处理细胞组；3:单独予20mg/l 沙利度胺处理细胞组；4:20mg/l沙利度胺加10mg/L PDCD5蛋白处理细胞组；5:20mg/l沙利度胺加20mg/L PDCD5蛋白处理细胞组。
.png)
图1
Western BLOT检测各个药物处理组和对照组处理RPMI-8226细胞后survivin、BCL-2 蛋白表达的影响。
本课题组进一步研究survivin、BCL-2 蛋白水平的表达情况，各个药物处理组和对照组处理RPMI-8226细胞后survivin、BCL-2 蛋白表达情况（见图2），由此可见，survivin、BCL-2 蛋白水平表达与RT-PCR检测的survivin、BCL-2 mRNA表达情况相一致，PDCD5蛋白处理RPMI-8226细胞后survivin、BCL-2 蛋白表达量随PDCD5蛋白的量增加而减低，单独予20mg/l PDCD5蛋白后的细胞组、单独予20mg/l 沙利度胺处理细胞组、予20mg/l沙利度胺加20mg/LPDCD5蛋白处理细胞组、予20mg/l沙利度胺加10mg/LPDCD5蛋白处理细胞组作用于RPMI-8226细胞 72h后，Survivin、Bcl-2 蛋白的表达逐渐下调，根据Bandscan软件分析出各组的灰度值，Survivin 蛋白相对表达水平分别为：0.99±0.21、0.74±0.12、0.53±0.10、0.21±0.06、0.19±0.04。Bcl-2 蛋白相对表达水平分别为：0.96±0.09、 0.82±0.11、0.47±0.09、0.32±0.05、0.17±0.05。采用方差统计学分析，P＜0.05，差异具有显著性。
3 Western Blot实验结果：
图2：Western Blot检测对照组和各个实验组处理RPMI-8226细胞survivin、BCL-2蛋白的表达
.png)
注：实验次数三次以上，与对照组比较有意义，P<0.05
1:PBS对照组；2:单独予20mg/l PDCD5蛋白处理细胞组；3:单独予20mg/l 沙利度胺处理细胞组；4:20mg/l沙利度胺加10mg/L PDCD5蛋白处理细胞组；5:20mg/l沙利度胺加20mg/L PDCD5蛋白处理细胞组
4 讨论
细胞凋亡 (apoptosis)，生物体内细胞在特定的内源和外源信号诱导下，其死亡途径被激活，并在有关基因的调控下发生的程序性死亡过程，是程序性死亡过程的一种主要形式。早在1965年，Lockshin等[1]人提出了“程序性细胞死亡”的概念，直到1972年，Kerr等人提出了“细胞凋亡”的概念。随着近年来研究逐渐分子生物化，“细胞凋亡”的理论概念被越来越多的研究者所接受，同时越来越多的研究者把注意力集中到细胞凋亡的研究中，细胞凋亡已成为当前最热门的课题之一。
TF—l细胞凋亡相关基因(TF— cell apoptosis related gene19，TFARl9)是1999年从此细胞中克隆的一种新的凋亡调控基因，国际人类基因命名委员会将此命名为PDCD5基因【2】，将含PDCD5 CDNA的真核表达载体转染白血病细胞系TF—l等细胞后，可促进白血病细胞凋亡【3】，从此越来越多的研究提示PDCD5基因的表达与人类多种疾病，尤其是恶性肿瘤息息相关。已有研究发现，PDCD5基因经过真核表达载体导人或大肠杆菌表达重组蛋白导入多种细胞后，不能单独对细胞产生明显的影响，但当触发各种凋亡因素的情况下，如化学药物、细胞因子、物理射线放疗等，PDCD5能够起到明显促细胞凋亡效应，即可明显促进细胞凋亡，这些结果表明，PDCD5是凋亡促进剂而非凋亡诱导剂【4-5】。
目前对于PDCD5蛋白促进细胞凋亡的机制研究甚少， PDCD5蛋白在凋亡早期就出现明显的核转位现象，其发生早于磷脂酰丝氨酸外翻现象，表明PDCD5蛋白的核转位现象可能是细胞凋亡的早期信号。已有研究表明，Chen LN等【6】通过PDCD5 siRNA方法使内源性PDCD5低表达后，能够使过表达Bax诱导的凋亡效应减弱，并且能够抑制细胞增殖，而PDCD5低表达后，caspase-3活化几乎完全被抑制，线粒体损伤导致细胞色素C释放减少，Bax线粒体转位减少，提示PDCD5可能通过影响Bax线粒体转位，减少细胞色素C的释放，直接或间接抑制caspase-3活性，Caspase-3作为Caspase家族中最重要的成员之一，是凋亡有序级联反应的下游，在凋亡执行过程中起重要作用，大多数触发细胞凋亡的因素，最终均需要通过Caspase-3介导的信号传递途径导致细胞凋亡[7]。刘善浩等[8]研究发现Caspase-3表达降低与多发性骨髓瘤发病机制可能有密切关系，且与多发性骨髓瘤患者的预后相关。PDCD5蛋白可能通过某种信号通路，参与了Caspase-3的活化，或者是减少某些物质对Caspase-3活化的抑制，增加Caspase-3的表达，从而促进MM细胞的凋亡。
Survivin基因是新近发现的抗凋亡抑制基因，在绝大多数肿瘤细胞均有高表达，目前Survivin蛋白已成为研究的热点，是检测其在抗肿瘤治疗的一个广泛适用的靶基因。有关survivin基因抑制凋亡的机制研究表明，Survivin基因可特异性抑制Caspase3、Caspase7等途径抑制细胞凋亡，并调节细胞的增殖及分裂【9】。随着对细胞凋亡研究日益深入，发现Survivin基因表达与多种肿瘤的预后及肿瘤耐药有关，李娟【10】等研究报道，Survivin特异性表达于MM细胞，并可作为逆转骨髓瘤细胞耐药治疗中的潜在靶点。
本课题组MTT研究结果发现，单用沙利度胺、单用PDCD5蛋白、沙利度胺联合PDCD5蛋白均可诱导MM细胞凋亡，单用沙利度胺较单用PDCD5蛋白作用明显，两者联合应用较单用药凋亡作用明显，通过FCM分析细胞凋亡率发现，联用PDCD5蛋白和沙利度胺较单用PDCD5蛋白或沙利度胺凋亡率明显升高，同时显示加用较高浓度PDCD5蛋白(20mg／L)较浓度较低PDCD5蛋白(10mg／L)作用更明显，通过分子生物学角度上分析，survivin及Bcl-2表达均有不同程度下调，并且浓度较高PDCD5蛋白组Survivin及Bcl-2表达下调更明显。由此可见，PDCD5蛋白在诱导MM细胞过程中，活化了survivin及Bcl-2调节抑制的caspase通路，起到关键性诱导凋亡作用。
参考文献
[1]Vatix D L.Korstneyer SJ,1999,96:245-254.
[2]]Liu H ，Wang Y G．Zhang Y M，et a1．TFARl 9，a novel apoptosis related gene cloned from human leukemia cell line TF·1，could enhance apoptosis of aonle tumor cells in-dueed by Swwth factor with drawal [J]．Biochem Biophy Res Commun。1999，254(1)：203—2l0．
[3]李莉，陈英玉，郑蕊，等．几种不同方式诱导Jurkat细胞凋亡过程中TFARl9的表达[J]．中国实验血液学杂志，2000，8(2)：8l-84．
[4]张颖妹，徐秀珍，刘红涛，等．人重组TFARl9蛋白对白血病细胞株HL·60的促凋亡效应[J]．中国免疫学杂志，2000，16(1)：8-11．
[5]李莉，陈英玉，郑蕊，等．几种不同方式诱导Jurkat细胞凋亡过程中TFARl9的表达[J]．中国实验血液学杂志，2000，8(2)：8l-84．
[6]Linnan Chen，et a1．Short interfering IENA against the PDCD5 attenual cell apoptosis and easpase-3 activity induced by Bax over- exprcssion．[J]．Apoptosis．11(1)：101—11
[7]蒋铁斌，李昕，PDCD5在多发性骨髓瘤中的表达及其与BCL-2相关性，J cent south univ(med sci) 2008,33(9).
[8]郑晓永 白艳，郭长青，PDCD5和Smac在食管鳞癌中的表达及其临床意义，实用医学杂志2011年第27卷第2期。
[9]保秋萍，相关凋亡基因在多发性骨髓瘤发病中作用的研究进展，白血病.淋巴瘤2010年08月第19卷第8期.
[10]李娟，赵莹，Survivin在多发性骨髓瘤患者骨髓细胞中的表达及其临床意义，癌症，2005,24（12）：1522-1526.
论文作者:韩俏
论文发表刊物:《医师在线》2020年第2期
论文发表时间:2020/3/17
标签：细胞论文; 蛋白论文; 凋亡论文; 抑制论文; 实验组论文; 基因论文; 诱导论文; 《医师在线》2020年第2期论文;