（1河北省迁安市人民医院重症医学科 河北 唐山 064400）
（2河北省迁安市人民医院医保科 河北 唐山 064400）
（3河北省迁安市人民医院神经外科 河北 唐山 064400）
【摘 要】目的：观察不同剂量血府逐瘀汤对急性一氧化碳中毒大鼠模型海马细胞脑红蛋白表达的影响。方法：雄性SD大鼠60只，随机分为5组，分别是：正常对照组（A组）、一氧化碳中毒模型组（B组），血府逐瘀汤高剂量组24g(6m1)／(kg?d)（C组）、中等剂量组12g(3m1)／(kg?d)（D组）、低剂量组6g(1.5m1)／(kg?d)（E组），每组12只，B、C、D、E组经腹腔注射纯CO制备急性一氧化碳中毒大鼠模型，于造模后30min开始每日一次分别予生理盐水、血府逐瘀汤相应剂量灌胃，于造模后7d处死，采取免疫组化染色结合阳性细胞记数的方法观察各组大鼠海马区脑细胞脑红蛋白的表达的变化，对所得数据进行统计学分析。结果：与正常对照组相比，各组大鼠海马脑红蛋白阳性神经元数目明显减少，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.O5)；与模型组相比，C、D、E组脑红蛋白阳性神经元数目增多(P<0.O5)，其中高剂量组脑红蛋白阳性神经元数目最多，与模型组相比差异有统计学意义(P<0.O1)。结论：应用血府逐瘀汤可增加急性一氧化碳中毒大鼠海马区脑红蛋白表达，其作用与用药剂量呈正相关。
【关键词】血府逐瘀汤；一氧化碳中毒；一氧化碳中毒迟发性脑病；脑红蛋白；
【中图分类号】R749.6+3 【文献标识码】B 【文章编号】1003-5028（2015）5-0015-02
一氧化碳中毒(carbon monoxide poisoning)经治疗清醒后经过一段“假愈期”后再次出现一组以痴呆为主的神经精神症状称为急性CO中毒迟发性脑病（DEACMP），是急性CO中毒后最严重的并发症之一。脑红蛋白(neuroglobin，NGB)是体内第三类重要的携氧蛋白，主要在脑组织中表达，在缺血缺氧性损伤中对神经元的保护作用。本研究拟通过观察不同剂量血府逐瘀汤对在大鼠模型中海马细胞脑红蛋白表达变化的影响，为血府逐瘀汤的临床应用提供佐证。
1资料与方法
1.1实验动物和试剂
雄性成年SD大鼠60只，体重240～280g。由河北联合大学实验动物中心提供。NGB多克隆抗体由军事医学科学院二所制备并纯化，辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗兔IgG为迈新生物科技有限公司产品，其余试剂为进口和国产分析纯。血府逐瘀汤成分：当归9g，生地黄15g，桃仁12g，红花15g，赤芍l2g，枳壳15g，川芎9g，牛膝6g，桔梗l2g，柴胡l5g，甘草3g。逐瘀汤主要成分均由迁安市人民医院中医药房提供，煎煮方法参照文献制备[1]，60℃水浴浓缩至含生药量4 kg.L-1，装瓶置4℃冰箱备用，临用前稀释至所需浓度。CO纯品气体(99.95 %)由北京康福气体公司提供。
1.2动物模型及标本制备
将60只健康SD大鼠随机分为5组，分别是：正常对照组（A组）、一氧化碳中毒模型组（B组），血府逐瘀汤高剂量组24g(6m1)／(kg?d)（C组）、中等剂量组12g(3m1)／(kg?d)（D组）、低剂量组6g(1.5m1)／(kg?d)（E组），每组12只，B、C、D、E组参照王耀宏等[1]的方法经腹腔注射纯CO制备急性一氧化碳中毒大鼠模型，采用预实验确定的100ml/kg剂量的纯品CO作为首次注射剂量，连续3次按首次剂量的半量（50ml/kg）做追加注射，间隔为4h，共四次注射CO气体。C、D、E组于造模后30min开始每日一次分别予血府逐瘀汤相应剂量灌胃，空白对照组给予腹腔注射空气及生理盐水灌胃。
1.3标本制备
制备模型后将大鼠置笼饲养，实验动物于造模后7d处死。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆以3％的水合氯醛麻醉后，经心脏灌注生理盐水200ml后，再用10％的多聚甲醛溶液、1％戊二醛的混合液100～200ml灌注固定，整个灌注时间不超过6min。1h后取脑组织，每个标本的大脑海马区各切取1.0mm×1.0mm×1.0mm组织块，放入10％多聚甲醛溶液中固定4～6h，固定后的组织经脱水、浸蜡、包埋后制成石蜡块。于前囟后方进行连续冠状切片，片厚5μｍ，进行免疫组织化学染色。
1.4图像分析
每个脑组织样本选取5张切片进行图像分析。在光学显微镜（Olympus/BX41）下分别选取海马区域进行照相，每个区域选择4个不同视野（×200），各切片选择视野位置保持一致。将照片输入计算机后，采用ImageJ软件计算出每张照片中的阳性细胞数目。
1.5统计学分析方法
实验数据建立EXCEL数据库，资料用SPSS17.0来处理。各组数据经过Shapiro-Wilk正态性检验和Bartlett方差齐次检验后，利用单因素方差分析（ANOVA）比较各组之间的差异。其中两组间均数比较采用LSD法。实验数据以均数±标准差( ±s)表示，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。
2结果
2.1脑海马区NGB免疫组化染色结果：
NGB阳性细胞呈棕色，阳性细胞位于神经元的细胞质中。染毒后免疫组化阳性神经细胞数目：与正常对照组相比，各组大鼠海马脑红蛋白阳性神经元数目明显减少，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.O5)；与模型组相比，C、D、E组脑红蛋白阳性神经元数目增多(P<0.O5)，其中高剂量组脑红蛋白阳性神经元数目最多，与模型组相比差异有统计学意义(P<0.O1)。
组别 只数NGB细胞数凋亡细胞数（个）
对照组 10103.83±20.100.60±0.89
模型组 1058.00±8.65 b10.89±1.84b
治疗组A1089.72±10.05ad1.85±1.52d
治疗组B1078.83±11.20bde3.85±1.83de
治疗组C1076.23±10.11bcf4.05±1.61cf
治疗组D1070.35±11.33bcf5.85±1.36cf
注：与对照组相比，aP<0.O5；bP<0.O1；与模型组相比cP<0.O5；dP<0.O1；与治疗组A相比eP<0.O5；fP<0.O1；
3讨论
近年来, 对一氧化碳中毒迟发性脑病发病的病理生理机制陆续提出缺血缺氧、细胞凋亡氧自由基损伤、内源性一氧化氮等主要学说，这些学说都对DEACMP机制的研究产生了积极的推动作用。传统中医认为：一氧化碳中毒属中医戾气中毒之类，此病之发，脑首受其扰。我们实验结果显示：染毒后，各组大鼠海马脑红蛋白阳性神经元数目明显减少，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.O5)；而与模型组相比，血府逐瘀汤各组脑红蛋白阳性神经元数目增多(P<0.O5)，其中高剂量组脑红蛋白阳性神经元数目最多，与模型组相比差异有统计学意义(P<0.O1)。本研究中，我们发现经血府逐瘀汤治疗后，海马区脑红蛋白表达增多，其作用与用药剂量呈正相关。故提示早期予较高剂量的血府逐瘀汤通过上调脑红蛋白的表达，保护脑神经元，可能预防DEACMP的发生。
参考文献：
[1]孙寒静,黎同明,等. 血府逐瘀汤对大鼠局灶性脑缺血模型的保护作用.中医学报,2013, 28(128): 981-983.
[2]王耀宏,赵金垣等.急性一氧化碳中毒迟发性脑病的动物模型制备研究.中国职业医学.2004, 31(1): 5-10.
[3]张婷.中医对一氧化碳中毒迟发性脑病的认识.甘肃科技.2014, 30(10): 132-133.
[4]廖美容,周义杰,苏丹等.新血府逐瘀汤对急性脑梗塞患者同型半胱氨酸的影响研究.黑龙江中医药.2013,27(3): 54-55.
作者简介：
穆永茂，男，1977年生，山西省朔州人，汉族，主治医师，主要从事脑血管病的基础研究。muyongmao@sina.com穆永茂，主治医师，河北省迁安市人民医院重症医学科，河北省唐山市 064400
论文作者:穆永茂1,王艳丽（通讯作者）,王,敏1,李晓玲2,
论文发表刊物:《河南中医》2015年5月供稿
论文发表时间:2015/10/10
标签：氧化碳论文; 剂量论文; 阳性论文; 蛋白论文; 神经元论文; 模型论文; 大鼠论文; 《河南中医》2015年5月供稿论文;