郝彦哲[1]2013年在《慢病毒介导siRNA和细胞内抗病毒因子对HIV抑制作用研究》文中提出随着人类免疫缺陷病毒（HIV）在全球蔓延，HIV感染已成为严重危害人类健康的疾病。高效抗逆转录病毒疗法能够显著地改善AIDS患者的症状，但需要终身用药，药物带来累积性毒性，一旦药物治疗失败就会产生耐药性病毒株。另一方面，现今还未找到一个完全有效的疫苗。随着对控制HIV机制的了解，很多研究者开始将注意力集中在基因治疗，将它作为单独的或者是辅助的治疗方式。RNA干扰技术通过靶向于结构蛋白或者是调节蛋白，已经有效地应用于HIV的基因治疗。由于siRNA在体内不稳定，很快就被降解，体外合成和质粒介导的RNA干扰持续时间较短，不适用于长期抑制基因表达。通过慢病毒载体表达编码siRNA的shRNA在转录水平下调HIV病毒基因从而抑制病毒复制成为基因治疗HIV一种重要的方式。将抗病毒基因导入到干细胞的方式对基因治疗达到长期治疗效果提供了希望。在筛选出针对HIV-1的tat、vpr和rev特异性siRNA的基础上，本研究分别构建了含有相应shRNA序列的重组慢病毒表达质粒，并对靶向基因的干扰效果进行了检测。在此基础上，在293T细胞中包装出含有相应shRNA序列的重组慢病毒并测定病毒滴度。将得到的重组慢病毒感染MT-4细胞，通过嘌呤霉素抗性筛选得到稳定表达siRNA的MT-4细胞系，进行HIV-1NL4-3毒株体外攻击试验，通过检测培养上清中的P24蛋白含量来比较siRNA体外抑制病毒效果。结果表明，靶向于vpr的shRNA可以在转录水平上有效地抑制vpr的表达，抑制率达到88.8%；靶向于tat的shRNA抑制率达到60.2%；稳定表达vprshRNA或tatshRNA的MT-4细胞系能够有效地抑制HIV的复制，短期内培养基中没有HIV的大量复制。基于HARRT治疗的经验，将多个抗HIV基因联合应用同样可能起到更好的抗病毒效果，因此本研究还构建了同时含有靶向于vpr和tat基因的双shRNA的重组慢病毒表达质粒，分别由人U6启动子和H1启动子控制表达；体外与含有vpr及tat基因的质粒共转染表明该重组表达质粒对vpr和tat基因在转录水平上的干扰效果分别达到89.2%和62.0%；将重组慢病毒质粒与病毒包装质粒pNL4-3共转染后，P24定量检测结果显示对HIV病毒包装的抑制率可以达到99.05%，比单独表达靶向于vpr的shRNA或靶向tat的shRNA的抑制率都要高；包装出重组慢病毒后感染MT-4细胞，同样筛选稳定表达siRNA的MT-4细胞系，HIVNL4-3病毒攻击实验表明该细胞系可以有效地抑制病毒的复制。此外，本研究还构建了同时含有基因改造的人源的Trim5a(R332P)和靶向于vpr基因的shRNA的重组慢病毒双表达质粒，分别由巨细胞病毒CMV启动子和U6启动子控制表达，两种抗HIV基因在HIV生命周期的不同阶段通过不同的机制去抑制病毒复制；共转染实验表明重组慢病毒表达质粒表达的vprshRNA可以在转录水平有效地抑制vpr基因的表达，可以达到84.05%，对HIV病毒包装的抑制率可以达到98.45%；Western blot结果表明改造的人源Trim5a(R332P)可以在细胞内表达，在TZM-BL细胞水平通过检测Luciferase表达水平表明人源的Trim5a(R332P)对HIV假病毒的抑制率可以达到63.30%；HIV NL4-3病毒攻击导入该重组慢病毒的阳性MT4细胞实验表明该阳性细胞系可以有效地抑制病毒的复制，证明含有Trim5a(R332P)和vprshRNA表达元件的联合应用具有明显地抗HIV病毒效果。含有siRNA的微粒子是通过细胞胞吐的方式将细胞内表达的siRNA包裹着细胞膜分泌到细胞外。细胞膜成分不仅可以提高siRNA的体外稳定性，而且由于生物膜成分的相似性可提高siRNA导入靶细胞的效率。为降低其免疫原性和提高亲和性，本研究选用低免疫原性的脐带间充质干细胞作为微粒子的制备宿主细胞。首先，通过重组慢病毒感染的方式将人端粒酶催化亚基（hTERT）导入细胞，提高间充质干细胞的分化增殖能力，并对传代后细胞的干细胞性进行检测。其次，导入含有靶向HIV-1的shRNA的重组慢病毒建立了能够持续产生细胞微粒子的间充质干细胞系。结果表明，筛选到的阳性hucMSCs克隆在基因组DNA和mRNA水平检测了hTERT基因的表达水平；该细胞系在体外已经持续培养105代，远远超过人脐带间充质干细胞的分裂增值界限；TRAP-PCR证实该细胞系恢复了端粒酶活性；流式细胞仪结果显示建立的hucMSCs-htert细胞表面有人间充质干细胞特异性表面标记，如CD29，CD44和CD105，不表达CD106、CD45、CD19和HLA-DR；hucMSCs-htert细胞在刺激成骨培养基中培养后，碱性磷酸酶染色表明细胞能够向成骨细胞进行分化，证明该细胞系仍然保持体外分化的潜能；核型分析表明该细胞具有46XY二倍体核型，在SCID小鼠体内不能形成肿瘤，表明该细胞还没有致瘤倾向，是安全的。并对细胞微粒子的制备、对靶向基因的抑制效果进行了初步研究，该细胞微粒可以用于HIV的基因治疗。综上所述，本研究采用慢病毒介导靶向于HIV-1调控基因的单个shRNA、双shRNA、经基因改造过的Trim5a(R332P)和vprshRNA组合的重组慢病毒载体，并且检测了它们对HIV的抑制效果。抗HIV重组慢病毒载体可以有效地感染人脐带造血干细胞，两种shRNA共同应用及不同抗HIV基因的联合应用为HIV的基因治疗提供了新的策略。另外成功地建立了永生化的人脐带间充质干细胞系，证明了外源表达人端粒酶催化亚基可以重构端粒酶的活性并能够增强细胞的增值活性；该细胞系维持了细胞的形态、细胞表面抗原和正常的二倍体细胞核型，在继代培养中仍保持了分化潜能，在SCID小鼠体内没有形成肿瘤，该细胞系为基因治疗、细胞治疗和组织工程提供了充足的细胞来源。该细胞系免疫原性非常低，被应用于制备含有靶向于HIV-1基因的成熟的siRNA的生物纳米微粒子，作为新型的HIV的基因治疗的一种方式。
周云, 王芳宇[2]2013年在《艾滋病治疗方法的比较》文中认为获得性免疫缺陷综合征(Acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)简称艾滋病,是由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)感染而引起的慢性致死性疾病。全球对AIDS的防治工作都高度重视,近年来在AIDS的治疗研究方面取得了显著成果,但也存在不足和困难。文章综述了中医药治疗、靶向蛋白质的药物治疗和靶向基因的药物治疗在AIDS治疗过程中的优势与不足。
周芳[3]2012年在《靶向基因shRNA干扰家蚕及猪若干病毒的复制和增殖研究》文中进行了进一步梳理RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达,所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病的基因治疗领域。1猪圆环病毒(Porcine circovirus2, PVC2)病毒是我国猪场疫病复杂的重要原因,可以说它对养猪产业正常维持带来了极大的困难,对我国养猪产业的影响目前受到了仅次于高致病性蓝耳病的空前关注,且目前尚无有效疫苗与治疗方法。本文根据PVC2型病毒-Rep、Cap和ORF3/ORF4基因的结构序列和shRNA序列设计原则,进行地毯式搜索并设计合成了139对针对PVC2型病毒-Rep蛋白基因、134对针对PVC2型病毒-Cap蛋白基因、18对针对PVC2型病毒-ORF3/ORF4基因的shRNA序列,共计291对PVC2型病毒靶向shRNA。(?)设计合成的291对shRNAs连接到线性化的RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen载体上,构建成RNA干扰载体。分别在转染试剂介导下导入无PCV2污染的猪肾PK15细胞,24小时后进行荧光观察,确定转染效率。并在转染24小时后对细胞接种PCV2病毒,接毒72小时后收集细胞,通过Real-Time PCR方法检测细胞中病毒的相对表达量,从而分析所设计的shRNA对PCV2病毒的抑制作用。结果表明,针对Rep基因序列设计的139对shRNAs中,pSIREN-REP-C, pSIREN-REP-4, pSIREN-REP-23', pSIREN-REP-30', pSIREN-REP-33', pSIREN-REP-67', pSIREN-REP-75', pSIREN-REP-80'共8个序列表现出对PVC2病毒复制与增殖的抑制作用；针对Cap基因序列所设计的134对shRNAs中,pSIREN-Cap-3, pSIREN-Cap-5, pSIREN-Cap-C11', pSIREN-Cap-14, pSIREN-Cap-80共5个序列表现出对PVC2病毒复制增殖的抑制作用,而针对ORF3和ORF4所设计的18对shRNAs并没有表现出较显著的对PVC2病毒复制增殖的抑制作用。综上所述,以上对PCV2具有显著抗病毒能力的shRNA靶向基因序列可作为转基因的候选shRNA序列。2猪繁殖与呼吸综合症(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS)俗称猪蓝耳病,是一种新的猪传染病,能够引起母猪的生殖障碍及仔猪的呼吸道症状,在世界各地危害很大。猪生殖和呼吸系统综合症病毒(PRRSV)由ORF5、ORF6分别编码的GP5、M蛋白是PRRSV病毒的主要结构蛋白,它们在病毒的致病性、病毒复制、病毒装配、病毒变异和保护性反应等方面具有重要意义。本文根据猪蓝耳病病毒PRRSV-ORF5及PRRSV-ORF6的基因结构序列和shRNA序列设计原则,分别设计和合成了5对针对PRRSV-ORF5,5对针对PRRSV-ORF6编码蛋白基因序列的靶向shRNA。(?)设计合成的shRNA连接到线性化的RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen载体上,构建成RNA干扰载体。将上述质粒DNA,分别在转染试剂介导下导入Marc-145细胞,24小时后进行荧光观察,确定转染效率。同时,转染细胞接种PRRSV病毒,72小时后收集细胞,通过Real-Time PCR方法检测病毒感染后的相对表达量,分析所设计的shRNA对PRRSV病毒的抑制作用。结果表明,分别针对ORF5和ORF6设计的共10对shRNAs均表现出抑制PRRSV病毒增殖复制的作用,但不同shRNA的抑制效果存在差异(0.71%-67.52%)。其中以ORF6-6e的病毒相对表达量最低,细胞内病毒表达量仅为0.71%,即抗病毒能力最强,因此该序列可作为转基因的候选shRNA序列。采用piggyBac转座子构建转座载体,为了便于筛选,以RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen载体为模板进行PCR扩增,得到ZsGFP基因,连接到PXL-BACⅡ上形成重组载体PXL-BACⅡ-ZsGFP;再以pSilencer4.1-CMVneo载体为模板进行PCR扩增,得到Neomycinr基因,与PXL-BACⅡ-ZsGFP连接,形成重组载体PXL-BACⅡ-ZsGFP-Neo。为了后期能将这两个筛选基因给剔除掉,又在ZsGFP基因和Neomycinr基因的两端加入了FRT位点,形成最终的转座载体PXL-BACⅡ-FRT-ZsGFP-Neo.最后将在上述活性筛选试验中挑选的具有最佳抗病毒能力的shRNA (ORF6-6e)构建到该转座载体,命名为PXL-BACⅡ-FRT-ZsGFP-Neo-shRNA。该转基因载体同时具有筛选基因和标记基因,便于进行转基因细胞的建立。该细胞株可稳定传代,以细胞基因组和RNA反转录产物cDNA为模板,分别经PCR和RT-PCR确认,表明转基因细胞中外源基因shRNA转录框、标记基因GFP和筛选基因Neo均可正常转录和表达。该细胞株相对于正常Marc-145细胞具有较显著的抗病毒能力,病毒相对表达量仅为0.01%,表明病毒在该转基因细胞内无法复制增殖。该研究为抗PRRSV病毒转基因猪品种的培育与鉴定建立了方法,奠定了基础。3家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV)所引起的血液型脓病,是家蚕病毒病的主要类型,是在我国乃至世界养蚕业危害较为严重的一种病毒病。家蚕抗病能力除了作为宿主本身的家蚕抗性机理外,作为病原一方的复制增殖也同样重要,正所谓“无菌不成病”。本文正是从BmNPV在家蚕体内的复制繁殖的角度开展研究。以BmNPV病毒的结构序列和shRNA序列设计原则,分别针对病毒复制增殖所必需的极早期表达因子ie-1,晚期表达因子lef-1, lef-2和lef-3等靶基因设计合成32对shRNA,以BmN细胞基因组为模板,通过PCR方法扩增得到BmU6启动子,构建重组载体PXL-BACII-GFP-BmU6-shRNA.将上述质粒DNA转染家蚕BmN细胞后接种BmNPV病毒,72小时后收集细胞,采用Real-Time PCR方法检测病毒感染细胞后的相对表达量,以分析不同shRNA的抑制病毒复制与增殖活性。结果表明：shRNAs均表现出对BmNPV的抗病毒能力,但效果大有不同。其中,靶基因序列长度为21bp的shRNA-ie1c表现出对BmNPV复制增殖具有极显著的抑制作用,病毒相对表达量仅为5.5%,其次为Lef3e-2。与此同时,本试验还设计并比较了不同靶序列长度：19bp和21bp在抑制BmNPV病毒增殖复制时的作用和差别。结果表明,leflb(85%)和lef1b-2(29%), Ief2d (91%)和lef2d-2(38%)的抗病毒能力效果差异显著,靶序列长度为21bp的病毒相对表达量较19bp病毒相对表达量分别减少56%和53%,说明shRNA干扰靶序列长度为21bp的RNA干扰病毒复制增殖效果优于19bp。经shRNA活性筛选32对特异干扰靶向shRNA,分别针对极早期表达因子ie-1和晚期表达因子lef3的ie1c和lef3e-2表现出良好的抑制BmNPV的作用,因此将iel c和leBe-2作为转基因的候选shRNA序列,构建到含有筛选基因Neo的转座重组载体上,并构建单联和双联重组转座子载体,分别命名为PXL-B ACII-GFP-BmU6-shRNA(ie1c)-Neo和PXL-B ACII-GFP-double(ie1c/lef3e2)-Neo.在细胞水平进行转基因研究,建立含抗BmNPV病毒shRNA的转基因细胞,评价其抑制病毒增殖活性。结果表明单联重组转座载体构建的转基因细胞相对于正常BmN细胞具有较显著的抗病毒能力：病毒感染0-24h,对照组细胞与转基因细胞内的病毒相对表达量均较低,分别为7.15%和0.45%,尽管在病毒感染初期,病毒DNA刚开始复制,仍可见转基因细胞已初步表现出抗病毒增殖的能力；24-48h,对照组细胞内病毒表达量呈指数增长趋势(56.23%),增加了49.08%,而转基因细胞组病毒相对表达量仍能维持较低水平(7.04%)；48-96h,对照组细胞与转基因细胞组的病毒相对表达量处于稳定期,对照组病毒表达量始终维持较高水平(56.23%-64.03%),高于转基因细胞组约47%-52%；病毒感染96h后,正常细胞组的病毒相对表达量又呈现增长趋势,约90%细胞的核内充满多角体,细胞死亡率上升,同时,随着病毒感染时间的延长,转基因细胞组抑制病毒复制增殖效果略有下降,但转基因细胞病毒相对表达量仍低于对照组细胞约30%-50%。因此,在感染BmNPV后0-96h内,转基因细胞表现出较好的抑制病毒增殖与复制的能力。双联重组转座载体中含有上述活性检测选出的两条效果最好的shRNAs (ielc/lef3e2),其转基因细胞的病毒相对表达量为42.49%,虽然较正常BmN细胞内病毒表达量低,但是其抗病毒效果显著低于单联转座的转基因细胞(7.04%)的抗病毒能力。通过PCR、RT-PCR等方法确定转基因细胞中外源基因均能正常转录和表达,并采用Splinkerette-PCR方法经NCBI Blast检索分析外源基因插入位点。该研究结果为抗BmNPV转基因家蚕的培育以及鉴定奠定了基础。
郝彦哲, 滕智平, 杨怡姝, 孙晓娜, 马晶[4]2013年在《慢病毒介导双shRNA靶向于HIV的抑制作用研究》文中研究指明RNA干扰可以有效地抑制特定基因的表达,在HIV基因治疗中成为一种重要的方法。为了防止病毒逃逸株的出现,本研究分别构建了靶向于HIV-1调控蛋白基因vpr和tat的shRNA重组慢病毒载体以及含有这两种shRNA的双表达重组慢病毒载体,分别由U6和H1两种启动子启动,通过与靶向基因tat和vpr表达质粒在293T细胞中进行共转染,采用荧光定量PCR方法测定细胞内靶向基因的表达丰度,结果显示双表达shRNA的重组慢病毒载体对vpr和tat的表达抑制率分别可以达到89.20%和62.00%。与pNL4-3病毒包装质粒共转染,P24ELISA显示plvx-vpr-tat shRNA对病毒包装产量的抑制率可以达到99.05%,比单个shRNA的抑制率都要强,HIV-1NL4-3体外对MT4细胞攻毒实验表明双shRNA重组慢病毒载体具有很强的抑制病毒复制的能力。
参考文献：
[1]. 慢病毒介导siRNA和细胞内抗病毒因子对HIV抑制作用研究[D]. 郝彦哲. 北京工业大学. 2013
[2]. 艾滋病治疗方法的比较[J]. 周云, 王芳宇. 衡阳师范学院学报. 2013
[3]. 靶向基因shRNA干扰家蚕及猪若干病毒的复制和增殖研究[D]. 周芳. 浙江大学. 2012
[4]. 慢病毒介导双shRNA靶向于HIV的抑制作用研究[J]. 郝彦哲, 滕智平, 杨怡姝, 孙晓娜, 马晶. 病毒学报. 2013
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