长沙医学院 湖南长沙 410219
摘要：目的 建立HPLC法测定功能饮料脉动中维生素C的含量。 方法 采用色谱柱PE.Spheri-5 RP-18柱（250×4.6mm,5μm），流动相为甲醇-0.02mol.L-1磷酸二氢钾缓冲液(75：25)，流速为0.8mL/min，检测波长为295nm，柱温为25℃。 结果 维生素C进样量在0.1～6ug内线性关系良好(R=0.9996，n=6)，平均加样回收率为99.5%，RSD=0.51%（n=9）。 结论 本法操作简单快速、灵敏度高、专属性强，可用于功能饮料中维生素C的直接测定。
关键词 : HPLC；维生素C；含量测定
Determination of vitamin C in functional drinks of Mai Dong by HPLC
MA Shi-Yong,Li Fang,Wang Jia-Feng,Li Qiao,Wei Dan-Dan*
(Changsha Medical University,HuNan ChangSha 410219)
Abstract: Objective: To develop an HPLC method for the Determination of vitamin C in functional drinks of Mai Dong.
Methods: PE.Spheri-5RP-18（250×4.6mm,5μm）was used, The mobile phase consisted of methanol and phosphoric buffer liquid (75:25),The flow rate was 0.8mL.min-1 .The UV detector wavelength was 295nm .
Results: The calibration curve showed good linearity in the range of 0.1～6ug for vitamin C(R=0.9996，n=6),The average overall recovery was 99.51%,and RSD(n=9) value was 0.51%（n=9）.
Conclusion :The HPLC method is simple rapid ,sensitive and cheap for directly determining vitamin C in function drink.
Key words : HPLC; vitamin C ;determination
当今世界功能饮料市场蓬勃发展，预计未来功能饮料带动全球软饮料市场的发展[1]。也为我国饮料行业展现了新的潮流和方向[2]。功能饮料以脉动最为常见，是含水溶维生素群的维生素类功能饮料，作为维生素家族之一的维生素C是人体健康必不可少的[3]。
维生素C又称抗坏血酸，参与体内细胞氨基酸代谢[4]、神经递质合成、增加对感染抵抗作用以及预防癌症、提高机体的免疫功能作用，是维持正常生命过程所必需的。由于维生素C的医用价值高又是一种理想的食品添加剂，而且市场上有很多食品都标注含有维生素C，所以对它的测定研究也得到了广泛的重视，同时测定各类食品中特别是功能饮料中维生素C的含量是十分重要和必要的。
目前，测定维生素C含量的方法有很多，如2，6一二氯靛酚钠法、碘量法、高效液相色谱法、分光光度法、原子吸收光谱法、毛细管电泳法、褪色光度法等。但是其中一些方法的选择性较差，检测方法操作步骤复杂，试剂和试样溶液不稳定、灵敏度低、费时等缺点，尤其是颜色深的试样，其溶液颜色背景干扰大[13]。而近年来发展的高效液相色谱法来测定维生素C的含量，它具有高效、快速、稳定、可靠及测定费用低等特点，且分析周期短，特别适合于饮料等食品中维生素C含量的快速测定。
本文建立了HPLC法测定功能饮料脉动中维生素C含量的方法，为今后功能饮料中维生素的含量测定控制标准提供了一定的参考价值。
1仪器与试药
1.1 仪器 LC-UV600液相色谱仪（南京科捷仪器有限公司）；Uitra pure型超纯水机（上海和泰仪器有限公司）；759S紫外分光光度仪（上海菁华科技仪器有限公司）；KQ-300E型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；Mettler AL204电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；PHS-3C型pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；
1.2 药品 抗坏血酸（分析纯，广东.汕头市西陇化工厂）；脉动饮料（乐百氏（广东）食品饮料有限公司）；
1.3 试剂 甲醇（色谱纯，天津市大茂化学试剂厂）；磷酸二氢钾（分析纯，天津市博迪化工有限公司）；磷酸（分析纯，湖南师大化学实验室）。
2 方法与结果
2.1溶液的制备
2.1.1 对照品溶液的制备
取维生素C对照品10mg，精密称定，置100mL棕色容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。再精密量取该溶液1.0mL，置50mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，超声40min，即得对照品溶液。
2.1.2 供试品溶液的制备
精密量取脉动饮料1mL，置10mL的棕色容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，超声40 min，即得供试品溶液。
2.1.3 阴性对照溶液的制备
用除维生素C之外其他成分都含有的功能饮料作为空白溶液，按照2.1.3项下制备成阴性对照品溶液。
2.2 色谱条件
色谱柱：PE.Spheri-5 RP-18柱（250×4.6mm,5μm）；流动相：甲醇-0.02mol.L-1磷酸二氢钾缓冲液(75：25)；流速为0.8mL/min；检测波长为295nm；柱温为25℃；
进样量20uL。色谱图见图1。
A 阴性样品 B 维生素C对照品 C 供试品
图1 脉动饮料HPLC色谱图
从图B和图C可知对照品和供试品的维生素C的保留时间一致，都是3.56min。从图A和图C可知其它成分对样品的测定无干扰，方法特异性强。
2.3 标准曲线和线性范围
称取维生素C的对照品0.01g，精密称定,置于100mL棕色容量瓶中，用流动相溶解定容。配制成一系列浓度为5 μg.mL-1、1O μg.mL-1、15 μg.mL-1、2Oμg.mL-1、 25μg.mL-1、3Oμg.mL-1标准溶液，溶液用0.45μm的滤膜(水型)过滤后用进样器吸取20μL，注入液相色谱仪，进样测定，测定结果经线性回归，线性范围为5～30μg.mL-1，回归方程（y为峰面积，X为浓度，μg.mL-1）： y=786.53x+11888，相关系数为0.9996。
表1 维生素C进样浓度与峰面积的关系
2.4 精密度实验
称取维生素C的对照品约0.01g，精密称定,置于100mL棕色容量瓶中，用流动相溶解定容。移取5mL上述溶液至50mL棕色容量瓶中，再用流动相溶液稀释定容。所得到的溶液浓度为0.0101g·mL-1，在相同条件下，连续进行6次平行考察方法的精密度结果见表2；结果（表2）表明，测定结果的相对标准偏差为0.19%，精密度良好。
表2 精密度实验结果
2.6 加样回收率实验
精密量取已知含量的供试品溶液9份，每份10.0mL，精密加入相当于含有量的120%、100%、80%的维生素C，置100mL棕色容量瓶中，分别制备成高、中、低浓度的供试品溶液各三份，按供试品溶液方法进行制备后，进样测定，测定结果见表4。结果（表4）表明，高、中、低三浓度的平均回收率分别为99.3%、99.0%、99.1%。
表4 加样回收率测定结果
3讨论
3.1 流动相的选择
本方法在文献的基础上曾采用甲醇-（0.02mol.L-1）醋酸铵(25:75)作为流动相，结果发现色谱峰有重叠、色谱峰出峰太早、醋酸根对维生素C的测定有干扰。
调整流动相：分别用甲醇-0.02mol·L-1 醋酸铵、甲醇-0.02mol·L-1 磷酸二氢钾溶液按照25:75的比例作为流动相，配制浓度为0.0101g·mL -1维生素C 对照品溶液，然后分别注入色谱仪，记录色谱图，见图2。
图A：流动相为甲醇-0.02mol·L-1 磷酸二氢钾
图B：流动相为甲醇-0.02mol·L-1 醋酸铵
图2 不同流动相项下维生素C色谱图
故通过调整将流动相改为甲醇：磷酸二氢钾；磷酸二氢钾的浓度从0.02mol.L-1调到0.04mol.L-1，对峰形及保留时间没有明显的影响，考虑对柱子的保护选择低浓度的磷酸二氢钾（0.02mol.L-1）溶液。
3.2 流速的选择
流速从1.0mL/min降为0.8mL/min，保留时间延长，且最后的保留时间为3.56，最后将流速定为0.8mL/min。
3.3 检测波长的选择
用流动相配置成20μg·mL-1对照品溶液，采用紫外分光光度仪在275～400nm内扫描，测定并确定维生素C的最大吸收波长295nm。
参考文献
[1]文剑.功能饮料市场现状及未来发展方向[J]. 食品与发酵工业, 2007, 33(4): 101-106.
[2]刘敏,郑伟涛.测定功能性饮料中多种B族维生素的含量[J].饮料工业.2006.9(1)：39-41.
[3]刘洪, 黄丽彬, 刘静. 功能饮料现状及新品开发[J]. 饮料工业, 2004, 7(5): 8-10.
[4]罗魏, 刘学文, 王永欢, 等. 功能性饮料的发展现状及展望[J]. 食品工业科技, 2011 (2): 418-421.
通讯作者简介：魏丹丹（1983-），女，讲师，硕士，主要从事药物化学和药物分析的教学和研究。
论文作者:马世勇 李芳 王佳凤 魏丹丹
论文发表刊物:《健康前沿》2016年3月
论文发表时间:2016/6/14
标签：维生素论文; 溶液论文; 饮料论文; 色谱论文; 功能论文; 甲醇论文; 磷酸论文; 《健康前沿》2016年3月论文;