温昌泓1 左宏笛2（通讯作者）
（1贵州省食品药品检验所 贵州贵阳 550004）
（2贵阳市食品药品检验检测中心 贵州贵阳 550004）
【摘要】目的 建立测定柏栀祛湿洗液中绿原酸和黄芩苷含量的方法。方法 采用高效液相色谱法。色谱柱为Hypersil ODS2C18柱，流动相为乙腈-0.4%磷酸水溶液(梯度洗脱)，流速为1.0ml/min，柱温为35℃，检测波长为318nm。结果 绿原酸的进样量在0.06512～0.5861μg范围内与其峰面积积分值呈良好的线性关系（r=1.000 0）；黄芩苷的进样量在0.1246～1.121μg范围内与其峰面积积分值呈良好的线性关系（r=1.000 0）；精密度、稳定性、重复性试验的RSD均≤1.6%。平均加样回收率：绿原酸为98.71%，RSD=1.2%（n=6），黄芩苷为102.84%，RSD=1.5%（n=6）。结论 本方法便捷、准确、重复性好，适用于柏栀祛湿洗液的质量控制。
【关键词】 柏栀祛湿洗液 绿原酸 黄芩苷 高效液相色谱法 含量测定
【中图分类号】R927.2 【文献标识码】B 【文章编号】2095-1752（2014）02-0343-02
柏栀祛湿洗液由黄柏、黄芩、大黄、栀子、金银花等20味药物组成，具有清热解毒、祛湿止带之功效，用于霉菌性阴道炎，滴虫性阴道炎证见带下量多，色黄，阴痒等的治疗，方中金银花具有清热解毒，疏散风热的功能，其中绿原酸为其主要有效成分，被证明具有抗菌、抗病毒等多种作用[1];黄芩具有清热燥湿，泻火解毒的功效，其中黄芩苷被发现具有抗菌、抗病毒等多种作用[2]。柏栀祛湿洗液现行标准[3]中无含量测定控制。为了更好有效地控制本品质量，保证临床用药安全、有效，本实验参考有关文献[4-7]，选用HPLC法对制剂中绿原酸和黄芩苷的含量测定研究，建立了分离效果好，便捷可行的含量测定方法，可用于该制剂的质量控制。
1 材料
1.1 仪器、
Agilent 1100型高效液相色谱仪(二极管阵列检测器)及其色谱工作站数据处理系统;XS205型双量程电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。
1.2 药品与试剂
绿原酸、黄芩苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110753-200012、715-200010，供含量测定用）；柏栀祛湿洗液（贵州浩诚药业有限公司，批号：20070601、20070602、20070603）：乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯，水为重蒸馏水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件与系统适用性
色谱柱：Hypersil ODS2C18柱(4.6mm×200mm,5μm);流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.4%磷酸水溶液,梯度洗脱程序见表1；流速：1.0ml/min;柱温：35℃；检测波长：318nm；进样量：10μl。在上述色谱条件下，样品中绿原酸色谱峰、黄芩苷色谱峰与其他成分的色谱峰能达到较好的基线分离，分离度大于1.5，理论板数以绿原酸峰和黄芩苷峰计算应不低于5000。
表1 梯度洗脱程序
Tab1 Gradient elution process
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取绿原酸对照品16.28mg、黄芩苷对照品15.57mg，分别置于100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得储备溶液（绿原酸浓度0.1628mg/ml,黄芩苷浓度0.1557mg/ml),并于10℃以下保存。分别精密量取上述对照品储备溶液10ml与20ml，置于一50ml量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液（绿原酸浓度0.03256mg/ml,黄芩苷浓度0.06228mg/ml)。
2.2.2 供试品溶液的制备 精密量取样品10ml,置50ml量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45?m）滤过，作为供试品溶液。
2.2.3 阴性对照溶液的制备 贵州浩诚药业有限公司提供，照“2.2.2”项下方法制备阴性对照溶液。
2.3 专属性试验
精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液与阴性对照溶液各10μl，分别注入HPLC仪进样，记录色谱图。结果表明，供试品色谱中呈现与对照品色谱保留时间一致的色谱峰，阴性对照对测定无干扰。色谱见图1。
图1 高效液相色谱图
A．对照品；B.供试品；C.阴性对照(缺金银花);D.阴性对照(缺黄芩);1.绿原酸 2.黄芩苷
2.4 线性关系考察
分别精密吸取“2.2.1”项下的对照品溶液2、6、10、14、18μl，按“2.1”项下色谱条件进行测定。以进样量（x,μg）为横坐标，相应峰面积(y)为纵坐标，进行线性回归。得绿原酸回归方程Y=2719.28X-2.28（r=1.000 0），黄芩苷回归方程Y=2020.40X-2.47（r=1.000 0）。结果表明，绿原酸的进样量在0.06512～0.5861μg范围内与其峰面积积分值呈良好的线性关系，黄芩苷的进样量在0.1246～1.121μg范围内与其峰面积积分值呈良好的线性关系。
2.5 精密度试验
精密吸取“2.2.1”项下的对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件进样重复测定6次。结果，绿原酸RSD=1.1%，黄芩苷RSD=1.4%，表明仪器精密度良好。
2.6 稳定性试验
精密吸取“2.2.2”项下同一供试品溶液（批号：20070601）适量，按“2.1”项下色谱条件分别于配制后0,4,8,14,24,36h依次进样测定。结果，绿原酸峰面积与黄芩苷峰面积基本不变，RSD分别为1.6%和1.2%，表明供试品溶液在36h内基本稳定。
2.7 重复性试验
精密吸取同一批号样品（批号：20070601）适量，共6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定和计算。结果，绿原酸平均含量为0.163mg/ml(RSD=1.5%),黄芩苷平均含0.290mg/ml(RSD=1.1%)，表明本方法重复性良好。
2.8 加样回收率试验
精密吸取已知含量的本品内容物5.00ml，共6份，分别置于50ml量瓶中，分别加入绿原酸对照品储备溶液5ml与黄芩苷对照品储备溶液10ml，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率，结果见表2、表3。
表2 绿原酸的加样回收率试验结果（n=6）
Tab2 Results of recovery tests of chlorogenic acid（n=6）
2.9 样品含量测定结果
分别取3批样品适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算含量。结果见表4。
表4 样品含量测定结果（n=3）
Tab4 Results of content determination of samples（n=3）
图2 紫外光谱图
A. 黄芩苷;B. 绿原酸
3.2 色谱流动相的选择
绿原酸与黄芩苷均显弱酸性，但极性有较大差异，试验发现，采用等度洗脱无法同时测定二者含量，参考有关文献[4-7]，分别考察了以甲醇-0.2%磷酸水溶液、甲醇-0.4%磷酸水溶、乙腈-0.1%磷酸水溶、乙腈-0.4%磷酸水溶等系统作为流动相，梯度洗脱的试验结果，发现以甲醇-0.2%磷酸水溶及乙腈-0.1%磷酸水溶为流动相时，分离度差且基线较明显漂移，以乙腈-0.1%磷酸水溶为流动相时，分离度较差，以乙腈-0.4%磷酸水溶为流动相能实现完全分离且基线无明显漂移。
参考文献
[1] 吴卫华，康桢，欧阳冬生等．绿原酸的药理学研究进展[J]．天然产物研究与开发，2006，18:691－694.
[2] 初正云，初明，滕宇.黄芩苷体内抗流感病毒作用[J]．中国中药杂志，2007，32(22):2413－2415.
[3] 柏栀祛湿洗液.国家药品监督管理局标准（试行）：WS-5886(B-0886)-2002.
[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社.2010:205-206.282-283.
[5] 胡春湘，陈忠梁，张正光.HPLC法测定银黄片中绿原酸和黄芩苷的含量[J]．中成药，2003,25（5）：418.
[6] 钱江.HPLC法测定银黄口服液中绿原酸和黄芩苷的含量[J]．中成药，2003,25（2）：116.
[7] 杨秀娟，王坤.高效液相色谱法测定银黄冲剂中绿原酸和黄芩苷的含量[J].中国药事，2004,18（12）：752.
论文作者:温昌泓1,左宏笛2
论文发表刊物:《医药前沿》2014年第2期供稿
论文发表时间:2014-4-14
标签：黄芩论文; 色谱论文; 溶液论文; 含量论文; 精密论文; 磷酸论文; 阴性论文; 《医药前沿》2014年第2期供稿论文;