申传安[1]2003年在《烧伤脓毒症骨骼肌蛋白降解增强的机制研究》文中研究说明烧伤脓毒症是重症烧伤常见而严重的并发症之一，其来势凶猛，病程进展快，常并发MODS，若得不到及时有效的防治，病死率较高。负氮平衡是烧伤脓毒症时蛋白降解增强的重要代谢特征，占机体细胞干重50％强的骨骼肌蛋白高分解代谢是负氮平衡的主要原因之一。但目前烧伤脓毒症时骨胳肌蛋白高分解代谢的机制尚未完全阐明。 研究目的 我们既往的研究发现，烧伤脓毒症大鼠骨骼肌蛋白降解率与血内糖皮质激素以及TNF(肿瘤坏死因子)-α、白细胞介素(IL)-6等炎性介质的浓度关系密切。此外，机体细胞内有多种蛋白降解途径，那种途径在烧伤脓毒症骨骼肌蛋白高分解代谢中扮演主要角色呢?泛素系统是近年来新发现的蛋白降解途径，目前研究认为该系统在骨骼肌蛋白高分解代谢中有重要作用。我们的实验也发现，烧伤脓毒症大鼠骨骼肌内泛素系统的基因和蛋白表达显著增强。基于以上研究，本实验试图通过动物实验、离体组织孵育、细胞培养和临床观察四个方面，进一步探讨糖皮质激素、炎性介质以及泛素系统在烧伤脓毒症骨骼肌蛋白高分解代谢中的作用及其分子生物学机制。 材料和方法 1．动物实验 (1) 分别给正常大鼠注射不同剂量的地塞米松或TNF-α，离体孵育伸趾长肌，高效液相色谱法测定总蛋白和肌纤维蛋白降解率，核糖核酸印迹法和免疫组织化学染色法分析泛素系统的基因和蛋白表达变化。 (2) 使用含有TNF-α的孵育液，离体孵育大鼠伸趾长肌，分析蛋白降解率以及泛素系统的基因和蛋白表达变化。 (3) 建立大鼠烧伤脓毒症模型，结合使用糖皮质激素拮抗剂 漱 要 军医进修学院硕土论文 RU朋486干预，分析骨骼肌蛋白降解率以及泛素系统的基因和蛋白表 达变化。通过放免法测定血内皮质醇和炎性介质浓度变化。 2．骨骼肌细胞培养 （1）建立稳定的大鼠骨骼肌细胞离体培养增殖、融合方法。 （2）L－「3，5－3H卜酪氨酸标记肌管蛋白合成。 （3）使用含有不同浓度地塞米松或TNF－口的培养液，井结合使 用蛋白酶体抑制剂MG 32培养肌管，于不同时间点收集标本。液闪 计数仪测定肌管卜【3，5－3H卜酪氨酸的释放量，计算短寿命、长寿命 蛋白降解率。分析肌管内泛素系统的基因表达变化。 3．临床部分采集患者（9例大面积烧伤病人，9例整形待手 术患者）的骨骼肌（肪二头肌、股四头肌）以及血、尿标本，检测 血内皮质醇和炎性介质浓度以及尿内3－甲基组氨酸含量变化，分析 骨骼肌内泛素系统的基因和蛋白表达变化。 一 1．糖皮质激素与骨骼肌蛋白代谢 山地塞米松能显著增强大鼠骨骼肌泛素系统基因和蛋白的表 达以及骨骼肌总蛋白，特别是肌纤维蛋白的降解率，在一定范围内， 此作用呈剂量依赖关系。糖皮质激素受体桔抗剂RU38486能阻断此 作用。 （2）糖皮质激素受体桔抗剂RU38486能显著抑制烧伤脓毒症大 鼠骨骼肌泛素系统基因和蛋白的表达，降低骨骼肌蛋白降解率。 （3）地塞米松能上调肌管内泛素系统的基因表达，增强肌管蛋白 降解率，此效应在一定范围内呈剂量依赖关系。蛋白酶体抑制剂 MG 32能阻断地塞米松对肌管蛋白降解率的增强作用。 2．TNP与骨骼肌蛋白代谢 ＊）静脉注射TNF－a能上调骨骼肌泛素系统的基因和蛋白的表 达，增强大鼠骨骼肌蛋白降解，而此作用能被糖皮质激素受体桔抗 剂RU38486部分阻断，提示TNF－Q增强骨骼肌蛋白降解的作用在一 定程度上是由糖皮质激素所介导。 3 粉 要 军医进修学院硕士论文 C 离体孵育实验发现，TNF－口能直接作用于骨骼肌组织，增强 泛素蛋白酶体途径的活性，但TNF－a能否直接增强骨骼肌蛋白分解 代谢尚有待进一步探讨。 ＊细胞培养实验发现，TNF－口既能上调肌管内泛素系统的基因 表达，也能增强肌管蛋白降解率，蛋白酶体抑制剂MG132能阻断TNF－ a对肌管蛋白降解率的增强作用。
王晓鹃[2]2011年在《糖皮质激素影响肉仔鸡骨骼肌脂肪代谢的机制研究》文中研究表明本研究利用外源导入糖皮质激素(地塞米松)的方法,从活体和离体两个模型探讨糖皮质激素导致肉仔鸡骨骼肌脂肪代谢发生改变的机制。活体试验中,从脂肪酸摄取转运和氧化利用两个方面入手,分别研究了糖皮质激素对肉鸡相对生长高峰期和绝对生长高峰期骨骼肌组织脂肪沉积的影响,以及日粮脂肪酸对糖皮质激素调节效应的互作,初步探索糖皮质激素调控骨骼肌脂肪代谢的作用通路。此外通过体外成肌细胞模型,探索糖皮质激素和胰岛素两种激素对肌细胞脂肪代谢的调控,并进一步验证糖皮质激素调控肌细胞脂肪代谢的信号通路。糖皮质激素对肉鸡相对生长高峰期骨骼肌脂肪代谢的影响选取7d Arbor Acres雄性肉鸡,分为DEX组(DEX)、对照组(Control)和限饲组(FR)。DEX组每天皮下注射地塞米松(2.0mg/Kg体重),自由采食和饮水;对照组注射与DEX组相同剂量的生理盐水,自由采食和饮水;限饲组注射与DEX组相同剂量的生理盐水,同时饲喂DEX组前一天的采食量。处理3d后发现,DEX处理导致肉仔鸡体增重和饲料转化率降低,骨骼肌生长受阻而脂肪含量增加,同时血浆中极低密度脂蛋白(VLDL)增加;腿肌肝型肉碱脂酰转移酶1(L-CPT1)和AMP激酶α2(AMPKα2)mRNA水平下调,表明脂肪氧化受损,DEX没有影响脂蛋白酯酶(LPL)、脂肪酸转运蛋白1(FATP1)、心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)和长链乙酰辅酶A脱氢酶(LCAD)的mRNA水平,以及LPL和AMPK的活性;相反,限饲上调骨骼肌LPL、L-CPT1和LCADmRNA水平,腿肌FATP1、H-FABP的mRNA水平,从而促进脂肪氧化。结果显示,DEX未影响骨骼肌脂肪酸摄取但抑制其氧化。与糖皮质激素不同,限饲有利于肉鸡骨骼肌脂肪酸氧化。糖皮质激素对肉鸡绝对生长高峰期骨骼肌脂肪代谢的影响选取35d Arbor Acres雄性肉仔鸡,分为DEX组(DEX)、对照组(Control)和采食量配对组(Pair-fed)。DEX组每天皮下注射地塞米松(2.0mg/Kg体重),自由采食和饮水;对照组注射与DEX组相同剂量的生理盐水,自由采食和饮水;采食量配对组注射与DEX组相同剂量的生理盐水,同时饲喂DEX组前一天的采食量。处理3d后发现,饲喂状态下,DEX显著提高循环中脂肪类物质流量和骨骼肌脂肪沉积,上调腿肌糖皮质激素受体(GR),极低密度脂蛋白受体(VLDLR)、LPL、FATP1、H-FABP、L-CPT1、LCAD与AMPKα2mRNA水平,促进胸肌GR、VLDLR、FATP1、H-FABP和LCAD的转录,同时降低了胸肌AMPKα2mRNA水平。而禁食后,DEX对血浆甘油三酯浓度、骨骼肌VLDLR、腿肌LPL、H-FABP、LCAD和AMPKα2mRNA水平均无显著影响,抑制了胸肌LPL、LCAD和AMPKα2mRNA水平,降低了骨骼肌AMPKα磷酸化和CPT1活性,且DEX对骨骼肌脂肪沉积的促进效果减弱。综上所述,DEX促进绝对生长高峰期肉仔鸡骨骼肌脂肪沉积,可能机制为脂肪酸转运率大于其氧化利用。脂肪酸对糖皮质激素调节效应的影响选取31d Arbor Acres雄性肉仔鸡,31-37d分别灌服棕榈酸(PA)、油酸(OA)和对照组(TW)。35d开始每个处理分为地塞米松注射组(DEX,2.0mg/Kg体重)和对照组(SALT)。结果发现,DEX使骨骼肌脂肪沉积增加,饱和脂肪酸可加重DEX效应,而不饱和脂肪酸有缓解作用;DEX导致骨骼肌脂肪酸转运(FATP1)与氧化利用(L-CPT1)平衡紊乱。DEX降低了腿肌AMP/ATP、AMPKα磷酸化以及AMPK活性(22.5%),同时提高了mTOR及其下游调控子p70S6K的磷酸化,而AKT无显著变化,DEX对胸肌相关基因表达无明显影响。本试验结果表明DEX导致AMPK蛋白磷酸化受到抑制而mTOR蛋白磷酸化增强,使脂肪氧化受阻,且mTOR上调是由AMPK激活而与AKT通路无关。糖皮质激素和胰岛素对离体培养的鸡成肌细胞脂肪代谢的影响分离并培养11胚龄鸡成肌细胞,分为对照组(Control),DEX组(DEX),胰岛素组(INS),地塞米松胰岛素共同处理组(DEX+INS)。处理2h后虽无统计学差异,但DEX上调AMPKα2和L-CPT1的转录,下调mTOR的基因表达,而胰岛素下调AMPKα和L-CPT1的mRNA水平。DEX与胰岛素共同作用时下调AMPKα2和L-CPT1,上调mTOR。结果表明,糖皮质激素促进脂肪氧化,而胰岛素则抑制其氧化,两者共存时表现出抑制作用。糖皮质激素和胰岛素调控鸡成肌细胞脂肪代谢的信号通路分离培养11胚龄鸡成肌细胞,分为对照组(Control),DEX组(DEX),AMPK抑制组(CC),胰岛素组(INS),AKT抑制组(LY)。培养12h后发现,DEX使GR、AMPKα2和L-CPT1转录水平显著升高,AMPK抑制剂处理后发现,AMPKα2和L-CPT1mRNA表达均与对照组相比无显著差异,而DEX导致的GRmRNA水平上升不受AMPK抑制剂的影响。相比对照组,DEX抑制了mTOR的转录,AMPK被抑制后,mTORmRNA回升到正常水平。与对照组相比,DEX组的AKT1mRNA无显著变化,而AMPK抑制剂处理提高了AKT1的转录水平。胰岛素处理显著提高了AKT1和mTOR的转录水平,AMPKα2 mRNA水平有降低的趋势,AKT抑制剂处理后,AKT1、mTOR和AMPKα2的mRNA与正常培养的成肌细胞无显著差异。结果表明,AMPK及mTOR信号通路可能参与了糖皮质激素对肌细胞脂肪摄取与氧化的调控过程,不依赖于AKT。胰岛素则可能通过AKT-mTOR及AKT-AMPK-mTOR两条信号通路来实现对肌细胞脂肪酸氧化的调控。综上所述,糖皮质激素水平升高使肉仔鸡机体能量发生动员与重新分配,从生长发育转向脂肪沉积。活体试验结果发现糖皮质激素导致肉仔鸡骨骼肌脂肪沉积增加的机制可能是脂肪酸从头合成增加,血液循环中脂肪类物质流量上升,使骨骼肌细胞内AMP/ATP降低,AMPK活性下降,mTOR信号上调,从而使脂肪氧化能力下降。同时循环中胰岛素水平的升高使AKT转录增加,但与mTOR信号上调无关。体外成肌细胞试验进一步表明,AMPK及mTOR信号通路可能参与了糖皮质激素对肌细胞脂肪摄取与氧化的调控过程,胰岛素可能通过AKT-mTOR及AKT-AMPK-mTOR两条信号通路来抑制脂肪氧化,而两者共同作用时抑制脂肪氧化。
关凤军[3]2007年在《P-糖蛋白170与原发性肾病综合征患儿糖皮质激素耐药的临床病理相关研究》文中指出【研究背景】肾病综合征(Nephrotic Syndrome，NS)在小儿肾脏疾病中发病率仅次于急性肾炎，是小儿时期较为常见的一种肾脏疾病。1990年小儿肾脏病科研协作组调查结果显示，儿童NS占同期泌尿系统疾病住院患儿的21％，而原发性肾病综合征(Primary Nephrotic Syndrome，PNS)约占小儿时期NS的90％。迄今为止，糖皮质激素(glucocorticoid，GC)仍为最基本的治疗药物之一，NS患儿对GC治疗的反应性是决定其疾病转归极为重要的因素。临床研究表明，近80％的NS患儿初发病时对GC敏感，另20％应用足量GC后仍对GC无反应，称为GC耐药或抵抗。另外，随访发现GC敏感NS患儿中，有50％-60％在治疗过程中变为频复发，直至对GC依赖。GC抵抗型患儿病情容易复发或勤复发促进了肾脏病理损害的慢性进展，使最终发展为终末期肾病(end stage renal disease，ESRD)的几率增加，故GC耐药机制一直是研究的热点问题。然而到目前为止，NS患儿对GC治疗抵抗的机制仍不甚明了。经典的与GC耐药有关的发现集中于GC受体(glucocorticoid receptor，GR)分子结构和数量的改变、GR基因多态性、GR两种亚型GRa、GRβ的表达失平衡等方面，而GR的异常影响的是GC与GR结合及结合以后的效应阶段，对GC与GR结合之前阶段的研究知之甚少。近年来，学者们发现多药耐药基因(multidrug resistant 1，MDR1)基因产物P-蛋白170(P-glycoprotein170，P-gp170)参与介导了多种肿瘤、免疫性疾病等的GC耐药。大多研究认为P-gp170是体内广泛存在于细胞膜表面的一种药物转运泵，在药物未与靶受体结合之前即与药物结合，将药物转运出细胞外而造成耐药；另外，P-gp170还可通过改变细胞内环境、下调GC受体、抑制细胞凋亡、影响细胞因子发挥作用等多种功能而介导多种疾病的GC耐药。而目前国内外关于NS患儿P-gp170与GC耐药关系的研究非常有限，依据少数学者的有关研究，NS患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)P-gp170的表达与GC反应性有关；间接的实验证明甾体类固醇激素为P-gp170的底物之一，GC耐药NS患儿PBMC的P-gp170表达高于GC敏感者。但目前NS患者P-gp170介导GC耐药的确切机制及在肾组织的表达情况尚未可知。由于GC的效应主要由GC受体(GR)介导，GR在全身广泛存在，而肾组织也是GC作用的主要靶器官，因而我们推测NS患儿肾脏局部可能也存在P-gp170表达量的异常，而且这种异常可能与GC耐药有关。本研究首次通过检测NS患儿PBMC细胞内地塞米松(Dexamethasone，Dex)浓度与P-gp170表达量并分析二者的关系，以证实NS患儿PBMC胞内P-gp170表达与GC反应性有关，在此基础上，通过观察P-gp170在NS患儿肾组织中的分布、表达变化及其与临床GC疗效的关系，P-gp170表达与病理及临床指标的关系，进一步探讨其在NS患儿GC耐药机制中的作用。【目的】分析GC敏感和耐药NS患儿PBMC胞内Dex浓度变化与细胞膜表面P-gp170表达的相关性，并对有相关者做回归分析，以证实P-gp170可作为GC的药物转运泵在NS患儿GC耐药中发挥作用，并检测比较GC敏感和GC耐药NS患儿肾组织P-gp170mRNA及蛋白的表达，对两者进行肾组织P-gp170表达的差异、定位、与NS复发、病理类型的关系等临床及病理指标的分析，为探讨NS患儿P-gp170介导GC耐药临床的应用提供理论依据。【方法】选用24名初发未应用激素治疗的NS患儿为研究对象，根据随访资料显示将其分成激素敏感(SSNS)与激素耐药SRNS)组，10名健康体检儿童作为正常对照。以外周血单个核细胞为研究的靶细胞，以Dex作用后，培养。分别在0h，12h，24h，36h收获细胞，每个时间点均设空白对照，以反向高效液相色谱法(reverse high performance liquid chromatography，R-HPLC)检测各组培养的不同时间点PBMCs细胞内Dex浓度变化；Wesrern blotting法检测培养的不同时间点PBMC细胞P-gp170的表达；选取96名NS患儿，分为初发未用激素者23例，正规应用半年内无复发者26例及应用一年有反复复发者47例，10名因外伤切除的肾组织为正常对照，微穿刺技术取得肾皮质组织后，常规染色后确定病理类型及计算病理积分；同时以免疫组织化学法检测肾组织P-gp170蛋白表达；原位杂交法检测P-gp170mRNA的表达；【结果】1．NS患儿PBMC内Dex浓度随培养时间的不同而不同，培养时间愈长，细胞内Dex浓度愈高；2．GC敏感患儿PBMC加入Dex前后PBMC的P-gp170表达具有显著性差异，加入Dex后细胞内Dex浓度渐增高，细胞膜P-gp170表达随培养时间的延长而渐降低；GC耐药患儿PBMC加入Dex前后细胞膜P-gp170表达无显著性差异，P＞0.05；3．GC敏感NS患儿PBMC细胞内Dex浓度变化与细胞膜表面P-gp170活性呈显著负相关，回归分析示GC敏感患儿细胞内Dex浓度随P-gp170表达降低逐渐增高；而GC耐药患儿细胞内Dex浓度与P-gp170活性无显著相关；4．免疫组织化学和原位杂交定位显示GC敏感与耐药NS患儿肾组织P-gp170均主要表达于肾小管，肾小球无表达；远端小管表达显著高于远端小管，P＜0.05，mRNA与蛋白的表达基本一致；GC敏感和GC耐药NS患儿肾组织P-gp170的表达具有显著性差异，GC耐药者P-gp170表达量显著高于GC敏感者，P＜0.05；5．肾脏病理积分与肾组织P-gp170的表达有显著相关，病理积分较高者P-gp170表达阳性量高于病理积分低者，P＜0.05；不同病理类型P-gp170的表达有差异，局灶节段硬化型肾病(FSGS)、膜性肾病(MN)和硬化性肾病(SGN)表达较高，微小病变(MCD)和系膜增生型(MsPGN)者表达较低，P＜0.05；6．<6岁组患儿和>6岁组患儿P-gp170的表达无差异，P＞0.05；复发者P-gp170的表达明显高于无复发者，P＜0.05；复发患儿肾组织P-gp170的表达与患儿的24小时尿蛋白定量(三次平均值)呈明显正相关，与尿蛋白转阴天数呈正相关，与首次复发与初发病的间隔的天数呈显著负相关；P-gp170的表达与GC应用总量、总疗程有呈显著相关。【结论】1．健康儿童和NS患儿PBMC均有P-gp170的表达，NS状态下可有P-gp170表达增高，生理和病理状态下P-gp170的表达发挥的作用不完全一致；2．PBMC膜P-gp170表达增高与NS患儿GC耐药有关，P-gp170表达增高介导了一部分NS患儿的GC耐药；3．Dex为P-gp170的作用底物之一，P-gp170参与了Dex类GC药物PBMC膜胞内向胞外的转运；4．应用GC可诱导NS患儿膜P-gp170的表达增高，一部分GC耐药者与GC应用所致P-gp170增高，导致GC耐药；5．NS患儿PBMCP-gp170的表达增高为GC耐药标志之一。6．P-gp170在正常人肾脏组织中即有一定量的表达，表达部位主要见于肾小管细胞膜；7．P-gp170在NS患儿肾组织的表达与肾病病损有关，可结合病理类型和病理损伤程度同时检测肾组织P-gp170来预测不同患儿GC反应性；8．P-gp170的肾组织的表达与GC的用量有关，部分NS患儿耐药机制由GC应用至一定量导致P-gp170的表达增高有关；9．P-gp170肾组织的表达增高与NS活动和复发有关，可作为临床预测预后的指标。
参考文献：
[1]. 烧伤脓毒症骨骼肌蛋白降解增强的机制研究[D]. 申传安. 中国人民解放军军医进修学院. 2003
[2]. 糖皮质激素影响肉仔鸡骨骼肌脂肪代谢的机制研究[D]. 王晓鹃. 山东农业大学. 2011
[3]. P-糖蛋白170与原发性肾病综合征患儿糖皮质激素耐药的临床病理相关研究[D]. 关凤军. 中南大学. 2007